微柱凝膠技術(shù)在輸血前檢測中的應(yīng)用及相關(guān)

微柱凝膠技術(shù)在輸血前檢測中的應(yīng)用及相關(guān)

長春博迅生物李凌波醫(yī)學(xué)博士副研究員

E-mail:lilingbo@

2010年12月

Tel柱凝膠技術(shù)在血型鑒定及不完全抗體檢測中的應(yīng)用

Tel/p>

1990年，法國人Y.Lapierre發(fā)表文章*介紹了一項(xiàng)免疫學(xué)檢測新技術(shù)：將抗原抗體反應(yīng)與凝膠分子篩技術(shù)相結(jié)合，即微柱凝膠免疫實(shí)驗(yàn)。該技術(shù)的本質(zhì)是血凝試驗(yàn)，即紅細(xì)胞抗原抗體在微柱腔內(nèi)的凝膠介質(zhì)中發(fā)生肉眼可見的免疫凝集反應(yīng)。

*

LapierreY,RigalD,AdamJ,etal.Thegeltest:anewwaytodetectedcellantigen-antibodyreactions[J].Transfusion,1990;30(2):109-113.

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微柱凝膠免疫實(shí)驗(yàn)試劑依其膠中有無抗體及抗體性質(zhì)分為:

中性膠試劑:微柱腔及膠中不含特異性抗體，也不含抗人球蛋白。特異性膠試劑:微柱腔及膠中含有特異性抗體，如人ABO血型單克隆抗體等。

抗人球蛋白膠試劑:微柱腔及膠中僅含有抗人球蛋白，不含特異性

抗體。

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R.R.A.Coombs

(January9,1921-January25,2006)1945年，劍橋大學(xué)病理學(xué)部R.R.A.Coombs發(fā)明了抗人球蛋白試驗(yàn)，半個(gè)多世紀(jì)以來，該試驗(yàn)始終是最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的檢測IgG類不完全抗體的方法，但因其操作繁瑣，反應(yīng)時(shí)間較長，不適用于大批量樣本的檢測，始終未能在臨床常規(guī)應(yīng)用。

Tel統(tǒng)的試管Coombs試驗(yàn)主要問題是操作繁瑣，需多次洗滌，加入紅細(xì)胞抗原和血清標(biāo)本后，孵育，至少三遍洗滌，再加入抗球蛋白試劑，以避免其被血清中其他非特異性球蛋白中和，抗球蛋白試劑才能真正連結(jié)紅細(xì)胞膜上的不完全抗體，使之出現(xiàn)凝集。

Tel完全抗體與相應(yīng)抗原紅細(xì)胞，在含有抗人球蛋白凝膠介質(zhì)中進(jìn)行的抗人球蛋白試驗(yàn)稱之為微柱凝膠抗人球蛋白試驗(yàn)，即微柱凝膠Coombs試驗(yàn)(MG-Coombs‘T)。MG-Coombs‘T孵育后的紅細(xì)胞不需三洗，且孵育時(shí)間只需15分鐘，尤其提高了免疫凝集試驗(yàn)的敏感性，使其能更廣泛地應(yīng)用在臨床免疫檢驗(yàn)中。

TelG-Coombs’T簡化洗滌步驟的根本原因:

由于加入的人血清和含抗球蛋白試劑的凝膠長時(shí)間處于兩相狀況，相互不擴(kuò)散，即凝膠中抗球蛋白試劑并不被人血清中的球蛋白中和及消耗；并且紅細(xì)胞和血清成分以不同的速度通過微柱(重力加速度不同)，從而也消除了血清中未結(jié)合的球蛋白中和AHG的可能性，這就是MG-Coombs’T可以簡化洗滌步驟的原因。

Tel紅細(xì)胞沉降需要的離心力一般是小于100g,而抗體等蛋白質(zhì)復(fù)合物分子沉降分離需要的離心力至少是3000g。因此微柱凝膠免疫分析技術(shù)中的離心力只能使未結(jié)合紅細(xì)胞下降分離到微柱腔尖底部，而卻不能使血清蛋白、抗人球蛋白以及可溶性抗原抗體復(fù)合物達(dá)到同樣效果。抗人球蛋白-特異性抗體-紅細(xì)胞顆粒性免疫復(fù)合物在離心下降分離過程中，在通過微柱中液體介質(zhì)和凝膠兩相之結(jié)合區(qū)時(shí)，阻力增大，細(xì)胞間距離縮小，排除其間可溶性復(fù)合物的位阻現(xiàn)象，有利于紅細(xì)胞上抗人球的橋連，從而增加了反應(yīng)的敏感性。

