綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的克隆表達(dá)胡美娟-四川課件

&綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的克隆表達(dá)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)基地班&綠色熒光蛋白在大腸桿菌中的克隆表達(dá)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院目錄123456實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)用品及方法介紹實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)原理具體實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)7參考文獻(xiàn)目錄123456實(shí)驗(yàn)背景實(shí)驗(yàn)用品及方法介紹實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)原理具200810月8日，瑞典皇家科學(xué)院宣布，2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)由日本科學(xué)家下村修、美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健獲得，他們?nèi)嗽诎l(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白(GFP)方面取得了突出成就。實(shí)驗(yàn)背景200810月8日，瑞典皇家科學(xué)院宣布，2008年諾貝爾化學(xué)綠色熒光蛋白是由日本學(xué)者下村修于1962年從多管水母中發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種發(fā)光蛋白。它是由238個(gè)氨基酸構(gòu)成的“β-桶”型三維立體結(jié)構(gòu),其中第65~67位氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成發(fā)光團(tuán),為主要發(fā)光的位置。綠色熒光蛋白是由日本學(xué)者下村修于1962年從GFP的演化

通過(guò)生物化學(xué)的方法將基因做小小的改變,就可以改變GFP中的氨基酸,得到變異GFP。目前應(yīng)用較多的是GFP的突變體—增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（簡(jiǎn)稱EGFP）。EGFP將GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突變成為亮氨酸，從而發(fā)射出的熒光強(qiáng)度比GFP大6倍以上。

所以，EGFP比GFP更適合作為報(bào)告基因來(lái)研究基因表達(dá)、調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)等GFP的演化GFP性質(zhì)1、檢測(cè)方便2、熒光穩(wěn)定3、無(wú)毒害4、具有共用性和通用性5、易于構(gòu)建載體6、可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀察

GFP性質(zhì)1、檢測(cè)方便GFP的應(yīng)用

(1)研究基因表達(dá)的調(diào)控元件和蛋白定位。(2)研究基因表達(dá)的時(shí)序控制與空間定位。(3)可用于發(fā)育分子機(jī)理研究。(4)篩選藥物。(5)臨床檢驗(yàn)。(6)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物的篩選標(biāo)記。GFP的應(yīng)用

(1)研究基因表達(dá)的調(diào)控元件和蛋白定位。干擾素電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒的構(gòu)建電泳檢測(cè)酶切pET28a質(zhì)粒酶切位點(diǎn)選擇感受態(tài)細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)化篩選及復(fù)篩及酶切驗(yàn)證PCR檢測(cè)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDS檢測(cè)目的蛋白包涵體檢測(cè)分離純化PCR擴(kuò)增EGFP目的基因獲取引物設(shè)計(jì)干擾素電泳檢測(cè)重組質(zhì)粒的構(gòu)建電泳檢測(cè)酶切pET28a質(zhì)粒酶切實(shí)驗(yàn)用品及方法介紹研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和表達(dá)。通過(guò)質(zhì)粒重組形成所需要的重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)，通過(guò)酶切、PCR及用IPTG誘導(dǎo)檢測(cè)是否在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)成功。根據(jù)電泳結(jié)果及熒光現(xiàn)象得出結(jié)論，重組質(zhì)粒在大腸桿菌體內(nèi)成功誘導(dǎo)表達(dá)。方法介紹實(shí)驗(yàn)用品及方法介紹研究綠色熒光蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的基因克隆和實(shí)驗(yàn)用品

PEGFP-N3模板、菌株E.coliDH5α、E.coliBL21、質(zhì)粒pET28a、

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、

HindⅢ、T4DNA連接酶、1kbDNAladder

DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒及IPTG、PCR用試劑、卡那霉素、瓊脂糖及PCR合成引物等、蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等。

PCR儀、

凝膠成像系統(tǒng)、熒光顯微鏡DYY-6C電泳槽和電泳儀、高速臺(tái)式離心機(jī)、UV2300紫外可見分光光度計(jì)

實(shí)驗(yàn)用品PEGFP-N3模板、菌株E.

目的基因：EGFP(720bp)的基因片段:ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA目的基因內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)如下：154Eco57I198Eco57I397Eco57I710Bsp1407I

181BsiI

目的基因：序列來(lái)源：pEGFP-N3質(zhì)粒

pET28a質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)?！猵ET28a質(zhì)粒（1）含有T7Lac啟動(dòng)子（2）含有寡聚組氨酸鏈（His-tag)（3）其N端含有Thrombin蛋白酶切位點(diǎn)。（4）Pet28a的抗性是kana抗性，通常所用的表達(dá)菌株是BL21（DE3），BL21（DE3）Gold等BL21（DE3）系列的宿主菌。

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BL21（DE3）帶有T7RNA聚合酶基因的λDE3溶原菌,T7RNA聚合酶基因由lacUV5啟動(dòng)子控制。未誘導(dǎo)時(shí)便有一定程度轉(zhuǎn)錄，因此適合于表達(dá)其產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒害作用的一些基因。

