15種鳥類線粒體cyb和co基因序列變異及系統(tǒng)發(fā)生

15種鳥類線粒體cyb和co基因序列變異及系統(tǒng)發(fā)生

鳥科類是現(xiàn)存鳥類中種類最多、發(fā)展地位最高、適應(yīng)性最廣的分類群體（hallingietal.，1997）。傳統(tǒng)的分類方法只根據(jù)形態(tài)和行為特征進(jìn)行分類。然而，由于該群體的形態(tài)和行為特征復(fù)雜，一些群體很難區(qū)分。因此，有必要對(duì)傳統(tǒng)的分子標(biāo)記進(jìn)行新的分子分類方法進(jìn)行補(bǔ)充。在線粒體DNA中,細(xì)胞色素b(Cytochromeb,簡(jiǎn)寫為Cytb)基因已被應(yīng)用于雀形目的亞科及鶇亞科的系統(tǒng)演化關(guān)系和分類地位的研究(姜海英等,2000;潘巧娃等,2006;Seiboldetal.,1996;Sheldonetal.,1999)。線粒體DNA中的細(xì)胞色素C氧化酶亞單元(cytochromeoxidasesubunitⅠ,CoⅠ)基因是DNA條形編碼選用的主要基因之一,DNA條形編碼可利用簡(jiǎn)短的標(biāo)準(zhǔn)化DNA片斷(648bp)對(duì)物種進(jìn)行鑒定(Hajibabaeietal.,2006),因此對(duì)于分類學(xué)家來說是十分有益的工具(SchindelandMiller,2005;肖金花等,2004),已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)、植物的物種鑒定(Hebertetal.,2003,2004),國(guó)內(nèi)尚未見到對(duì)鳥類的相關(guān)報(bào)道。本文通過對(duì)Cytb基因全序列(1143bp)和CoⅠ基因部分序列(1176bp)的各堿基含量、轉(zhuǎn)換與顛換比率、變異位點(diǎn)的數(shù)量及其與總位點(diǎn)的比率、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)的數(shù)量及其與變異位點(diǎn)的比率、堿基替換的飽和度及遺傳距離進(jìn)行了比較分析。在PAUP4.0中使用鄰接法、最大似然法、最大簡(jiǎn)約法以及貝葉斯推論法構(gòu)建了雀形目6科15種鳥類的系統(tǒng)發(fā)生樹,對(duì)兩種分子標(biāo)記所構(gòu)建的各系統(tǒng)發(fā)生樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。在此基礎(chǔ)上對(duì)CoⅠ基因作為鳥類分子標(biāo)記的可行性進(jìn)行了分析,旨在為雀形目鳥類的DNA編碼識(shí)別、分類研究以及探討可能的系統(tǒng)演化關(guān)系提供新的研究手段。1材料和方法1.1鳥類選取及數(shù)據(jù)收集本實(shí)驗(yàn)共使用了24個(gè)樣品,均為2003～2004年從野外采集的肌肉(紫翅椋鳥為血液樣)樣,代表了雀形目6科15種鳥類(表1)。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,大多數(shù)物種選用了2例個(gè)體。此外,有1例個(gè)體和外群的序列來自GenBank。1.2方法1.2.1動(dòng)物基因組的提取取無水乙醇浸泡、-20℃保存的組織樣品30mg,按照上海生工生物技術(shù)有限公司的SK1205動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒中的說明步驟,進(jìn)行總DNA提取。提取過程中均以滅菌濾紙代替樣品作陰性對(duì)照,以檢測(cè)是否有外源DNA的污染。1.2.2引物和pcr擴(kuò)增PCR擴(kuò)增所用引物為CoⅠ基因的通用引物L(fēng)6615(5′-CCTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3′)、H7539(5′-GATGTGAAGTATGCTCGAGTGTCTAC-3′)和H7956(5′-GGGTAGTCCGAGTATCGTCG-3′)(Mirandaetal.,1997;Mindelletal.,1991);擴(kuò)增Cytb基因的引物為L(zhǎng)14731(5′-AATTGCATCCCACTTAATCGA-3′)、H16064(5′-CTTCAATCTTTGGTTTACAAGACC-3′)(Saetreetal.,2001;Sorenson,1999)及本文自行設(shè)計(jì)的引物L(fēng)B1(5′-TACCTGGGTTCCTTCGCCCT-3′),其中H和L分別代表重鏈和輕鏈。