代謝組學(xué)在中醫(yī)中藥研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在中醫(yī)中藥研究中的應(yīng)用

綜合征理論在中醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用。這是中醫(yī)辨證診斷和治療的精髓，與中醫(yī)的基礎(chǔ)和臨床相結(jié)合，對于闡明中醫(yī)的科學(xué)內(nèi)容，促進中醫(yī)各學(xué)科的發(fā)展具有重要意義。國家自然科學(xué)基金委指出:“證候與疾病和方劑的相關(guān)性理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論建立的最根本問題,并列為中醫(yī)藥重大研究計劃”,沈自尹院士把“證”定義為“是一種綜合性功能態(tài),有具體的功能網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控中心”,21世紀(jì)生命科學(xué)的發(fā)展趨勢是重視整體性和復(fù)雜性研究。代謝組學(xué)具有整體性和系統(tǒng)性的特點,它與中醫(yī)學(xué)在方法論原理上具有統(tǒng)一性,即兩者都把整體性、系統(tǒng)性作為認(rèn)識的出發(fā)點,故可以把代謝組的理論、方法和技術(shù)作為研究中醫(yī)證本質(zhì)的出發(fā)點和切入點。代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)證的研究相結(jié)合,可把證的研究再次推向科學(xué)發(fā)展的前沿,成為中醫(yī)現(xiàn)代化最重要的研究方向之一和有效突破口之一。代謝組學(xué)的研究通過對某一病證相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷,能夠幫助人們更好地理解病變過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和狀況。同時,代謝組學(xué)還有助于疾病的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)而達(dá)到輔助臨床診斷的目的。代謝組學(xué)通過高能量的分子化合物結(jié)合模式分析的方式,是一項比較適合證候?qū)W研究的技術(shù)手段。中醫(yī)病證引起代謝物組的共性分析和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn),將探索出中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究的新方法與新途徑,將證的研究可以和處于科學(xué)前沿、綜合程度很強的系統(tǒng)生物學(xué)方法相結(jié)合,同時也是生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)相結(jié)合。這將把“證”的研究再次推向科學(xué)發(fā)展的前沿,成為中醫(yī)現(xiàn)代化最重要的研究方向之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,近年有人從神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)方面來探討證的實質(zhì),對中醫(yī)證候進行了各種客觀指標(biāo)的研究,取得了一定的成果。然而,這些研究都只反映了部分已知基因表達(dá)產(chǎn)物(受體、酶、細(xì)胞因子以及肽類等)的改變。其后基因組學(xué)和蛋白組學(xué)由于難于和生物學(xué)靶位點對位,以及不能動態(tài)、實時地反映整體信息,尚未能揭示證的實質(zhì)。而代謝組學(xué)采用的是“自上而下”式的研究方法,是對代謝的終端產(chǎn)物進行多元化綜合分析,從整體上展示生物體內(nèi)在的變化狀態(tài),避免了以往采用單一指標(biāo)或少數(shù)幾個指標(biāo)研究某種病理和生理變化,這與中醫(yī)學(xué)的整體觀念十分吻合。著名學(xué)者GermanJB曾在他的文章中寫到:“基因組學(xué)反映了什么是可以發(fā)生的,轉(zhuǎn)錄組學(xué)反映的是將要發(fā)生的,蛋白質(zhì)組學(xué)指出了什么是賴以發(fā)生的,只有代謝組學(xué)才真正反映業(yè)已發(fā)生的”。而且證候物質(zhì)基礎(chǔ)不一定會集中在某一臟器,而應(yīng)是一組相關(guān)物質(zhì),非單一特異性物質(zhì),有“集群”和“組”的特征,故證本質(zhì)的研究歸根結(jié)底也是探尋物質(zhì)基礎(chǔ)群的研究。證候本質(zhì)研究的目標(biāo)是尋找和確定中醫(yī)證的客觀檢測指標(biāo),對證進行定量的表達(dá),借此對疾病作出定量的證的診斷。反映中醫(yī)證候規(guī)律的“物質(zhì)基礎(chǔ)”將可能是“組”、“群”、“譜”的集成形式。