人參皂苷rg3對(duì)sk-mes-1細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及vegf、bf-gf表達(dá)的影響

人參皂苷rg3對(duì)sk-mes-1細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及vegf、bf-gf表達(dá)的影響

rg3是日本學(xué)者在20世紀(jì)80年代首次提出的中藥單體。日本學(xué)者北川洋弘于20世紀(jì)80年代首次提出了這一問(wèn)題。之后，日本、中國(guó)、韓國(guó)、德國(guó)和其他國(guó)家的科學(xué)家進(jìn)行了不同程度的研究。近年來(lái)的研究表明其具有抑制多種腫瘤細(xì)胞,如黑色素瘤、肺癌、胃癌及前列腺癌等的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等作用,而且具有抑制腫瘤新生血管形成的作用,其作用機(jī)制可能為降低腫瘤細(xì)胞VEGF及其受體的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人肺鱗癌裸鼠移植瘤模型,觀察人參皂苷Rg3對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響,并從蛋白和基因水平來(lái)探討Rg3對(duì)肺鱗癌裸鼠移植瘤的作用機(jī)制。1材料和方法1.1細(xì)胞、皂苷rg34～6周齡BALB/c裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,共32只,雌雄各半,體重約18～22g。人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞由河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所提供。人參皂苷Rg3由吉林亞泰天然藥物研究所饋贈(zèng),純度為99.5%。小鼠抗人VEGF單抗、小鼠抗人bFGF單抗購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司,PV-9000試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司,人VEGF、bFGF原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。1.2方法1.2.1養(yǎng)液中常用藥物人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng),其內(nèi)加入青霉素(100kU/L)及鏈霉素(100kU/L),置于5%CO2、飽和濕度、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用PBS制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)整活細(xì)胞濃度為1×108/mL接種裸鼠。1.2.2觀察動(dòng)物一般狀況及腫瘤生長(zhǎng)抑制率ir裸鼠32只,無(wú)菌條件下每只裸鼠右側(cè)背部皮下接種上述單細(xì)胞懸液0.1mL。第7天平均腫瘤體積約150mm3時(shí),將荷瘤裸鼠隨機(jī)分4組(8只/組)。A組(對(duì)照組):0.5mL生理鹽水灌胃;B、C、D組(Rg3實(shí)驗(yàn)組):0.5mL濃度分別為0.5mg·kg-1、1mg·kg-1、2mg·kg-1的人參皂苷Rg3灌胃,每天1次,共28次。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀況包括精神狀況、皮膚光澤、活動(dòng)度、飲食、飲水情況、糞便等并稱(chēng)量體重;每隔3～4天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑,根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積(V)和腫瘤生長(zhǎng)抑制率(IR):V=ab2/2(a為長(zhǎng)徑,b為短徑),IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治療組的腫瘤體積,Vn為治療組的腫瘤體積),繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。第35天脫頸處死動(dòng)物,迅速取出完整腫瘤組織,電子天平稱(chēng)量瘤重,計(jì)算藥物的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)vegf和bfgf蛋白表達(dá)瘤組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片(4μm),分別行VEGF和bFGF免疫組化,兩抗體的工作濃度均為1∶100,染色均采用PV-9000法,按試劑盒說(shuō)明逐步操作,以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。VEGF、bFGF蛋白定位于移植瘤細(xì)胞胞漿內(nèi),陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈棕黃色,胞核呈淡藍(lán)色。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于200個(gè)),按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及著色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。(1)按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分:0分,細(xì)胞無(wú)顯色;1分,淺黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占同類(lèi)細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分,<30%為1分,30%～70%為2分,>70%為3分。取(1),(2)兩項(xiàng)評(píng)分的乘積作為總積分,0～1分為陰性,≥4分為陽(yáng)性。1.2.4原位雜交的結(jié)果判定瘤組織固定、包埋、切片后,收集于APES處理過(guò)的載玻片上,按照原位雜交試劑盒要求進(jìn)行預(yù)雜交和雜交,雜交后顯色采用BCIP/NBT底物液,以核固紅復(fù)染。雜交過(guò)程中加不含標(biāo)記探針的原位雜交液作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性雜交信號(hào)為胞漿內(nèi)藍(lán)紫色顆粒。原位雜交的結(jié)果判定方法為:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%、≤30%、≤70%和>70%分別記1、2、3、4分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度可分為弱陽(yáng)性(細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)淺紫藍(lán)色顆粒,明顯高于背景底色)、陽(yáng)性(細(xì)胞漿內(nèi)見(jiàn)較深紫藍(lán)色顆粒)、強(qiáng)陽(yáng)性(細(xì)胞漿內(nèi)有大量深紫藍(lán)色顆粒)三級(jí)分別記1、2、3分。上述兩種記分相乘,<1分者為陰性,≥3分者為陽(yáng)性。1.3均數(shù)的方差齊性檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料用(xˉ±s)(xˉ±s)表示。選擇單因素方差分析進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),多組均數(shù)間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1切片he染色32只裸鼠接種腫瘤成功率為100%,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組裸鼠未發(fā)生意外死亡。瘤體早期為橢圓形,表面光滑,后期為不規(guī)則形,表面呈結(jié)節(jié)狀,部分有潰爛。瘤組織切片HE染色,光鏡觀察病理學(xué)特征示:瘤組織呈實(shí)體樣,癌細(xì)胞核大、濃染、核仁突出,可見(jiàn)核分裂像。