Tel柱凝膠免疫檢測方法的歷史1984-發(fā)明建立(Dr.Y.Lapierre,Lyon,France)1988-

出現(xiàn)商品化試劑盒1990-Lapierre于Transfusion雜志發(fā)表文章介紹該技術(shù)1994-獲美國FDA認(rèn)證1996-美國AABB《輸血技術(shù)手冊》將該方法列入血型檢測常規(guī)技術(shù)，同年，長春生物所成功研發(fā)出該技術(shù)，制備出系列試劑盒、離心機(jī)及孵育器等。目前該方法在發(fā)達(dá)國家已成為紅細(xì)胞血型血清學(xué)臨床檢測常規(guī)技術(shù)。

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凝膠檢測技術(shù)已改變了免疫血液學(xué)檢測的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn),并打開了新技術(shù)應(yīng)用的大門

——Y.Lapierre從理論上講,顆粒性凝集只要指示(細(xì)胞)顆粒與凝膠顆粒相匹配,就可以在凝膠檢測系統(tǒng)中應(yīng)用,因其本質(zhì)上是凝膠的過濾作用。這就使得該技術(shù)不僅僅應(yīng)用于紅細(xì)胞抗原抗體檢測，而成為了一種還能夠應(yīng)用于血液細(xì)胞、病源微生物、神經(jīng)內(nèi)分泌因子、腫瘤標(biāo)志物等抗原抗體檢測的臨床免疫學(xué)新方法。

TeloxSang1997;73:246–251

TeloxSang1997;73:246–251

Tel于在微柱凝膠法因?yàn)榭乖贵w量是恒定的，操作標(biāo)準(zhǔn)化，并采取了特殊的分子篩技術(shù)，所以檢測到抗原抗體弱反應(yīng)的強(qiáng)度高于傳統(tǒng)的試管法1,2，具有獨(dú)特的優(yōu)勢，目前國內(nèi)也已逐步應(yīng)用于臨床。還有研究顯示3微柱凝膠法對(duì)混合凝集(即在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)出現(xiàn)陰性、陽性兩種反應(yīng)結(jié)果)的呈現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)ABO血型亞型方面具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(許多亞型紅細(xì)胞在與標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)呈現(xiàn)混合視野凝集，在傳統(tǒng)的玻片法和試管法中不便于發(fā)現(xiàn))。1郭博,馬華,李興武,等.手工微柱凝膠免疫檢驗(yàn)法在ABO、RhD血型抗原鑒定中的應(yīng)用[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,30(1):72-73.2周小玉,許進(jìn)明,華嵐,等.微柱凝膠法鑒定ABO血型正反定型不一致原因分析[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2007,9(4):366-367.3于洋,馮倩,林子林,等.全自動(dòng)微柱凝膠技術(shù)在ABO、RhD血型鑒定中的應(yīng)用研究[J].北京醫(yī)學(xué),2008,30(3):165-167.

TelBO疑難血型中亞型的鑒定:ABO血型亞型是造成ABO血型疑難鑒定的最主要原因之一，有報(bào)道*指出由亞型造成血型定型錯(cuò)誤占到16%。常見ABO疑難血型正反定型不符的原因較多，其中亞型也是最難確認(rèn)的。ABO亞型的正反定型主要存在兩種情況，在正定型由于亞型紅細(xì)胞攜帶的A或B抗原數(shù)量少，常規(guī)血清學(xué)方法正定型檢測范圍內(nèi)與抗-A或抗-B反應(yīng)弱，甚至不發(fā)生凝集，因而往往使弱A(或弱B)錯(cuò)判為O型;另外，A2等亞型常含有針對(duì)自身抗原表位缺失部分(如A2含有的抗-A1，參照D抗原表位不完全型)甚至是針對(duì)自身抗原(如Ax含有的抗-A)的意外抗體，造成反定型鑒定錯(cuò)誤。在A或B亞型，若將弱A或弱B的紅細(xì)胞輸給O型受血者或額外出現(xiàn)的抗體在37℃反應(yīng)，就會(huì)引起溶血性輸血反應(yīng)。

*吳敏慧,劉毅,劉洪莉,等.ABO血型正反定型不符確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果分析[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2005,7(3):198-199.

