基因編輯治療行業(yè)研究：生物醫(yī)學的明珠基因編輯逆轉先天缺陷

基因編輯治療行業(yè)研究：生物醫(yī)學的明珠，基因編輯逆轉先天缺陷科學原理：認識DNA——DNA缺陷伴隨一生且可能影響后代什么是DNA？了解基因疾病、遺傳疾病前，首先需要了解致病機理發(fā)生的物質——DNA。脫氧核糖核酸（DNA）是人類存儲遺傳信息的物質。DNA通常由2條DNA鏈形成互相纏繞的雙螺旋結構。DNA的基本組成單位是4種核苷酸：腺嘌呤（Adenine，A）、胸腺嘧啶（Thymine，T）、胞嘧啶（Cytosine，C）、鳥嘌呤（Guanine，G）。每個核苷酸由3部分組成：磷酸基、五碳糖、堿基。4種核苷酸的堿基不同。單個DNA鏈之間的核苷酸由五碳糖和磷酸基之間的共價鍵相連，2個鏈條間則由堿基之間的氫鍵相互吸引，形成雙螺旋結構。2個堿基通過氫鍵相連的現象被稱為堿基配對。堿基配對（basepairing）中A與T配對，C與G配對。DNA如何影響我們？DNA通過蛋白控制影響著身體的活動和表征。DNA轉化為蛋白質的過程分為兩大步，第一步：DNA轉化為mRNA，這一步驟稱為轉錄（transcription），發(fā)生在細胞核內；第二步：mRNA轉化為蛋白質，這一步驟稱為轉譯（translation），發(fā)生在細胞質中。mRNA是DNA轉化為蛋白質的中間體，這也是它名稱的由來，即信使RNA（messengerRNA）。通俗來講，DNA類似于底稿，DNA發(fā)生的改變會一直存在于體內，由此細胞分裂新產生的細胞也會繼承這些改變，因此DNA的改變有很大概率會伴隨一生，其中性細胞中DNA的變化甚至能夠遺傳至下一代。同時部分DNA片段會影響mRNA產生的速率與表達量。mRNA類似于說明書，能夠指導自身細胞生產出特定的蛋白。蛋白則是最終生產得到的工具，對生物個體的各項指標直接產生作用。mRNA或蛋白的變化不會被繼承或遺傳。這一條轉錄轉譯鏈被稱為生物學“中心法則”（TheCentralDogma）。DNA與基因疾病和遺傳性疾病根據美國國家癌癥研究院的定義，遺傳性疾?。╤ereditarysyndrome）通常指部分或完全由具有遺傳性的基因或染色體異常導致的疾病。根據美國國家人類基因研究院的定義，基因疾病（geneticdisorder）指完全或部分由于DNA序列異常導致的疾病。遺傳性疾病和基因疾病雖然不完全相同，但包含了很多重疊的病癥。DNA作為人類遺傳物質的存儲載體，深藏在細胞核中。一方面受到細胞結構和人體免疫機制的層層保護，不易發(fā)生改變；但另一方面，在出現基因異常時，現有的醫(yī)學技術也難以提供有效的治療方案。同時，DNA異常通常會伴隨患者一生，且有很大幾率遺傳至后代。因此，患者疾病負擔大，且缺乏有效的治療手段。除此之外，許多罕見病是由基因缺陷造成的。大部分具有缺陷的基因，會導致基因的攜帶者難以生存。由于基因是遺傳信息載體，因此在長時間的自然選擇中，這類基因難以被繼承，所以許多基因疾病/遺傳疾病都屬于未被滿足的醫(yī)療需求。工程原理：基因編輯——精準定位、永久修正精確定位是基因編輯的核心基因編輯工具使人類擁有了定向改變DNA或RNA的能力。通過插入、刪除、替代特定位點的核苷酸，我們能夠改變基因表達，進而長久地影響蛋白序列或結構。援引發(fā)表在YaleJournalofBiologyandMedicine上的文章“GenomeEditing:Past,Present,andFuture”的內容，歷史上，人類不斷探索能夠改變基因的方式。在20世紀時，人類曾通過化學療法、放射療法改變腫瘤細胞的DNA，擾亂腫瘤細胞的生命活動，以此消滅腫瘤。