葡萄籽提取液大孔樹脂洗脫過程多酚含量的測定

葡萄籽提取液大孔樹脂洗脫過程多酚含量的測定

1篩選、純化和分析方法葡萄籽富含黃酮類、花色糖、原花色素和原花青素等多酚類物質(zhì)。葡萄籽提取物在食品、醫(yī)藥、化妝品以及保健品等方面應(yīng)用日益廣泛,已被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為保健品原料。葡萄籽粗提物中含有多糖、蛋白等多種雜質(zhì),需要進(jìn)一步分離純化。近年來,大孔吸附樹脂吸附法常用于葡萄籽或者其他天然植物中的多酚類化合物的富集純化。在大孔樹脂純化過程中,洗脫液收集的起點(diǎn)和終點(diǎn)的判斷對產(chǎn)品的收率及純度影響較大。實(shí)際生產(chǎn)中,常依據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷收集起點(diǎn)和終點(diǎn),或采用離線分析方法,不能準(zhǔn)確及時(shí)監(jiān)測目標(biāo)成分的變化,導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不高,或批次間差異較大。近紅外光譜法主要反映有機(jī)物分子中CH,NH和OH等含氫集團(tuán)的倍頻與合頻振動(dòng),與多酚類物質(zhì)的常規(guī)定量檢測方法(比色法和高效液相法)相比,基本無需樣品前處理,適用于生產(chǎn)過程在線監(jiān)測分析。本研究采用近紅外光譜技術(shù)監(jiān)測大孔樹脂純化過程中葡萄籽多酚含量動(dòng)態(tài)變化,以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程在線檢測。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器和設(shè)備ANTARIS近紅外光譜儀(美國Thermo公司),配液體透射檢測器,2mm內(nèi)徑石英比色皿;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);FA2004電子天平(上海越平科學(xué)儀器公司)。葡萄籽(浙江天鼎有限公司);福林-酚試劑購自中國藥品生物制品檢定所;沒食子酸對照品(純度≥98%,批號:120563-200412)和AB-8大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠);95%乙醇(藥用級)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1樹脂層的預(yù)處理在吸附柱(400mm×25mm)內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹脂體積0.4～0.5倍的95%乙醇,然后將新樹脂裝入柱中,柱體積為100mL,浸泡24h,用200mL95%乙醇以200mL/h的流速通過樹脂層,并浸泡4～5h;用乙醇以200mL/h的流速通過樹脂層,洗至流出液加水不呈白色渾濁,并用水以同樣流速洗凈乙醇。2.2.2柱凈化、洗脫等樣本的收集取適量葡萄籽,加入6倍量55%乙醇,80℃溫浸提取,提取3次,每次45min,濾過,合并提取液,減壓回收乙醇至無醇味,加約3倍量45℃的水,室溫靜置24h,以3000r/min離心15min,取上清液備用。將制備的提取液過大孔樹脂柱,先以水洗去雜質(zhì),再用40%乙醇以20mL/h的速度洗脫,在洗脫過程中每隔一段時(shí)間收集洗脫液樣本。4根樹脂柱平行操作,每根柱子收集30個(gè)樣本,共得到120個(gè)樣本。圖1為其中一根樹脂洗脫過程多酚濃度變化曲線(Folin-Ciocalteus比色法測定)。2.2.3實(shí)驗(yàn)樣品和方法采集洗脫過程樣品的透射光譜,光譜掃描范圍4000～10000cm-1,掃描次數(shù)為32次,分辨率為8cm-1,液體樣品池為2mm光程的石英比色皿。實(shí)驗(yàn)采用空氣為參比進(jìn)行光譜采集,測量時(shí)環(huán)境溫度為20℃,相對濕度為40%。