Tel亞型：主要有A1、A2兩種亞型，A1比A2多4倍，A1型的紅細(xì)胞有A及A1兩種抗原，A2型的紅細(xì)胞只有A抗原。A的弱亞型：比A2亞型還弱，其特征是隨著紅細(xì)胞上A抗原位點(diǎn)數(shù)目的減少，抗原性逐漸減弱，H抗原活性反向增強(qiáng)。弱A亞型包括A3、Ax、Am、Ay、Ael等，其紅細(xì)胞上的H物質(zhì)量正常，或多于正常。

Tel亞型：發(fā)現(xiàn)了B3、Bm、Bel等弱B亞型。B亞型的鑒定可參照

A亞型?；贏BO亞型的血清學(xué)特點(diǎn)，在實(shí)際工作中正反定型不符已成為ABO亞型分類的主要依據(jù)之一，可利用相比常規(guī)方法更敏感的微柱凝膠法結(jié)合血清學(xué)技術(shù)對(duì)其篩選鑒別并正確鑒定血型，從而提高血型定型的準(zhǔn)確率，有效減少或預(yù)防臨床輸血反應(yīng)的發(fā)生。

Tel：實(shí)驗(yàn)中一例A2B亞型的鑒定：臨床標(biāo)本，姓名：張××

，標(biāo)本離心分離血漿，常規(guī)操作，制備0.8%、4%紅細(xì)胞懸液。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行正反定型，博迅定型試劑卡批號(hào)：20081006，反定型試劑批號(hào)：20090602，結(jié)果如下：

正定型反定型抗-A抗-B抗-DA1Bc3+3+4+4+W－陽性4+W，存在混合凝集

應(yīng)用微柱凝膠技術(shù)結(jié)合常規(guī)血清學(xué)方法對(duì)ABO亞型的鑒定

Tel本正定顯示為AB型，反定顯示為B型，反定該標(biāo)本血清(血漿)與反定型A1細(xì)胞呈現(xiàn)4+W的反應(yīng)格局(存在混合凝集)，正反定型不符。該結(jié)果反定用卡復(fù)試一次，結(jié)果一致，試管法復(fù)試4+W(未發(fā)現(xiàn)混合凝集)。采取措施如下：(1)用自身血清、紅細(xì)胞做反定型對(duì)照，檢驗(yàn)自身完全抗體。(2)用O型紅細(xì)胞做反定型對(duì)照，確認(rèn)是否存在ABO系統(tǒng)以外完全抗體。

結(jié)果為：反定型O1細(xì)胞O2細(xì)胞自身細(xì)胞－－－

Tel用O1、O2兩種細(xì)胞及自身紅細(xì)胞做反定型對(duì)照，結(jié)果皆陰性。證實(shí)無自身完全抗體，無ABO系統(tǒng)外完全抗體。用博迅卡、試管法各復(fù)試一次，結(jié)果一致。(3)對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行直抗、抗篩實(shí)驗(yàn)，直抗用卡法、試管法兩種方法，抗篩應(yīng)用卡法、聚凝胺法、試管法三種方法。結(jié)果為：直抗兩種方法皆陰性，抗篩三種方法皆陰性(篩檢細(xì)胞批號(hào):090601)。(4)應(yīng)用B型、AB型血辨分別與該標(biāo)本進(jìn)行交叉配血。B型與標(biāo)本交叉配血分別應(yīng)用卡法、聚凝胺法、試管法，三種方法主側(cè)陰性，次側(cè)皆陽性，B型供血者血清亦進(jìn)行抗篩試驗(yàn)結(jié)果全陰性。

標(biāo)本紅細(xì)胞與B型血辮血清分別應(yīng)用卡法、聚凝胺法、試管法交叉配血(次側(cè))結(jié)果：卡法:4+W聚凝胺:3+W試管法:4+W

Tel標(biāo)本與AB型血辨卡法交叉配血結(jié)果:主側(cè)有微弱凝集，凝集強(qiáng)度1+W

Tel慮到該標(biāo)本正反定型不符，正定為AB型(與抗-A、抗-B反應(yīng)強(qiáng)度為3+,可排除弱亞型)，反定為B型(4+W,存在混合凝集)，反定自身對(duì)照、O細(xì)胞對(duì)照皆陰性；B型交叉配血次側(cè)不符(4+W)，且直抗陰性；AB型交叉配血主側(cè)有微弱凝集，且抗篩陰性。由于反定型與A1細(xì)胞反應(yīng)陽性，初步判斷該標(biāo)本為AB型(出現(xiàn)了針對(duì)自身抗原缺失部分的意外抗體)，其中A抗原為亞型，用抗-A1試劑驗(yàn)證：將該標(biāo)本紅細(xì)胞懸液與抗-A1試劑在含中性膠的卡中反應(yīng)，結(jié)果陰性，且標(biāo)本與抗-A陽性，說明該紅細(xì)胞上僅有A抗原，無A1抗原，判斷該抗原為A2亞型，即標(biāo)本為A2B。

