代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是后基因時(shí)代的一門新的“分子數(shù)學(xué)”學(xué)科。它的研究中心在于定量地測(cè)定由病理生理刺激或基因變異誘導(dǎo)的與時(shí)間相關(guān)的多參數(shù)生物體代謝應(yīng)答,并利用模式識(shí)別(PatternRecognition)將這種應(yīng)答與體內(nèi)生物學(xué)事件關(guān)聯(lián),定位事件發(fā)生的靶器官和位點(diǎn),確定生物標(biāo)記物。自1999年代謝組學(xué)的概念提出以來,它在藥物毒理研究、疾病診斷、系統(tǒng)生物學(xué)研究等諸多領(lǐng)域里的應(yīng)用日益深入。在代謝組學(xué)的溯源中常依據(jù)研究對(duì)象和主要技術(shù)手段的不同將代謝組學(xué)區(qū)分為Metabolomics和Metabonomics,二者分別由Metabolome、Metabonome演化而來,前者是由Fiehn等在以擬南芥為模型植物,研究植物生理代謝網(wǎng)絡(luò)時(shí)提出的,它的技術(shù)手段主要是GC-MS,同時(shí)兼用NMR;后者由Nicholson在長(zhǎng)期研究生物體液的基礎(chǔ)上率先提出,主要基于NMR方法分析動(dòng)物體的代謝過程,但隨著LC-MS技術(shù)的長(zhǎng)足進(jìn)步,HPLC-MS/MS(或者UPLC-MS/MS)技術(shù)在Metabonomics研究中的作用逐漸增強(qiáng)。生物體受外源性物質(zhì)刺激或基因變異所導(dǎo)致的病理變化過程中,必然影響生物代謝網(wǎng)絡(luò),使得細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)的種類、濃度或相對(duì)比例發(fā)生改變,這種改變最終體現(xiàn)在血漿、尿液等生物體液中小分子集合輪廓的改變上,利用多種譜學(xué)技術(shù)建立代謝物指紋圖譜來表征這種改變,并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法挖掘這些譜圖間隱含的信息,從而確定生物標(biāo)記物,揭示外源性物質(zhì)所誘導(dǎo)的生物學(xué)事件發(fā)生的靶器官、位點(diǎn)和強(qiáng)弱程度?；诖?代謝組學(xué)的研究通常涵蓋以下幾個(gè)層次:(1)代謝靶標(biāo)分析(MetabolicTargetAnalysis),有目的地選擇某一組具有相似化學(xué)屬性的小分子類群,研究其在代謝應(yīng)答中的變化,并與既知的生物途徑關(guān)聯(lián),研究得出外源性物質(zhì)或病理狀態(tài)對(duì)這一生物途徑的效應(yīng);(2)代謝輪廓分析(MetabolicProfilingAnalysis),與靶點(diǎn)分析比較,它的研究對(duì)象更加廣泛,著眼于整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中的一些關(guān)鍵信息節(jié)點(diǎn);(3)代謝指紋圖譜分析(MetabolicFingerprintAnalysis),比輪廓分析更趨于復(fù)雜,不關(guān)注于特殊組分,而對(duì)樣品進(jìn)行快速篩選分類;(4)代謝組學(xué)分析(MetabonomicAnalysis),在前三者的基礎(chǔ)上,更進(jìn)一步系統(tǒng)化,整合化,研究所有代謝產(chǎn)物的變化情況。作為生命學(xué)科領(lǐng)域中的一門新興組學(xué)技術(shù),代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白組學(xué)等共同構(gòu)成了“系統(tǒng)生物學(xué)”(SystemsBiology)。外源性物質(zhì)作用于生物體后,應(yīng)激性地導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄、翻譯,蛋白質(zhì)表達(dá)、合成,繼而代謝終產(chǎn)物生成等一系列變化,從DNA,mRNA到蛋白質(zhì)組,再到代謝物組,生命信息在漸次的傳遞中逐步擴(kuò)增,最終整合放大到代謝物組的變化上,同時(shí)由于代謝組學(xué)研究對(duì)象的易得性,這就大大提升了它的研究?jī)r(jià)值,為新藥篩選,毒理闡釋,疾病診斷等提供了新的視角和手段。