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,可特異地?cái)U(kuò)增鳥類線粒體DNA的CoⅠ基因(1176bp)和Cytb基因(1143bp)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50μl,其中含有10×buffer5μl、25mmol/LMgCl225μl、TaqDNA聚合酶0.5U、2mmol/LdNTP5μl、10mol/L的引物各2μl、DNA模板約為100ng。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性4min、95℃變性45s、44～52℃退火60s、72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72℃延伸2min。PCR擴(kuò)增過程中也設(shè)置了空白對(duì)照,以確保實(shí)驗(yàn)過程中不受外源DNA分子的污染。1.2.3凝膠成像儀掃描擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物,首先用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),紫外分析擴(kuò)增產(chǎn)物并用凝膠成像儀掃描。其次對(duì)于擴(kuò)增效果好的樣品,用H.Q.&.Q.凝膠回收試劑盒Ⅱ回收擴(kuò)增產(chǎn)物。最后將回收后的產(chǎn)物再經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),檢測(cè)后效果好的樣品直接送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司,利用ABI3730遺傳分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序。1.3系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)的構(gòu)建測(cè)序結(jié)果用CEXpress軟件進(jìn)行拼接并輔以手工校正,校正結(jié)果首先用ClustalX1.83軟件(Thompsonetal.,1997)進(jìn)行比對(duì),然后在NCBI中用BLAST進(jìn)行相似性搜索,以確保得到的CoⅠ和Cytb基因序列是本研究的目的序列。由于同種個(gè)體之間的序列差異很小(0～0.003),因此大多數(shù)物種選用1例個(gè)體代表該物種來進(jìn)行分析。2例棕背伯勞Laniusschach間的遺傳距離是同種不同個(gè)體間遺傳距離最大的(0.003)物種,2例紫翅椋鳥Sturnusvulgaris分別采自亞洲和歐洲,將以上兩物種的2例個(gè)體均保留了下來,因此文中用17個(gè)樣本代表了雀形目6科15種鳥類。最后使用ClustalX1.83軟件對(duì)確定后的序列進(jìn)行比對(duì)和排序,以科級(jí)階元為單位對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分組,再用MEGA3.0(Kumeretal.,2004)軟件分別計(jì)算比較了兩種標(biāo)記序列的堿基組成和各科之間的遺傳距離,科內(nèi)、種間、種內(nèi)的遺傳距離和不同序列間的堿基變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換與顛換平均比率及各個(gè)堿基的平均含量。此外,根據(jù)外群的選取原則和實(shí)驗(yàn)所擁有的樣本情況,本文選擇了紅喉潛鳥Gaviastellate和短尾圓嘴鹱Pterodromabrevirostris作為外群分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。在重建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系之前,首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)強(qiáng)弱的檢測(cè),以判斷所得序列是否具有系統(tǒng)發(fā)育分析的信號(hào)及強(qiáng)弱,使用PTP(Permutationtailprobability)檢驗(yàn)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。