大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)：實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)原理1.質(zhì)粒DNA的提取1）質(zhì)粒是一種染色體外的遺傳因子，大小在1kb~200kb之間，是具有雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制能力，，能使子代保持他們恒定的復(fù)制數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。它可以獨(dú)立游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中，它離開宿主細(xì)胞就不能復(fù)制，而它控制的許多生物學(xué)功能也是對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。2）從大腸桿菌中抽提質(zhì)粒DNA的方法很多，可以在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)不同的需要采用不同的方法。堿變性法抽提質(zhì)粒DNA的基本原理是根據(jù)染色體DNA和質(zhì)粒DNA分子量的巨大差異而達(dá)到分離的。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性堿變性法因其抽提效果好，收得率高，獲得的DNA可用于酶切、連接與轉(zhuǎn)化，因而被各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。抽提過(guò)程中在加入溶液II后，堿性條件使DNA的氫鍵斷裂，宿主染色體雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)加入溶液III中和后，宿主DNA相對(duì)分子質(zhì)量大，還沒來(lái)得及復(fù)性，就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質(zhì)、高分子量的RNA等纏繞在一起而沉淀下來(lái)，而質(zhì)粒DNA由于能夠迅速配對(duì)恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型而溶解在TE溶液中。實(shí)驗(yàn)原理1.質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)原理2.質(zhì)粒DNA的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)10^7bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。實(shí)驗(yàn)原理2.質(zhì)粒DNA的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理3.酶切及連接限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類，在分子克隆中常用II型限制性內(nèi)切酶，BamHI和HindIII都屬于II型限制性內(nèi)切酶，這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈ＤＮＡ分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個(gè)特異核苷酸序列內(nèi)，切斷ＤＮＡ的雙鏈，形成一定長(zhǎng)度和順序的ＤＮＡ片段。BamHI和HindIII的識(shí)別序列和切口是：BamHI：G↓GATCCHindIII：

A↓AGCTTDNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA鏈的3-末端具有一個(gè)游離的-OH，和在另一條DNA鏈的5-末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(-P)實(shí)驗(yàn)原理3.酶切及連接實(shí)驗(yàn)原理4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)（BL-21）中細(xì)菌處于外源DNA的生理狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0℃，在有氯化鈣存在的低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有抗生素的選擇培養(yǎng)基上。實(shí)驗(yàn)原理4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)（BL-21）實(shí)驗(yàn)原理5.重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)表達(dá)載體具有一段大腸桿菌β－半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其編碼的α肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱為lacZ’基因。lacZ’基因編碼的α肽鏈與失去了正常氨基端的β－半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，這種現(xiàn)象稱之為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而形成的有功能活性的β－半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-錄-3-吲哚-β-半乳糖苷）顯色測(cè)定出來(lái)。因此，任何攜帶著lacZ’基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了染色體基因組存在著此種β－半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，便會(huì)產(chǎn)生出有功能活性的β－半乳糖苷酶，在IPTG誘導(dǎo)后，在含有X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落。而當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ’中的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β－半乳糖苷酶相互補(bǔ)的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有活性的β－半乳糖苷酶，因此，用紫外線照射后，含有重組質(zhì)粒載體的克隆就是綠色菌落。實(shí)驗(yàn)原理5.重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)表達(dá)Part01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P01質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取P02質(zhì)粒DNA的提取P03感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，平皿內(nèi)有但菌落長(zhǎng)出。用滅菌吸頭挑取單菌落，浸沒于2mL含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

取1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃、11000r/min離心1分鐘，吸棄上清。Part01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P01質(zhì)粒DPart01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P04質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取P05質(zhì)粒DNA的提取P06

向離心管中加入150

l用冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，用微量移液器吹打重懸沉淀。加入200

l新配制的溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，冰上放置5分鐘加入150

l用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，輕輕混勻，冰上放置3~5分鐘。Part01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P04質(zhì)粒DPart01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P07質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取P08質(zhì)粒DNA的提取P09

用微量離心機(jī)于4℃、11000r/min離心5分鐘，吸取上清轉(zhuǎn)移到另一離心管。

加等體積氯仿400

l抽提，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4℃、11000rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

用70%乙醇洗滌2次，再次4℃、11000rpm離心5分鐘，沉淀于空氣中干燥。向已干燥的離心管內(nèi)加20

l超純水溶解質(zhì)粒DNA，加入TE緩沖液（其中含2

l10mg/mlRNA酶），37℃處理1小時(shí)后于-20℃貯存。吸取上清液300

l，向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后，于室溫放置2分鐘；用微量離心機(jī)于4℃、11000rpm離心5分鐘，棄上清。