一、數(shù)據(jù)處理與分析代謝組學(xué)關(guān)注的核心在于比較研究外源物刺激或基因變異后體液中小分子代謝產(chǎn)物集合的變化,但目前還沒有一種技術(shù)平臺(tái)能做到全成分分析。從研究階段上講,代謝組學(xué)研究可以劃分為兩大方面的內(nèi)容:1.數(shù)據(jù)采集即以生物體液中的代謝產(chǎn)物為研究對(duì)象,利用NMR、LC-MS等各種譜學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。代謝組學(xué)是基于NMR技術(shù)發(fā)展起來的,它對(duì)生物樣品的選擇寬泛,靈敏度高,非侵襲性實(shí)驗(yàn)提供的微量樣品就足以供多次分析用,且不需要復(fù)雜的樣品前處理;同時(shí)新興的魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)已大大提高了NMR技術(shù)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)(如組織等)的分辨能力,使得NMR技術(shù)繼續(xù)在代謝組學(xué)研究中保持主流地位;色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)整合了色譜的高分離度和質(zhì)譜高靈敏度、普適性的長(zhǎng)處,在代謝組學(xué)研究中獲得的越來越廣泛的應(yīng)用。2.數(shù)據(jù)處理與分析利用模式識(shí)別對(duì)獲得的譜圖信息進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)處理,可采取監(jiān)督型(Supervised)或非監(jiān)督型(Unsupervised)方法分析數(shù)學(xué)算法前處理后得到的數(shù)據(jù)矩陣來發(fā)掘蘊(yùn)涵著的有效信息,前者有主成分分析分析(PCA),聚類分析(CA)等;后者包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN),偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)等,隨著研究的深入,對(duì)數(shù)據(jù)的分析正趨于智能專家系統(tǒng)化,如COMET初步建立的“CLOUDS”系統(tǒng),采用了非神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形式的概率k-NN分類方法,利用重疊強(qiáng)度對(duì)未知化合物進(jìn)行毒理分類。目前,人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵問題并不在于數(shù)據(jù)的獲取,而在于有效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)數(shù)據(jù)信息的充分解讀。隨著既往研究的積累,代謝組學(xué)在藥物毒理研究、作用機(jī)理闡釋和疾病診斷中的應(yīng)用越來廣泛深入。下面從上述三種應(yīng)用領(lǐng)域入手,選擇有代表性的個(gè)案扼要地概述代謝組學(xué)的研究進(jìn)展及在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用設(shè)想。二、代謝組理論在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用1.代謝組的應(yīng)用代謝組學(xué)的概念是Nicholson等人在以NMR技術(shù)為基礎(chǔ)的藥物毒性評(píng)價(jià)體系建立的系統(tǒng)工作中提出的,因此藥物毒理研究是代謝組學(xué)研究的初衷,也是目前研究最為活躍的領(lǐng)域之一。通過研究藥物作用后體液中代謝物組的擾動(dòng),將這種擾動(dòng)與既知的生物代謝途徑關(guān)聯(lián),就能獲得關(guān)于外源物作用于生物體位點(diǎn)、途徑和強(qiáng)弱等相關(guān)信息,且隨著藥物毒理數(shù)據(jù)庫的建立、專家系統(tǒng)的完善,代謝物組在未知化合物的毒性預(yù)測(cè)中的應(yīng)用具有廣闊的前景,這將大大降低新藥的創(chuàng)新成本和研發(fā)周期。