建樹方法采用PAUP4.0(Swofford,2000)中的最大簡(jiǎn)約(Maximumparsimony,MP)法、最大似然(Maximunlikelihood,ML)法及鄰接(Neighborjoining,NJ)法分別構(gòu)建MP樹、ML樹和NJ樹,其中NJ樹和MP樹各分枝的自舉值經(jīng)1000次重復(fù)檢驗(yàn),ML樹采用100次自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗(yàn)。使用MrBayesV3.1(RonquistandHuelsenbeck,2003)軟件構(gòu)建貝葉斯(Bayesian)樹,運(yùn)行500000代,每100代存1次樹,其各分支的置信度通過后驗(yàn)概率來評(píng)價(jià)。2結(jié)果和分析2.1堿基的基因組化和轉(zhuǎn)換編碼基因的基本信息,見表3。云用PAUP4.0軟件對(duì)Cytb和CoⅠ基因間不一致水平進(jìn)行了PHT(Partitionhomogenetytest)檢驗(yàn),表明兩基因水平差異顯著(P=0.001,P<0.01),因此不能將這兩組數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行分析。采用MEGA3.0對(duì)雀形目6科15種鳥類(不含外群)的Cytb和CoⅠ基因序列分別進(jìn)行了分析,計(jì)算出了各科之間的遺傳距離(表2),并分別統(tǒng)計(jì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)換/顛換的平均值。不含外群時(shí),在Cytb基因序列(1143bp)中共有變異位點(diǎn)454個(gè),占總位點(diǎn)數(shù)的39.7%;簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)337個(gè),占變異位點(diǎn)數(shù)的74.2%,占總位點(diǎn)數(shù)的29.5%;轉(zhuǎn)換/顛換是1.492;堿基A、T、C、G的平均含量分別為29.4%、24.5%、32.9%、13.2%。在CoⅠ基因序列(1176bp)中共有變異位點(diǎn)366個(gè),占總位點(diǎn)數(shù)的31.1%;信息簡(jiǎn)約位點(diǎn)303個(gè),占變異位點(diǎn)的82.7%,占總位點(diǎn)數(shù)的25.8%;轉(zhuǎn)換/顛換是1.604;堿基A、T、C、G的平均含量為27.7%、25.5%、29.4%、17.4%。比較以上兩組數(shù)據(jù)后可以看出:1)CoⅠ基因序列的堿基變異百分比略低于Cytb基因,但前者的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占變異位點(diǎn)的百分比略高于后者;2)堿基組成百分比都顯示出G的含量相對(duì)缺乏,C的含量相對(duì)豐富;3)堿基的替換均以轉(zhuǎn)換為主。在以上3個(gè)差異中,后兩個(gè)差異在其它鳥類研究中也有報(bào)道(LovetteandBermingham,2000)。Cytb和CoⅠ基因序列的密碼子第3位點(diǎn)發(fā)生堿基替換的頻率均較高,其中第3位點(diǎn)轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)分別占其發(fā)生總數(shù)的76.2%和89.4%,這是由于密碼子第3位點(diǎn)在進(jìn)化中承擔(dān)的壓力較小,其替換多屬于同義替換,較少引起氨基酸的取代。為了進(jìn)一步估計(jì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集堿基替換的飽和程度,以未校正的遺傳距離為橫坐標(biāo)、顛換和轉(zhuǎn)換為縱坐標(biāo)做了飽和度分析散點(diǎn)圖(圖1～2)。由圖1～2可以看出,Cytb和CoⅠ基因序列的轉(zhuǎn)換數(shù)明顯高于顛換數(shù);Cytb和CoⅠ基因序列間的遺傳距離分別相對(duì)集中在0.15～0.18和0.12～0.16之間;除CoⅠ基因序列顛換外,Cytb和CoⅠ基因序列的替換數(shù)在達(dá)到最大值后仍呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì),即兩者的堿基替換均未達(dá)到飽和狀態(tài)。