而代謝組學(xué)正具備反映和解決這些問題的“組”、“群”、“譜”集成的分析功能,它通過檢測和分析不同證候患者的尿液或血液中的代謝成分,幫助人們更好地理解證候形成過程及機體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況,更準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)。代謝組學(xué)能夠提升中醫(yī)證的科學(xué)價值,重要的意義在于其可能在闡明中醫(yī)證本質(zhì)方面蘊涵著巨大潛力。從古至今,臨床中醫(yī)證型主要是靠醫(yī)生主觀經(jīng)驗判定,很難標(biāo)準(zhǔn)量化。臨床科研多采用流行病學(xué)的方法,通過望聞問切,將四診所獲得的信息進行整理,研究其中一些普遍性的規(guī)律建立診斷標(biāo)準(zhǔn)。由于這種診斷標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性很大程度上依賴醫(yī)生的臨床經(jīng)驗,在一定程度上影響了所制定的“證候標(biāo)準(zhǔn)”的可靠性和準(zhǔn)確性。代謝組學(xué)技術(shù)可以提高診斷的科學(xué)化、定量化,避免了人為主觀因素的干擾和不確定性,為證候標(biāo)準(zhǔn)化的研究提供了一種可行的方法。可以讓我們從多個層次理解闡明并最終詮釋中醫(yī)證的科學(xué)內(nèi)涵?，F(xiàn)將近年來代謝組學(xué)在中醫(yī)證本質(zhì)研究中的具體應(yīng)用概述如下。生物標(biāo)志物特征徐舒等建立并驗證“肝郁證”大鼠模型,在此基礎(chǔ)上運用代謝組學(xué)的方法(1H-NMR)研究“肝郁證”代謝組學(xué)特征及生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)模型組血漿中葡萄糖和肌酸的含量明顯偏高,而3-羥基丁酸(3-HB)、谷氨酰胺(Gln)、磷脂酰膽堿(PtdCho)、磷酸膽堿(PCho)和不飽和脂肪酸(UFA)的含量明顯偏低,這些差異小分子物質(zhì)構(gòu)成“肝郁證”的代謝標(biāo)志物群,成為肝郁證代謝水平的物質(zhì)基礎(chǔ),有助于闡釋肝郁證的本質(zhì)。中醫(yī)證候?qū)W的提出羅和古等研究慢性束縛應(yīng)激大鼠(肝郁脾虛模型)的血漿代謝表型改變,采用核磁共振波譜儀檢測并進行主成分分析,開展中醫(yī)證候?qū)W的研究,試圖通過對慢性束縛應(yīng)激大鼠代謝物組的共性分析和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn),尋找肝郁脾虛證候的生物學(xué)本質(zhì)。發(fā)現(xiàn)醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44ppm的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物做進一步的研究。有機溶劑和藥物代謝華何與等對冠心病心絞痛血瘀證(氣滯血瘀證、心血瘀阻證、氣虛血瘀證)患者的血漿樣本進行氫核磁共振(1H-NMR)檢測。通過偏最小二乘判別分析方法研究各組之間的血漿代謝產(chǎn)物譜差異。與健康人相比,心絞痛血瘀證患者血漿檸檬酸、琥珀酸、葡萄糖、乙酰糖蛋白、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、3-羥基丁酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量較高,高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、蘇氨酸、組氨酸含量較低。血漿1H-NMR代謝譜差異能明顯區(qū)分健康人與心絞痛血瘀證患者。能在一定程度上區(qū)分氣虛血瘀證與其他血瘀證。與其他血瘀證相比,氣虛血瘀證組血漿檸檬酸、3-羥基丁酸、丙酮、氧化三甲胺含量較高,葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量較低。李林等利用基于核磁共振氫譜的組學(xué)分析方法研究氣虛血瘀證大鼠對比正常大鼠尿液的組成變化,發(fā)現(xiàn)病變大鼠尿液中甲酸(formate)、肌氨酸酐(creatinine)、α-酮戊二酸(2-oxoglutarate/2-OG)、檸檬酸(citrate)、?；撬?taurine)、氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide/TMAO)、琥珀酸(succinate)、馬尿酸(hippurate)等成分的含量發(fā)生了變化,為進一步提示氣虛血瘀證的產(chǎn)生機制和病癥治療提供了證據(jù)。張紅栓等利用1H-NMR方法研究冠心病心絞痛痰濁證、血瘀證患者的尿液代謝組學(xué)特征。結(jié)果顯示冠心病心絞痛痰濁證患者與冠心病心絞痛血瘀證患者能夠被區(qū)分,兩組尿液樣本之間的代謝物含量存在明顯差異。