Gartland等人研究發(fā)現(xiàn)由BEA、環(huán)氧丙烷和N-苯基鄰氨基苯甲酸誘導(dǎo)的乳突淋瘤樣毒性表現(xiàn)為早期尿樣中三甲胺-N-氧化物,二甲胺,甲胺和甜菜堿的升高,同時(shí)二甲基甘氨酸,檸檬酸鹽,2-酮戊二酸降低;在服用環(huán)孢霉素、HgCl2和d-絲氨酸后的大鼠尿液中,Williams等使用LC-MS發(fā)現(xiàn)了一系列新的表征腎小管損傷的生物標(biāo)記物,它們?cè)谏彼岽x的過程產(chǎn)生;Holmes等利用代謝組學(xué)研究腎小管S3段損傷性化合物HgCl2和六氯對(duì)二甲苯,結(jié)果隨腎小管S3段損傷的加劇,尿中乳酸、羥丁酸鹽、馬尿酸鹽、Cr和酮戊二酸顯著升高,提示這些成分可以作為腎小管S3段損傷的生物標(biāo)記物。國(guó)內(nèi)王全軍等對(duì)抗腫瘤藥物Z24進(jìn)行毒理代謝組學(xué)研究,結(jié)果PCA分析得分圖中高中低劑量呈現(xiàn)聚類分布,這種分布與毒性反應(yīng)相對(duì)應(yīng),高中劑量的代謝表型是Z24肝臟毒性的典型表現(xiàn),順烏頭酸、己二酸、乳酸等被證實(shí)為生物標(biāo)記物。2.心血管疾病的診斷病理過程中代謝網(wǎng)絡(luò)的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂,這最終體現(xiàn)在體液代謝組成和相對(duì)量的變化上。因此比較研究正常組與病理組的代謝物組,利用Supervised類型分析方法就能尋找到特定的表征病理狀態(tài)的生物標(biāo)記物。許國(guó)旺等人基于LC-MS/MS技術(shù)對(duì)肝臟疾病的診斷進(jìn)行代謝靶標(biāo)研究,以尿液中核苷酸類代謝終產(chǎn)物為分析對(duì)象,PCA分析并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí),可將肝炎、肝硬化誤診為肝癌的幾率下降到7.4%,目前這一研究成果正接受多方資金資助進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。Brindle等應(yīng)用NMR技術(shù),以嚴(yán)重心血管疾病患者和心血管動(dòng)脈硬化患者的血清和血漿為研究對(duì)象,進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,結(jié)合PCA,SIMCA,PLS-DA等模式識(shí)別技術(shù)建立了判別心血管疾病及其嚴(yán)重程度的新診斷方法,優(yōu)于傳統(tǒng)的血管造影術(shù)。隨著人類基因組草圖計(jì)劃的完成,后基因時(shí)代里多種“omics”技術(shù)涌現(xiàn),大量關(guān)于生命體基因、蛋白質(zhì)、代謝物組間相互作用聯(lián)系的信息被發(fā)現(xiàn),這反饋性地刺激了檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)從單一項(xiàng)目檢測(cè)向整體分析過渡,從輔助疾病診斷向健康早期預(yù)警過渡,為代謝組學(xué)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用開拓了更為廣闊的前景。3.方法學(xué)體系的研究藥物作用于機(jī)體后一方面自身會(huì)被腸道菌群或肝藥酶代謝,產(chǎn)生活化或滅活的代謝產(chǎn)物,另一方面藥物/藥物代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)應(yīng)答的變化,這最終還會(huì)體現(xiàn)在體液中代謝物組的成分構(gòu)成或相對(duì)濃度的變化上,因此藥物代謝組學(xué)的研究目的在于從藥物誘導(dǎo)的內(nèi)源物的時(shí)空變化切入,通過與相關(guān)生物途徑的關(guān)聯(lián),探討藥物的作用靶點(diǎn)和機(jī)制。目前,代謝組學(xué)研究大多集中在藥物毒理研究上,涉足藥物作用機(jī)制解析的研究-藥物代謝組學(xué)研究還處于初級(jí)階段,這主要表現(xiàn)在進(jìn)行藥物代謝組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)還正在構(gòu)建,方法學(xué)體系正在探討,這當(dāng)中PlumbR.S.研究小組進(jìn)行了許多有益的開拓性研究。他們用LC/MS對(duì)鼠尿中3種候選藥物的代謝情況進(jìn)行了檢測(cè),通過將空白尿液與給藥尿液LC/MS譜圖的比較分析,成功的將3種藥物的代謝差異在質(zhì)譜中區(qū)分出來,共找出了10個(gè)化合物。