2.2cybt和co基因序列的遺傳距離為了進(jìn)一步分析CoⅠ基因在鳥類物種鑒定方面的可行性,本文將椋鳥科的紫翅椋鳥分為一組、椋鳥科其它鳥類分為另一組,伯勞科的棕背伯勞與紅背伯勞各為一組。在MEGA3.0中分別計(jì)算了紫翅椋鳥、棕背伯勞的組內(nèi)(種內(nèi))和組間(種間)的遺傳距離(表3)。由表3可知,Cytb和CoⅠ基因序列在棕背伯勞與紅背伯勞之間的遺傳距離為分別0.075、0.065,棕背伯勞種內(nèi)的遺傳距離為0.001、0.003。Cytb和CoⅠ基因序列分別在紫翅椋鳥與椋鳥科其它物種間的遺傳距離為0.099、0.096,紫翅椋鳥種內(nèi)的遺傳距離為0.018、0.014。除棕背伯勞種內(nèi)的遺傳距離外,由Cytb基因計(jì)算出的各遺傳距離均比由CoⅠ基因計(jì)算出的大,即Cytb基因序列在種內(nèi)、種間的差異比CoⅠ基因的更為明顯。由Cytb和CoⅠ基因序列分別計(jì)算出的椋鳥科種間、種內(nèi)遺傳距離的比值為5.50、6.86,說明CoⅠ基因在種間、種內(nèi)遺傳距離的比值較Cytb基因的大。2.3不同cybt基因構(gòu)建的層析成分模型在PAUP4.0中,對(duì)Cytb和CoⅠ基因的兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行了PTP檢驗(yàn),結(jié)果P值為0.0001,即表示能找到與限制樹(Constrainttree)一樣短或比其更短的樹的概率只有0.0001,表明數(shù)據(jù)集均具有非常顯著的系統(tǒng)發(fā)育信息,而不是隨機(jī)數(shù)據(jù)。同時(shí),還對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行了堿基組成偏向性的χ2檢驗(yàn),結(jié)果顯示數(shù)據(jù)組的堿基組成均具有偏向性,因此,在構(gòu)建NJ樹時(shí)對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集都進(jìn)行了Logdet轉(zhuǎn)換。當(dāng)轉(zhuǎn)換/顛換小于2.0時(shí),一般認(rèn)為該基因序列的突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài),受進(jìn)化噪音影響的可能性較大,重建系統(tǒng)發(fā)生樹時(shí)需要進(jìn)行特別的加權(quán)(KnightandMindell,1993)。本文中Cytb和CoⅠ兩基因序列的轉(zhuǎn)換/顛換分別約為1.5和1.6,均小于臨界值2.0,所以在最大簡(jiǎn)約法分析時(shí)根據(jù)Kimura雙參數(shù)估計(jì)轉(zhuǎn)換/顛換,對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行了顛換/轉(zhuǎn)換加權(quán)(R值分別為1.5和1.6)和密碼子加權(quán)(密碼子第1、2、3位點(diǎn)分別賦予2、4、1,2、6、1的權(quán)值),MP樹各參數(shù)見表4。構(gòu)建ML樹時(shí),Cytb和CoⅠ基因選用的模型分別來自Modeltest3.06中機(jī)選產(chǎn)生的最佳核苷酸替換模型(TVM+I+G)和(GTR+I+G),模型各參數(shù)見表5。從圖3可以看出,基于Cytb和CoⅠ基因兩組數(shù)據(jù)集并采用相同方法所構(gòu)建的系統(tǒng)樹中,科級(jí)階元各分支的構(gòu)成是基本相似的,但也存在著一定的差異。具體來說,用Cytb基因構(gòu)建的NJ樹(圖3-A),首先分化出黃鸝科,接著平行的分化出卷尾科、鴉科及伯勞科的分支和椋鳥科、河烏科的分支,其中卷尾科和鴉科相聚后再與伯勞科聚為一支;用CoⅠ基因構(gòu)建NJ樹(圖3-B),卷尾科的分支與鴉科和伯勞科形成的分支、黃鸝科和河烏科相聚后與椋鳥科形成的分支構(gòu)成并列的3個(gè)支系?；贑ytb基因構(gòu)建的密碼子加權(quán)、顛換/轉(zhuǎn)換加權(quán)MP樹的科級(jí)分支基本相同,卷尾科、鴉科、黃鸝科3個(gè)支系和伯勞科、河烏科與椋鳥科依次形成的支系構(gòu)成4個(gè)并列支系;基于CoⅠ基因構(gòu)建的密碼子加權(quán)MP樹、顛換/轉(zhuǎn)換加權(quán)MP樹、ML樹(圖3-D),各科的分支關(guān)系與用CoⅠ基因構(gòu)建的NJ樹各科分支關(guān)系完全相同?