Part01Part02Part03具體實(shí)驗(yàn)步驟P07質(zhì)粒D質(zhì)粒DNA的檢測(cè)1.瓊脂糖凝膠板的制備質(zhì)粒DNA的檢測(cè)2.加樣質(zhì)粒DNA的檢測(cè)3.電泳質(zhì)粒DNA的檢測(cè)4.觀察和拍照具體實(shí)驗(yàn)步驟稱取0.3g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入30mL1×TAE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到650C（不燙手為宜），加入1μLGoldview混勻，攪拌器上攪拌排除氣泡，（如右圖）緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機(jī)玻璃槽（插入樣品槽模板梳子）內(nèi)。靜置30min左右，輕輕晃動(dòng)拔出梳子。膠板放入電泳槽中（樣品孔位于負(fù)極），注入1×TAE緩沖液淹沒過(guò)膠板1mm，用取液器將提取的質(zhì)粒DNA5μL與1μLLoadingBuffer（6×）混勻，加入膠板的樣品小槽內(nèi)。將電泳槽與電泳儀接通，調(diào)節(jié)電壓為100V左右，直至緩沖液的藍(lán)色指示劑移動(dòng)到距離膠板邊沿約1~2cm處，停止電泳。將膠板小心取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)位置居中，波長(zhǎng)為254nm的紫外燈下，觀察凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。質(zhì)粒DNA的檢測(cè)1.瓊脂糖凝膠板的制備質(zhì)粒DNA的檢測(cè)2.加具體實(shí)驗(yàn)步驟酶切及連接分別取兩支0.2mlEP管做上記號(hào)：如①②兩個(gè)EP管中分別配置下列的30μL體系：具體實(shí)驗(yàn)步驟酶切及連接分別取兩支0.2mlEP管做上記號(hào)：如具體實(shí)驗(yàn)步驟5.3.酶切及連接4.將兩只EP管混勻后瞬時(shí)離心，放入恒溫培養(yǎng)箱370C酶切1h。取5μL①②EP管的酶切反應(yīng)液，同時(shí)取5μL原質(zhì)粒溶液作對(duì)照，進(jìn)行電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。按照回收試劑盒步驟切膠回收所需酶切產(chǎn)物片段具體實(shí)驗(yàn)步驟5.3.酶切及連接4.將兩只EP管混勻后瞬時(shí)離心具體實(shí)驗(yàn)步驟酶切及連接在EP管中分別配置下列的體系：液體混勻后快速離心管中瞬時(shí)離心，放入培養(yǎng)箱220C溫育20min后，-200C下保存用于轉(zhuǎn)化。具體實(shí)驗(yàn)步驟酶切及連接在EP管中分別配置下列的體系：液體混勻具體實(shí)驗(yàn)步驟1.取100μl感受態(tài)BL-21，冰上慢速解凍，均勻懸浮。加入2μl經(jīng)過(guò)酶切鑒定成功提取重組質(zhì)粒pET-28a-GFP，輕輕混勻，冰上靜置10-30min。2.3.4.5.吸取200μl菌液涂布于含抗生素的LB平板上，用涂布器均勻涂布，平皿正放靜置1-2h后，封口膜封好平皿，

37℃培養(yǎng)倒置12-16h。轉(zhuǎn)入50ml離心管中，4000r/min離心10min,棄上清液，收集菌體。42℃水浴熱激70s，立刻于冰上放置2min。加入200μl含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，60r/min震蕩培養(yǎng)30min。四支EP管中加入0.5μl的100mM的IPTG誘導(dǎo)，另外EP管中不加入IPTG誘導(dǎo)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)（BL-21）中具體實(shí)驗(yàn)步驟1.取100μl感受態(tài)BL-21，冰上慢速解凍具體實(shí)驗(yàn)步驟123用紫外線照射菌體沉淀，保存照片。4重組綠色熒光蛋白（GFP）的誘導(dǎo)表達(dá)取GFP重組菌接種于2mlLB培養(yǎng)液(含Kana100mg/l)中，37℃150-220r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將20μl菌液按1：50—100接種于2mlLB培養(yǎng)液(含Kana100mg/l)中，37℃200r/min培養(yǎng)2h。按IPTG:LB培養(yǎng)基按1:1000加入2μl的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組不加IPTG誘導(dǎo)。具體實(shí)驗(yàn)步驟123用紫外線照射菌體沉淀，保存照片。4重組綠色加入溶液1渾濁；加入溶液2變澄清；加入溶液3出現(xiàn)白色絮狀沉淀；加入氯仿抽提溶液分層。若成功提取，需經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后才能觀察出結(jié)果。質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)加入溶液1渾濁；加入溶液2變澄清；加入溶液3出現(xiàn)白色絮狀沉淀質(zhì)粒DNA的鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)含目的基因的重組質(zhì)粒，得到有兩條帶，前面第一條帶為GFP基因片段，第二條帶為質(zhì)粒載體，則成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-GFP。若EGFP基因成功連接到pET-28a載體，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，可以看到明顯的一條亮帶，其大小約為750bp。其前面不明顯的彌散的條帶為引物二聚體。電泳檢測(cè)結(jié)果泳道1234567樣品YFP-8YFP-7YFP-6YFP-5YFP-028aM樣量20作用本組誘導(dǎo)前對(duì)照空載體對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)含目的基因的重組質(zhì)粒，得到有兩條泳道中出現(xiàn)三條帶。最前面的帶是目的基因片段大約500bp左右，