此外,他們還利用LC/TOFMS聯(lián)用技術(shù)在事先不清楚受試藥物結(jié)構(gòu)的情況下對(duì)體液中的藥物代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)給藥樣本與空白樣本的譜圖進(jìn)行對(duì)比分析,在復(fù)雜譜峰中分析出了代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰,避開了大量?jī)?nèi)基質(zhì)峰的干擾。黃玉榮等用代謝組學(xué)方法研究鉤藤多動(dòng)合劑的藥效機(jī)制,采用攀爬實(shí)驗(yàn)和自發(fā)行為實(shí)驗(yàn)研究多動(dòng)合劑對(duì)去水嗎啡小鼠模型的藥效作用,同時(shí)用HPLC-ECD方法研究其生化機(jī)制,觀察到多動(dòng)合劑可抑制去水嗎啡引起的小鼠的攀爬行為,并減弱自發(fā)活動(dòng)的增強(qiáng)。對(duì)去水嗎啡引起的血漿中DA和NE含量的改變及腦組織中DA含量的改變,多動(dòng)合劑均能予以校正,表明多動(dòng)合劑能調(diào)整單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的失衡以達(dá)到治療多動(dòng)綜合征的目的。除了上述列舉的3種主要應(yīng)用領(lǐng)域外,代謝組學(xué)尚還有植物代謝組學(xué)、營(yíng)養(yǎng)代謝組學(xué)研究等分支。三、從生物代謝組學(xué)的角度探討中醫(yī)證候的本構(gòu)模型自1999年有英國(guó)皇家理工學(xué)院的Nicholson提出代謝組學(xué)(Metabonomics)的概念以來,它以其在生命科學(xué)領(lǐng)域巨大的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用潛力吸引了許多世界一流的實(shí)驗(yàn)室參與到相關(guān)研究中。2001年P(guān)fizer、EliLilly、Novartis等六家世界制藥巨頭與英國(guó)LondonImperialCollege合作成立了毒理代謝物組學(xué)國(guó)際研究協(xié)作組(ConsortiumforMetabonomicToxicology,簡(jiǎn)稱COMET),致力于開發(fā)適于在新藥研發(fā)中進(jìn)行毒理篩選的數(shù)據(jù)庫;創(chuàng)制用于毒性預(yù)測(cè)的軟件專家系統(tǒng)。由于得到數(shù)家頂級(jí)工業(yè)實(shí)驗(yàn)室的支持,幾年來他們成績(jī)斐然,截至目前基于NMR技術(shù)的COMETⅠ已順利完成,由Waters公司進(jìn)行戰(zhàn)略資助的基于LC/MS的COMETⅡ已實(shí)質(zhì)開展。代謝組學(xué)在廣泛應(yīng)用于藥物安全性評(píng)價(jià)和疾病診斷等研究領(lǐng)域的同時(shí),由于其從代謝網(wǎng)絡(luò)終端表象的整體角度反映生物體的功能水平,這恰與中醫(yī)的整體思想吻合。從整體觀念來看,證侯是由受外源性刺激(外邪)或基因變異(內(nèi)因)所致的病理變化過程,該過程使生物代謝網(wǎng)絡(luò)、使細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性產(chǎn)物的種類、濃度、相對(duì)比例發(fā)生擾動(dòng),這種擾動(dòng)體現(xiàn)在小分子代謝產(chǎn)物集合輪廓的改變。因此利用多種譜學(xué)技術(shù)建立代謝物指紋圖譜來表征這種動(dòng)態(tài)的多元生物整體信息的改變,并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法挖掘這些譜間隱含的信息,從而確定證侯的生物標(biāo)記物,可從系統(tǒng)生物學(xué)的代謝物組學(xué)角度闡明中醫(yī)證侯的微觀本質(zhì)。在此基礎(chǔ)上,以有效的方劑進(jìn)行治療或干預(yù),研究其對(duì)生物標(biāo)記物的影響,通過以方測(cè)證的方法確證生物標(biāo)記物的意義及方證相應(yīng)性。從整體觀上看,證侯最終必須在動(dòng)物的藥理和病理模型上予以證實(shí)。代謝物組學(xué)研究可以區(qū)別不同種屬、不同品系動(dòng)物模型的代謝狀態(tài)的差異,尋找人類疾病藥效和毒性的適宜動(dòng)物模型,而生物標(biāo)志物起著動(dòng)物模型和證侯的橋梁作用。因此,以證侯的生物標(biāo)志物為動(dòng)物模型的建模和評(píng)價(jià)體系,可建立出反映證侯本質(zhì)的證侯動(dòng)物模型。深入的研究工作將利用能誘導(dǎo)與證候Marker變化軌跡最大疊和的外