與實(shí)驗(yàn)前相比,各組裸鼠的進(jìn)食、活動(dòng)等無(wú)明顯變化,A組裸鼠平均體重較其他組略輕,可能與腫瘤負(fù)荷較大,消耗增多有關(guān)。2.2兩組腫瘤生長(zhǎng)、瘤體體積、重量比較由腫瘤生長(zhǎng)曲線可看出,A組移植瘤隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增性增長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均腫瘤體積是用藥前的4.34倍,而B(niǎo)、C、D組腫瘤生長(zhǎng)較A組明顯減慢,且Rg3劑量越大,生長(zhǎng)抑制越顯著,具有劑量依賴(lài)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),B、C、D組瘤體體積分別是用藥前的2.54、1.68和0.86倍(見(jiàn)圖1);各組取出瘤體的重量也顯著小于A組(P<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率,各實(shí)驗(yàn)組抑制率達(dá)到41.47%、61.29%、80.14%,見(jiàn)表1。2.3rg3單次給藥對(duì)vegf、bfgf蛋白表達(dá)的影響免疫組化顯示VEGF、bFGF定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿中,呈棕黃色顆粒。Rg3能夠抑制肺鱗癌細(xì)胞內(nèi)VEGF、bFGF蛋白表達(dá),藥物劑量越大,VEGF、bFGF蛋白表達(dá)越弱,具有明顯的藥物劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖2～5,表2。2.4vegf、bfgfmrna表達(dá)原位雜交結(jié)果提示VEGF、bFGF、mRNA定位于移植瘤細(xì)胞的胞漿中,呈藍(lán)紫色顆粒。隨藥物劑量增加,VEGF、bFGFmRNA表達(dá)逐漸降低,具有劑量依賴(lài)性,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6～9,表2。3保幼健康治療vegf的機(jī)制人參皂苷Rg3是存在于中藥人參中的四環(huán)三萜皂苷,其結(jié)構(gòu)為C42H72O13。近年國(guó)內(nèi)外研究證實(shí),Rg3通過(guò)抗增殖、促進(jìn)凋亡等多種途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用,然而其確切的抗腫瘤機(jī)制仍然有待進(jìn)一步闡明。已有研究表明,人參皂苷Rg3對(duì)高轉(zhuǎn)移性的小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16FE17)肺轉(zhuǎn)移及BALB/c小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(26-M3.1)肺轉(zhuǎn)移具有抑制作用。WangCZ等以蒸氣將西洋參加熱后,發(fā)現(xiàn)其提取液中的7種人參皂苷含量降低,而5種人參皂苷含量增高,其中包括Rb1、Rd、Re、Rg2和Rg3。檢測(cè)西洋參提取液對(duì)SW-480、HT-29、NSCLC3種腫瘤細(xì)胞系的抑制作用,同時(shí)將未加熱西洋參提取液作為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)Rg3增高時(shí),西洋參提取物的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)。KimHS等研究發(fā)現(xiàn)在其實(shí)驗(yàn)選取的11種人參皂苷中,Rg3和Rh2在體外能夠抑制前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC3細(xì)胞的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn),Rg3對(duì)于前列腺癌細(xì)胞的抑制作用可能與有絲分裂原激活蛋白激酶有關(guān)。李肖等通過(guò)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的研究證實(shí),Rg3能明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖,有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤組織壞死,并有劑量依賴(lài)性。本研究通過(guò)人肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Rg3在一定范圍內(nèi)以劑量依賴(lài)的方式減慢移植瘤生長(zhǎng)速度,其中Rg32mg·kg-1·d-1組用藥5天就已使平均腫瘤體積小于用藥前。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)該劑量組有一只裸鼠的瘤體甚至肉眼完全消失,計(jì)算抑瘤率同樣顯示Rg3的抗移植瘤療效非常顯著。目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞和血管組成一個(gè)高度整合的生態(tài)系統(tǒng),源于腫瘤細(xì)胞或相關(guān)炎性細(xì)胞的彌散信號(hào)促使內(nèi)皮細(xì)胞從休止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榭焖僭鲋碃顟B(tài),并設(shè)想通過(guò)抑制腫瘤血管新生來(lái)控制腫瘤。隨著內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立,血管生成抑制劑的發(fā)現(xiàn)以及血管生成活性蛋白純化工作的完成,這一觀點(diǎn)已為越來(lái)越多的研究證實(shí)。現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于腫瘤血管形成。腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段,即從無(wú)血管的緩慢生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)為有血管的快速增殖期,血管的生長(zhǎng)使腫瘤能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)而完成血管切換期。新生血管形成之后,腫瘤灶局部快速播散,增強(qiáng)腫瘤灶的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。因此,血管形成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)之一。正常情況下,VEGF在人體許多正常組織中表達(dá)水平極低,而大多數(shù)惡性腫瘤存在VEGF高表達(dá)。Seo等報(bào)道在142份胰腺癌組織標(biāo)本中VEGF蛋白陽(yáng)性率為93%。血管生成另一重要的正性調(diào)控因子是bFGF。人bFGF是由146個(gè)氨基酸組成的多功能調(diào)節(jié)性多肽,分子質(zhì)量為18kDa,基因編碼定位于4號(hào)染色體,是分布體內(nèi)最廣泛的生長(zhǎng)因子之一許多腫瘤表達(dá)此因子,具有促進(jìn)有絲分裂原產(chǎn)生、促進(jìn)趨化性和內(nèi)皮細(xì)胞遷移、刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶以降解基底膜、誘導(dǎo)大量來(lái)自中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞增殖和分化等作用。研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤中均有不同程度的bFGF的表達(dá),并與很多實(shí)體瘤的血管密度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)。TrojanL等報(bào)道在56份前列腺癌組織標(biāo)本中bFGF蛋白陽(yáng)性率為86.9%。本研究提示人參皂苷Rg3能夠顯著下調(diào)人肺鱗癌轉(zhuǎn)移瘤組織中VEGF、bFGF的表達(dá),且具有劑量依賴(lài)