冠心病心絞痛痰濁證組尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸、葡萄糖、3-羥基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、馬尿酸的含量高于血瘀證組,而膽汁酸、組氨酸的含量低于血瘀證組。簡維雄等[20運用氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法進行血漿代謝組學(xué)研究,對心血瘀阻證大鼠血漿的代謝產(chǎn)物、血液流變學(xué)指標(biāo)的變化進行分析識別,發(fā)生改變的乳酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘋果酸、硬脂酸、花生四烯酸、果糖等8種代謝物與反映“血瘀”病理的血液流變學(xué)指標(biāo)的改變具有一致性,有可能作為心血瘀阻證代謝性生物標(biāo)志物。不同時點模型大鼠代謝譜劉衛(wèi)紅等探討了痰瘀證候的動態(tài)演變、時相特點和由痰致瘀在代謝方面的變化,采用核磁共振波譜儀檢測并進行主成分分析,結(jié)果顯示各組大鼠代謝譜亦不相同。隨著造模時間的延長,不同時點模型組大鼠的代謝譜亦不相同,這與同時檢測的血脂、血液流變學(xué)結(jié)果相一致。模型組大鼠血漿中差異性代謝物有以下物質(zhì):乳酸、丙氨酸、乙酸、N-乙酰糖蛋白-NCH3、O-乙酰糖蛋白-OCH3、氧化三甲胺(TMAO)、磷脂酰膽堿、葡萄糖、膽固醇、VLDL(-CH3)、LDL/HDL(-CH3)、VLDL(CH2)n、LDL/HDL-(CH2)n、不飽和脂肪酸,表明高脂血癥痰瘀演變過程中存在著非常明顯的代謝產(chǎn)物,闡釋了中醫(yī)痰瘀證候的生物學(xué)本質(zhì)。慢性心力衰竭和腎衰患者高校代謝物質(zhì)代謝分析鄭海生等通過GC-MS聯(lián)用及模式識別為主的代謝組學(xué)方法,研究慢性心力衰竭腎陽虛證患者的代謝模式。研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭腎陽虛證患者、非腎陽虛證患者和正常人具有不同的代謝模式,以GC-MS為技術(shù)特點的代謝組學(xué)研究方法能將三者區(qū)分。陶秀梅利用氯甲酸乙酯(ECF)衍生化,GC-MS方法測定慢性心衰和腎衰患者尿液的代謝物組,獲得原始代謝圖譜信息,然后通過多維統(tǒng)計,確定與不同生理病理狀態(tài)密切相關(guān)的有顯著特征的代謝物。與慢性心衰“腎陽虛”密切相關(guān)的代謝物范圍廣泛,主要包括氨基酸、脂肪酸、胺類。涉及到多條代謝通路,如脂肪酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝和兒茶酚胺生物合成。慢性腎衰“腎陽虛”密切相關(guān)的代謝物有丙氨酸、檸檬酸、5-羥色胺、酪氨酸、十六烷酸、油酸、亞油酸。涉及到的代謝通路有氨基酸代謝、TCA循環(huán)、色氨酸代謝、兒茶酚胺代謝、脂肪酸代謝等。董飛俠從尿液代謝組學(xué)的角度研究慢性腎?、笃谀I陽虛證患者代謝物質(zhì)的變化,能夠很好地區(qū)分陽虛與非陽虛的差異性。差異性物質(zhì)的關(guān)鍵代謝成分分別是丙氨酸、氨基丙二酸二乙酯、脯氨酸、檸檬酸、馬尿酸和組胺等物質(zhì)。糖尿病腎陰虛證相關(guān)生物標(biāo)記物識別孫永寧等運用GC-MS方法研究糖尿病腎陰虛證大鼠模型尿液的代謝表型變化,證實大鼠的尿液代謝譜與糖尿病腎陰虛證密切相關(guān),識別了與糖尿病腎陰虛證相關(guān)的生物標(biāo)記物有:甘氨酸、琥珀酸、十六烷酸、膽固醇。性私家車網(wǎng)絡(luò)對性私家車網(wǎng)絡(luò)的影響童寧寧應(yīng)用代謝組學(xué)研究中醫(yī)脾臟濕熱蘊脾證唾液代謝組的變化,從唾液代謝組學(xué)角度探討濕熱蘊脾證的內(nèi)涵,找到慢性胃炎濕熱蘊脾證的特異性標(biāo)志物有白氨酸、苯丙氨酸、丙酸鹽、甘氨酸、精氨酸、羥丁氨酸、乙酰基糖、異丁酸、蔗糖、正丁酸,從現(xiàn)代科學(xué)的角度論證了脾在液為涎的科學(xué)內(nèi)涵。鄭麗紅應(yīng)用核磁共振(NMR)等方法研究濕熱蘊脾證唾液的代謝特征,找到潛在標(biāo)志物乳酸(1.34ppm)、N-乙酰蛋白(2.1ppm)、乙醇(1.18ppm)。存在的非定常性化合物初燕運用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析脾氣虛患者血漿中小分子代謝組成分,發(fā)現(xiàn)carnitin(8:0)、GPCho(38:6)和分子量為341.282的未知化合物可能為脾氣虛證的潛在標(biāo)志物。張麗運用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析脾氣虛患者尿液中小分子代謝組成分,發(fā)現(xiàn)了一些脾氣虛證的潛在標(biāo)記物,如leucylproline和苯乙酰谷氨酰胺。這些試驗有助于脾氣虛證臨床微觀指標(biāo)的診斷,對中醫(yī)脾氣虛證的量化起了一定的規(guī)范作用。代謝組學(xué)有助于研究中醫(yī)病證,為中醫(yī)診斷和診斷提供了契機,促進了中醫(yī)證