大鼠雙側腎上腺切除術后下丘腦室旁核mr、gr表達的變化

大鼠雙側腎上腺切除術后下丘腦室旁核mr、gr表達的變化

干預神經因素的遺傳因素（hyp-a）是調節(jié)身體和環(huán)境平衡、維持和調節(jié)身體衰老過程的重要因素。糖皮質激素與皮質類固醇激素受體——鹽皮質激素受體(mineralocorticoidreceptor,MR)和糖皮質激素受體(glucocorticoidreceptor,GR)結合,反饋作用于垂體和下丘腦構成HPA軸負反饋調節(jié)的主要通路。其中下丘腦室旁核(periventricularnucleus,PVN)有直接激活HPA軸的作用,是HPA軸的調節(jié)中心。本實驗建立大鼠腎上腺切除模型,應用免疫組織化學方法觀察了腎上腺切除后大鼠下丘腦室旁核MR、GR的表達變化,為進一步研究MR、GR在調節(jié)HPA軸中發(fā)揮的作用提供實驗依據。1材料和方法1.1實驗動物及分組成年健康雄性Wistar大鼠70只,體重200～220g,中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供,實驗室條件飼養(yǎng),隨機分正常組、腎上腺切除0,4,7d組及假手術組。每組10只。1.2小鼠肝腎損傷前引物前充液將大鼠用戊巴比妥麻醉后,取俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長的皮膚切口。在腎臟前內側脊柱下方找到淡黃色的腎上腺并摘除,同法摘除右側腎上腺(位置稍靠前),縫合肌肉和皮膚,并涂以碘酊。對照組進行與實驗組相似的手術,但不摘除腎上腺。術后保持室溫為21～25℃,以葡萄糖液、生理鹽水代替飲水。1.3抗組織化學染色各組大鼠稱體重后,腹腔內注射戊巴比妥麻醉,打開胸腔,從左心室插管至升主動脈,剪開右心耳,生理鹽水快速沖洗后,4%的多聚甲醛灌流固定,取腦組織在同種固定液中續(xù)固定3h,40%的蔗糖沉糖,制作冰凍切片,進行免疫組織化學染色。1.4抗mr、gr抗體恒冷箱切片機(型號Leica)制作冰凍切片,厚14μm,0.01MPBS漂洗后切片依次經0.03%Tritonx-100浸泡10min、3%H2O2-甲醇20min以阻斷內源性過氧化物酶、5%BSA封閉20min后滴加兔抗MR、GR抗體(MR工作濃度為1∶200、GR工作濃度為1∶500MR、GR均購于SantaCruzBiotechnology公司),4℃冰箱孵育過夜,(對照組加0.01MPBS代替一抗)再滴加生物素化羊抗兔IgG和即用型SABC(免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司),以上各步間用0.01MPBS漂洗,DAB顯色,脫水,透明,封片,光學顯微鏡(OLYMPUS,BX60,Japan)下觀察并攝片。1.5平均光密度測定采用MoticImagesAdvanced3.2圖像分析系統(tǒng),在下丘腦室旁核區(qū)測每高倍(10×40倍)視野內MR、GR的光密度值,每張切片選2～3個視野,計算各組平均光密度(IOD)。所得數據用SPSS13.0軟件處理,采用方差分析進行兩兩比較,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1室旁核神經元/細胞內表達的產物正常組、假手術組及腎上腺切除組MR免疫反應陽性產物呈棕黃色表達,位于室旁核神經元的細胞質和細胞核內。各組免疫反應陽性神經元的數目及染色強度無明顯變化(P>0.05)(表1、圖1)。2.2gr免疫反應陽性細胞數目、染色強度的比較GR免疫反應陽性產物呈棕黃色表達,正常組、假手術組的GR主要分布在室旁核神經元的細胞質與細胞核中。腎上腺切除組:0d組GR免疫反應陽性細胞數目、染色強度與正常組、假手術組相比,無顯著性差異(P>0.05)。4,7d組GR免疫反應陽性細胞數較正常組、假手術組明顯增多,染色深(P<0.05),免疫反應陽性產物主要分布在細胞質中,7d組較4d組免疫反應陽性細胞多,染色更深,表達增強(P<0.05)(表2、圖2)。腺切除4d組比較**P<0.05。。3糖皮質與糖激素的作用下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)由下丘腦、垂體、腎上腺組成,三者構成一種級別上的相互協(xié)調的反饋調節(jié)系統(tǒng)。下丘腦的室旁核(PVN)是HPA軸活動的直接控制部位。當下丘腦接受來自高位中樞信息時,PVN的小細胞神經元分泌多種促進促腎上腺皮質激素分泌的激素,其中最重要的是促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)和精氨酸加壓素(AVP)。CRH和AVP經垂體門脈血流到達垂體,并刺激垂體分泌促腎上腺皮質激素(ACTH);后者經血液循環(huán)到達腎上腺,刺激腎上腺皮質合成和分泌糖皮質激素(靈長類動物以皮質醇為主,嚙齒類動物以皮質酮為主)。糖皮質激素與皮質類固醇激素受體-鹽皮質激素受體(MR)和糖皮質激素受體(GR)結合,反饋作用于垂體和下丘腦構成HPA軸負反饋調節(jié)的主要通路。MR、GR這兩個受體屬于核受體家族,他們是能與特異性激素結合的蛋白,主要是一類配基依賴性轉錄調節(jié)因子,通過調節(jié)基因表達誘導或者抑制細胞的增殖、分化和死亡,導致多種生物效應。核受體的最大特點是未與激素結合前位于細胞質中,當受體和激素結合后導致受體的活化,活化的受體發(fā)生核轉位,使受體由細胞質進入細胞核發(fā)揮轉錄調節(jié)作用。MR在中樞的表達比較集中,主要局限在海馬、外側隔核、杏仁核、嗅核、穹窿下器官、下丘腦等區(qū)域。GR廣泛分布于大腦各區(qū),以邊緣系統(tǒng)的海馬、隔區(qū)、下丘腦最為豐富。本實驗通過免疫組化技術檢測了正常組、假手術組及腎上腺切除0,4,7d組下丘腦室旁核MR、GR的表達變化。實驗結果表明,腎上腺切除后下丘腦室旁核MR的表達無顯著變化,而GR表達上調。并且GR的免疫反應陽性產物主要分布在細胞質中。這種結果說明位于下丘腦室旁核的MR可能沒有直接涉及HPA軸的調節(jié)。曾有報道,海馬的MR與糖皮質激素結合,參與HPA軸的負反饋調節(jié),杏仁核、前額皮質的MR與糖皮質激素結合可以激活HPA軸。我們推測MR在各個腦區(qū)的作用是不同的,下丘腦室旁核MR與皮質酮結合的作用可能是對水鹽攝取和血壓的調節(jié)。腎上腺切除后GR的表達升高,部分神經元免疫反應陽性物質主要分布在胞質,表明腎上腺切除后糖皮質激素水平下降或缺