Tel多種不同技術(shù)可用來檢測紅細(xì)胞上的抗原數(shù)量，這其中包括使用標(biāo)記抗體或外源性凝集素的放射免疫法。在1976年，Rochant等發(fā)現(xiàn)，多數(shù)A2個(gè)體的紅細(xì)胞與熒光標(biāo)記的雙花扁豆凝集素反應(yīng)表現(xiàn)很弱的熒光，但少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)很強(qiáng)的熒光；相反地，絕大多數(shù)A1個(gè)體的紅細(xì)胞表現(xiàn)很強(qiáng)的熒光信號(hào)，僅極少數(shù)的細(xì)胞表現(xiàn)弱的熒光信號(hào)，這可以解釋當(dāng)使用抗-A1試劑時(shí)出現(xiàn)的混合視野外觀*。在本例，反定型中標(biāo)本血清里額外的抗體與A1型紅細(xì)胞反應(yīng)，出現(xiàn)了陽性4+W，同時(shí)伴有陰性反應(yīng)的混合凝集，說明該抗體特異性的與A1抗原反應(yīng)，但也存在著同以上表述類似的反應(yīng)檢測體系捕捉不到的微弱信號(hào)，這也就印證了Rochant等人的研究結(jié)論，并且為本例樣本的鑒定提供了一個(gè)佐證。

*RochantH,TonthatH,HenriA,etal.Abnormaldistributionof

erythrocytesA1antigensinpreleukemiaasdemonstratedbyanimmunonuorescencetechniclue.BloodCells,1976,2:237-255.

Tel1%-2%的A2型人和22%-26%A2B型人的血清中可能產(chǎn)生抗-A1(在本例即這種情況)，室溫下該抗-A1只凝集A1型紅細(xì)胞(本例反定型)，不凝集A2型紅細(xì)胞(本例用抗-A1試劑鑒定出A2型紅細(xì)胞)。在交叉配血試驗(yàn)中(37℃)，抗-A1能引起一部分A型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞不相容。如果抗體反應(yīng)只發(fā)生在室溫下，一般不會(huì)縮短輸入體內(nèi)紅細(xì)胞的存活期。那么在本例標(biāo)本血清與AB型紅細(xì)胞進(jìn)行交叉主側(cè)配血出現(xiàn)1+W凝集，即標(biāo)本血清抗體在37℃出現(xiàn)了反應(yīng)，該抗-A1抗體應(yīng)定性為臨床有意義抗體，則應(yīng)該給予交叉配血相容的血，即A2B型血，或成份輸血輸入O型洗滌紅細(xì)胞。以保證臨床用血安全。

Tel血前抗體篩查實(shí)驗(yàn)的必要性1.檢測程序：血型檢測不完全抗體的檢測交叉配血2.抗體性質(zhì)：臨床有意義抗體和無意義抗體完全抗體和不完全抗體3.檢測技術(shù)和方法：對(duì)完全抗體的檢測對(duì)不完全抗體的檢測（或應(yīng)用完全抗體的檢測、應(yīng)用不完全抗體的檢測）輸血前血型血清學(xué)檢測要點(diǎn)血型相容性試驗(yàn)可以高度概括為“3項(xiàng)檢測程序，2類抗體檢測技術(shù)，1個(gè)明確目的”?？乖ㄐ?、抗體檢測和交叉配血3項(xiàng)程序是分別進(jìn)行，但實(shí)質(zhì)都是檢測血型抗原抗體。ABO血型以外的同種異型抗體稱之不規(guī)則抗體，其檢測分為篩檢試驗(yàn)和確定性檢測兩步檢測程序，完全抗體和不完全抗體檢測兩類試驗(yàn)技術(shù)。檢測完全抗體以鹽水血凝試驗(yàn)為代表；檢測不完全抗體分為篩檢和確定性檢測技術(shù)，木瓜酶、菠蘿酶、PEG、聚凝胺等都是抗體篩檢技術(shù)，抗球蛋白試驗(yàn)是確定性檢測技術(shù)。目前抗球蛋白試驗(yàn)技術(shù)已能夠簡便、確定性地臨床常規(guī)檢測不完全抗體，故臨床常規(guī)應(yīng)用篩檢試驗(yàn)技術(shù)的必要性越來越小。一個(gè)目的安全輸血被檢者血清中存在ABO系統(tǒng)以外的特異性同種抗體(IgM/IgG)，血型定型時(shí)出現(xiàn)正反定不符。例：臨床標(biāo)本，姓名：魏××

，標(biāo)本離心分離血漿，常規(guī)操作，制備0.8%、4%紅細(xì)胞懸液。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行正反定型，結(jié)果如下：

正定型反定型抗-A抗-B抗-DAc

Bc

－4+4+4+1+P標(biāo)本正定顯示為B型，反定顯示為O型，反定該標(biāo)本血清(血漿)與反定型B細(xì)胞呈現(xiàn)1+P的反應(yīng)格局，正反定型不符。該結(jié)