外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用課件

外顯子捕獲

余晗

20171201

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用外顯子是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍會(huì)被保存下來(lái)，并可在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。在人類基因中大約有180,000個(gè)外顯子，占人類基因組的1%，約30MB。人類基因組的蛋白編碼區(qū)域大約包含85%的致病突變。

外顯子測(cè)序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因組分析方法。是一種選擇基因組的編碼序列的高效策略，外顯子測(cè)序相對(duì)于基因組重測(cè)序成本較低，對(duì)研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)。

對(duì)腫瘤基因突變檢測(cè)具有顯著意義，因?yàn)橥怙@子測(cè)序容易提高深度，可以輕易達(dá)到100X、200X。而因?yàn)橥怙@子捕獲是有偶然性的，對(duì)小片段結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異很難檢測(cè)。外顯子測(cè)序簡(jiǎn)介外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用外顯子組包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息序列。外顯子序列捕獲芯片（或溶液）可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)測(cè)序直接解析數(shù)據(jù)。

背景介紹外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的絕大部分的疾病相關(guān)變異可發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)變異和頻率<5%低頻突變只對(duì)基因組的約1%測(cè)序，更加經(jīng)濟(jì)、高效人的全基因是3G，如果要把全基因都測(cè)一下，一般要平均30x的覆蓋。也就是要90G的數(shù)據(jù)。這樣的測(cè)序量，成本大約是一個(gè)樣本6萬(wàn)多元。如果樣本多的話，費(fèi)用上可能負(fù)擔(dān)不起。

而外顯子只占人全部基因序列的1%，而且是最關(guān)鍵的1%。把外顯子全都測(cè)了，就相當(dāng)于抓住了問(wèn)題的主要矛盾。同時(shí)測(cè)序量大大降低。這就是用外顯子測(cè)序來(lái)替代全基因重測(cè)序的第一個(gè)原因。在相同預(yù)算情況下，可提供更高深度測(cè)序第二個(gè)原因是在做腫瘤測(cè)序的時(shí)候，腫瘤本身存在著較大異質(zhì)性。腫瘤的基因序列是不穩(wěn)定的，一直在變的，也就是腫瘤的深部、淺部可能其基因序是不一樣的。為了測(cè)出各種突變，就需要有較深的測(cè)序重度，比如100x、甚至200x的測(cè)序深度。這時(shí)候外顯子測(cè)序就可以做到高的測(cè)序覆蓋度，同時(shí)費(fèi)用不會(huì)太高。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用劣勢(shì)：外顯子測(cè)序是全基因重測(cè)序的一個(gè)較為經(jīng)濟(jì)的替代手段，對(duì)研究基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢(shì)，但無(wú)法

研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等，一般在疾病研究中，會(huì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一起研究。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用目前市場(chǎng)主要外顯子捕獲試劑盒SeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0（Roche）SureSelectXTHumanAllExonV6（Agilent）TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit

（Illumina）TruSeq

RapidExome

Library

Prep

Kit（Illumina）外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用四種測(cè)序試劑盒比較Nimblegen和Illumina的捕獲試劑盒中的探針是DNA探針，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)；Agilent的捕獲試劑盒是RNA探針，有可能RNA不是很穩(wěn)定。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

Roche

羅氏2008年推出NimbleGen序列捕獲2.1M外顯子組芯片，隨之在2009年底推出的EZ外顯子組序列捕獲能提供液相的工作流程并以DNA液相探針雜交來(lái)捕獲目的片段。

SeqCapEZHumanExomeLibrary使用高密度探針的方法，主要是利用雜交和DNA微陣列技術(shù)基因分離原理來(lái)捕獲目標(biāo)區(qū)域。產(chǎn)物可以覆蓋20000個(gè)以上的基因，超過(guò)二百萬(wàn)個(gè)DNA寡核苷酸探針捕獲目標(biāo)區(qū)域，覆蓋區(qū)域的總大小可以達(dá)到64Mb，編碼區(qū)覆蓋度達(dá)到97%以上，而且檢測(cè)靈敏度較高。

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用LibraryPrepKitPureCaptureBeadKitAdapterKit(Aand/orB)pcrReadyMixHybridizationandWashKitDNACovaris打斷儀DNA真空濃縮儀金屬浴片段大小：180－220bp測(cè)序平臺(tái)：IlluminaGenomeAnalyzerII、HiSeq或MiSeq測(cè)序儀實(shí)驗(yàn)周期：2天

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用1.雜交（47℃，16-20h）注意事項(xiàng)：

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)16到20外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用cot1-DNA

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

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外顯子捕獲效率是什么？外顯子測(cè)序過(guò)程中要用到雜交過(guò)程。在人的染色體上有許多與外顯子有同源性的部分，這些有同源性的部分很可能在雜交過(guò)程中也被捕獲下來(lái)。所以，測(cè)到的序列中，有一部分不是外顯子序列。我們把測(cè)序得是外顯子的部分占全部測(cè)序序列的比列稱為捕獲效率。

Nimblegen大約是70%Agilent大約是60%Illumina大約是50%

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用2.磁珠捕獲及洗脫

洗脫試劑配制--洗捕獲磁珠--孵育捕獲--洗脫非目標(biāo)核酸

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用3.pcr擴(kuò)增9-11

Roche詳細(xì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用Thanks！外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

AgilentSureSelectXTHumanAllExonV6外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用1SureSelectLibraryPrepKit.2SureSelectTargetEnrichmentKitIndexingHybModuleBox#23HerculaseIIFusionDNAPolymerase4SureSelectTargetEnrichmentKitBox#1片段大小：150-200bp測(cè)序平臺(tái)：IlluminaHiSeq、MiSeq

實(shí)驗(yàn)周期：2天外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用

illuminaIllumina,TruSeqExomeEnrichmentKit是近年來(lái)剛推出的一種溶液型的序列捕獲方法，利用雜交選擇分離出人類基因組中的目的外顯子區(qū)域。通過(guò)與目標(biāo)區(qū)域特異的生物素標(biāo)記DNA探針雜交，富集目標(biāo)區(qū)域，富集的DNA片段隨后從磁珠上洗脫，并雜交進(jìn)行第二次富集反應(yīng)，從而提高目的片段捕獲的特異性。

而且較其他產(chǎn)品，illumina外顯子捕獲試劑盒價(jià)格更低。外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用TruSeq

Exome

Library

Prep

Kit外顯子捕獲具體步驟以及各試劑的作用片段大小