；贑ytb基因構(gòu)建的ML樹(圖3-C)、Bayesian樹各科的聚類關(guān)系完全相同,依次分化出黃鸝科、卷尾科、鴉科、伯勞科、河烏科和椋鳥科;用CoⅠ基因構(gòu)建的Bayesian樹(圖3-E)中內(nèi)群分為2大支系,其各科的分支關(guān)系與圖3-B的相似,只是卷尾科和黃鸝科、河烏科和椋鳥科分別形成的支系再聚為一支。此外,在以上幾類系統(tǒng)發(fā)生樹的基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建了Cytb和CoⅠ基因兩個(gè)數(shù)據(jù)集的50%合一樹(圖3-F),在基于Cytb構(gòu)建的各系統(tǒng)樹的合一樹中,各科的聚類關(guān)系與圖3-C的相似,只是黃鸝科較其它幾科先分化出來;在基于CoⅠ構(gòu)建的各系統(tǒng)樹的合一樹中,各科的聚類關(guān)系與圖3-B中的完全相同。從以上分析可見,由Cytb和CoⅠ基因構(gòu)建的各科系統(tǒng)發(fā)生樹對(duì)雀形目科級(jí)階元間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的解析盡管存在一定差異,但基于CoⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹中科級(jí)階元的聚類關(guān)系比Cytb的穩(wěn)定。用Cytb和CoⅠ基因兩組數(shù)據(jù)所構(gòu)建的各系統(tǒng)樹中,椋鳥科7種鳥類首先分化出紫翅椋鳥,接著分化出并列的2個(gè)支系:第1支由互為姐妹群的黑領(lǐng)椋鳥和北椋鳥組成,第2支系由灰背椋鳥、灰椋鳥、八哥和絲光椋鳥組成,其中第2支系內(nèi)依次分化出灰背椋鳥、灰椋鳥、八哥和絲光椋鳥。由此可見,基于Cytb和CoⅠ基因分別所構(gòu)建的系統(tǒng)樹,對(duì)椋鳥科7種鳥類的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系得到了一致的解析結(jié)果,兩種分子標(biāo)記均能很好的解析科內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。3co基因?qū)θ感文课锓N鑒定的影響肖金花等(2004)認(rèn)為,CoⅠ基因自身既有足夠的變異位點(diǎn)、容易被擴(kuò)增,又有蛋白編碼基因所共有的特點(diǎn)(即密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響,可以自由變異,而且其DNA序列本身很少有插入和缺失)。本文分析了內(nèi)群15種鳥類的CoⅠ基因序列,表明其有變異位點(diǎn)366個(gè),占總位點(diǎn)數(shù)的31.1%;信息簡(jiǎn)約位點(diǎn)303個(gè),占變異位點(diǎn)的82.7%,而且在序列中沒有發(fā)現(xiàn)插入和缺失,該結(jié)果說明了CoⅠ基因能夠?yàn)橹亟B類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供足夠的信息簡(jiǎn)約位點(diǎn)。此外,StoeckleandHebert(2004)在研究了北美130種鳥類CoⅠ基因序列(648bp)后發(fā)現(xiàn),這些鳥類的種間差異是種內(nèi)差異的18倍。本研究分別分析了伯勞科2種3個(gè)樣本和椋鳥屬6種7個(gè)樣本的CoⅠ基因(1176bp)序列后表明,棕背伯勞的種內(nèi)遺傳距離為0.3%,它與紅背伯勞之間的遺傳距離平均為6.5%,即種間的遺傳距離是種內(nèi)的22倍;同時(shí)紫翅椋鳥種內(nèi)的遺傳距離為1.4%,而它與椋鳥屬其它種類間的遺傳距離為9.6%,即種間的遺傳距離是種內(nèi)的6.9倍;以上分析結(jié)果進(jìn)一步說明了CoⅠ基因序列在雀形目的種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離。KrajewskiandFetzner(1994)和Xiangyuetal.(2000)均認(rèn)為,同屬鳥類種間的Cytb基因的遺傳距離大于1.0%。本文所用的CoⅠ和Cytb基因在伯勞屬種間的遺傳距