洗脫過程采集的120張樣品的原始近紅外光譜見圖2。2.2.4驗(yàn)證集數(shù)據(jù)分析在適宜的光譜預(yù)處理基礎(chǔ)上,選擇合適的波段,運(yùn)用偏最小二乘法(PLS)建立近紅外光譜的多元校正模型。以交叉驗(yàn)證誤差均方根(RMSECV)為評價(jià)指標(biāo),對校正集樣本考察校正集誤差均方根(RMSEC),對驗(yàn)證集樣本考察驗(yàn)證集預(yù)測誤差均方根(RMSEP),同時(shí)用校正集和驗(yàn)證集相對偏差(RSEC)和(RSEP)分別考察模型校正集和驗(yàn)證集相對偏差值。所有數(shù)據(jù)處理采用TQAnalyst7.2軟件。2.2.5福林-酚試劑法移取0.104g/L沒食子酸對照品液0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mL,置10mL容量瓶中,分別加水至約6mL,搖勻,各加入福林-酚試劑0.5mL、15%Na2CO32mL,用水定容至10mL,搖勻,反應(yīng)2h。以相應(yīng)試劑為空白,在760nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度C和吸光度A做回歸分析,得到線性回歸方程為A=9.52C+0.0610,r=0.9995。根據(jù)樣品的濃度取0.5或1.0mL用于定量測定。3結(jié)果與分析3.1異常光譜的判別由于光譜儀本身的誤差,操作誤差、波長的漂移和測量環(huán)境的變化等原因,可能引起樣品近紅外光譜出現(xiàn)異常,從而降低模型的精度。本實(shí)驗(yàn)采用樣品杠桿值、學(xué)生殘差和樣品的馬氏距離判別異常光譜。圖3為120個(gè)樣本光譜的馬氏距離分布圖,樣品集馬氏距離的平均值為0.94,閾值為1.50,其中最后的8個(gè)樣本光譜馬氏距離超出閾值,視為異常樣品。圖4有7個(gè)樣本相對于其它樣本較為離群,其對應(yīng)的杠桿值和學(xué)生殘差相對值較高。綜合結(jié)果,5個(gè)樣本的馬氏距離超出閾值,且其杠桿值和學(xué)生殘差值高,最終將這5個(gè)樣品剔除。3.2特征信息預(yù)處理在近紅外透射光譜的采集過程中,溫度、濕度等變化會引起光譜基線的偏移。為了有效提取特征信息,需對光譜進(jìn)行預(yù)處理,選出最有效的光譜區(qū)域。本研究通過交互驗(yàn)證法比較了不同預(yù)處理方法對模型性能的影響。由表1可見,采用Savitzky-Golay二階導(dǎo)數(shù)平滑濾波處理,建模效果比較理想(RMSECV值最小,且模型相關(guān)系數(shù)也較高)。3.3savitcity-gola常用的模型雖然PLS法允許全光譜信息建模,但如果建模波段過寬,必然包含大量冗余信息,波段選擇有利于提高模型預(yù)測精度。經(jīng)過二階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay平滑處理后,在7500～6500cm-1,5500～6200cm-1和4200～4600cm-1區(qū)間都存在較明顯的波段。本實(shí)驗(yàn)分別考察了這3個(gè)波段以及相互組合對所建模型性能的影響,結(jié)果見表2。從表2可見,采用5500～6200cm-1所建模型性能最佳。3.4葡萄籽原花青素總多酚洗脫過程近紅外定量校正模型的建立將其中3根柱子的洗脫樣品的檢測值作為校正集,采用Savitzky-Golay二階導(dǎo)數(shù)平滑處理,在5500～6200cm-1波段范圍內(nèi),用PLS法建立葡萄籽原花青素總多酚洗脫過程的近紅外定量校正模型(見圖5a)。從圖5a可見,驗(yàn)證集的預(yù)測值與比色法測定值之間相關(guān)性良好,測量結(jié)果趨于一致。校正模型采用9個(gè)主因子(見表2),相關(guān)系數(shù)R2為0.9995,RMSEC為0.713,RSEC為2.39%。3.5外預(yù)測值與比色法測定值的相關(guān)關(guān)系將建立的模型對第4次實(shí)驗(yàn)樣品中葡萄籽