外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用課件

外顯子捕獲

余晗

20171201

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用外顯子是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍會被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。在人類基因中大約有180,000個外顯子，占人類基因組的1%，約30MB。人類基因組的蛋白編碼區(qū)域大約包含85%的致病突變。

外顯子測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢。

對腫瘤基因突變檢測具有顯著意義，因為外顯子測序容易提高深度，可以輕易達(dá)到100X、200X。而因為外顯子捕獲是有偶然性的，對小片段結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異很難檢測。外顯子測序簡介外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用外顯子組包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息序列。外顯子序列捕獲芯片（或溶液）可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)測序直接解析數(shù)據(jù)。

背景介紹外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的絕大部分的疾病相關(guān)變異可發(fā)現(xiàn)常見變異和頻率<5%低頻突變只對基因組的約1%測序，更加經(jīng)濟(jì)、高效人的全基因是3G，如果要把全基因都測一下，一般要平均30x的覆蓋。也就是要90G的數(shù)據(jù)。這樣的測序量，成本大約是一個樣本6萬多元。如果樣本多的話，費(fèi)用上可能負(fù)擔(dān)不起。

而外顯子只占人全部基因序列的1%，而且是最關(guān)鍵的1%。把外顯子全都測了，就相當(dāng)于抓住了問題的主要矛盾。同時測序量大大降低。這就是用外顯子測序來替代全基因重測序的第一個原因。在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測序第二個原因是在做腫瘤測序的時候，腫瘤本身存在著較大異質(zhì)性。腫瘤的基因序列是不穩(wěn)定的，一直在變的，也就是腫瘤的深部、淺部可能其基因序是不一樣的。為了測出各種突變，就需要有較深的測序重度，比如100x、甚至200x的測序深度。這時候外顯子測序就可以做到高的測序覆蓋度，同時費(fèi)用不會太高。

技術(shù)優(yōu)勢外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用劣勢：外顯子測序是全基因重測序的一個較為經(jīng)濟(jì)的替代手段，對研究基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢，但無法

研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等，一般在疾病研究中，會結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序一起研究。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用目前市場主要外顯子捕獲試劑盒SeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0（Roche）SureSelectXTHumanAllExonV6（Agilent）TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit

（Illumina）TruSeq

RapidExome

Library

Prep

Kit（Illumina）外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用四種測序試劑盒比較Nimblegen和Illumina的捕獲試劑盒中的探針是DNA探針，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)；Agilent的捕獲試劑盒是RNA探針，有可能RNA不是很穩(wěn)定。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

Roche

羅氏2008年推出NimbleGen序列捕獲2.1M外顯子組芯片，隨之在2009年底推出的EZ外顯子組序列捕獲能提供液相的工作流程并以DNA液相探針雜交來捕獲目的片段。

SeqCapEZHumanExomeLibrary使用高密度探針的方法，主要是利用雜交和DNA微陣列技術(shù)基因分離原理來捕獲目標(biāo)區(qū)域。產(chǎn)物可以覆蓋20000個以上的基因，超過二百萬個DNA寡核苷酸探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，覆蓋區(qū)域的總大小可以達(dá)到64Mb，編碼區(qū)覆蓋度達(dá)到97%以上，而且檢測靈敏度較高。

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

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外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用LibraryPrepKitPureCaptureBeadKitAdapterKit(Aand/orB)pcrReadyMixHybridizationandWashKitDNACovaris打斷儀DNA真空濃縮儀金屬浴片段大小：180－220bp測序平臺：IlluminaGenomeAnalyzerII、HiSeq或MiSeq測序儀實驗周期：2天

Roche詳細(xì)實驗細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用1.雜交（47℃，16-20h）注意事項：

Roche詳細(xì)實驗細(xì)節(jié)16到20外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用cot1-DNA

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外顯子捕獲效率是什么？外顯子測序過程中要用到雜交過程。在人的染色體上有許多與外顯子有同源性的部分，這些有同源性的部分很可能在雜交過程中也被捕獲下來。所以，測到的序列中，有一部分不是外顯子序列。我們把測序得是外顯子的部分占全部測序序列的比列稱為捕獲效率。

Nimblegen大約是70%Agilent大約是60%Illumina大約是50%

Roche詳細(xì)實驗細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用2.磁珠捕獲及洗脫

洗脫試劑配制--洗捕獲磁珠--孵育捕獲--洗脫非目標(biāo)核酸

Roche詳細(xì)實驗細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用3.pcr擴(kuò)增9-11

Roche詳細(xì)實驗細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用Thanks！外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

AgilentSureSelectXTHumanAllExonV6外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用1SureSelectLibraryPrepKit.2SureSelectTargetEnrichmentKitIndexingHybModuleBox#23HerculaseIIFusionDNAPolymerase4SureSelectTargetEnrichmentKitBox#1片段大小：150-200bp測序平臺：IlluminaHiSeq、MiSeq

實驗周期：2天外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

illuminaIllumina,TruSeqExomeEnrichmentKit是近年來剛推出的一種溶液型的序列捕獲方法，利用雜交選擇分離出人類基因組中的目的外顯子區(qū)域。通過與目標(biāo)區(qū)域特異的生物素標(biāo)記DNA探針雜交，富集目標(biāo)區(qū)域，富集的DNA片段隨后從磁珠上洗脫，并雜交進(jìn)行第二次富集反應(yīng)，從而提高目的片段捕獲的特異性。

而且較其他產(chǎn)品，illumina外顯子捕獲試劑盒價格更低。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用片段大小