但這2種方法造成的基因變化是隨機的，且難以精準定位。隨著科學技術的發(fā)展，科學家們發(fā)明了3種重要的基因編輯工具：鋅指（ZFN）、TALEN、CRISPR?，F代基因編輯工具的出現不僅大大加速了科學研究，同時也給許多基因疾病的治療帶來的可能性。精準定位是基因編輯的重要能力，是實現定向編輯的第一步。靶向特定目標序列，而不是在DNA任意位置隨意更改，使基因編輯成為可控的工具，并且規(guī)避不受控的基因突變帶來的風險。不受控制的基因突變或不夠精準的基因修改，常常會帶來無法預測的腫瘤、免疫疾病等惡性病癥。在精確定位的基礎上，一個好的基因編輯工具還應該能夠識別并定位到任意的設定序列。這樣基因編輯才能夠廣泛應用于不同的基因疾病。許多基因疾病是由DNA的錯誤表達或過度表達引起的。通過基因敲除或抑制，便能達到較好的治療效果。因此，僅僅依靠基因編輯工具進行定位，同時引入可控的酶在這一位點進行切割，便能大大緩解乃至治愈這類疾病。目前，大部分體內基因編輯療法便是利用這一機理，對致病基因進行定向敲除，達到治療目的。隨著生物技術的發(fā)展，科學家們已經開始了基因敲入的研發(fā)。相較于基因敲除，基因敲入更為復雜，往往需要基因編輯工具以及基因插入技術（例如病毒載體插入技術）共同完成，因此目前的進展落后于基因敲除療法。但基因敲入帶來了更多治愈疾病的可能性，尤其對于部分由基因過少或缺失表達引起的疾病?；蚓庉媣s.基因治療：基因編輯具有永久有效的潛力雖然名稱相似，但基因編輯（geneediting）與基因治療（genetherapy）有著本質的不同。基因編輯，通過對基因進行改造，糾正錯誤的基因。由于這一改變發(fā)生在原本的基因組中，因此，就算細胞發(fā)生了分裂，這一改變也會被繼承。因此，基因編輯通常被認為具有永久糾正致病基因的潛力。更進一步，若這一改變發(fā)生在性細胞中，則這一改變將可能被后代繼承?；蛑委?，則是通過遞送額外的基因進入細胞，使得細胞能夠額外表達上述基因，但并不改變此前已經存在的基因。新的基因也不會被整合進入原本的基因組中，因此，在細胞發(fā)生分裂后，這一改變也不會被繼承。理論上來講，相較于基因編輯，基因治療的持久性稍差?；蚓庉嫀ьI生物藥物進入新階段人類對生物醫(yī)藥的探索不斷，所掌握的藥物種類不斷豐富。從小分子化學藥到生物藥、核酸干擾藥物（RNAi）、基因治療、基因編輯治療。隨著藥物種類的豐富，治療能夠觸達的靶點也更為廣闊：小分子化學藥和生物藥（單抗、雙抗等）作用于蛋白質，RNAi作用于RNA，基因治療和基因編輯則作用于DNA?；蚓庉嫻ぞ撸篊RISPR推動革新基因編輯TALENTALEN，TranscriptionActivation-LikeEffectorNucleases，是一種限制性酶。通過工程化改造后，具有切割DNA鏈特定位點的能力。TALEN主要分為2個功能域：DNA結合域（DNAbindingdomain）和DNA切割域（DNAcleavagedomain）。DNA結合域負責識別位點，引導切割酶至正確的編輯位點。DNA結合域的核心部分由相連的數個重復的氨基酸序列片段組（tandemaminoacidrepeats）組成，每個氨基酸片段組由33-34個單位的氨基酸構成，每個片段組對應DNA鏈上的1個堿基。每個氨基酸片段組的序列基本相同，除了第12-13個氨基酸不同，這兩個位點被稱為repeat-variablediresidue（RVD）。正因為這2個位置的氨基酸可變，因此通過控制這兩個位置的氨基酸，基因編輯工具可以靶向DNA的4種不同堿基。每個片段組對應1個DNA堿基，數個前后銜接的片段組便可以靶向特定的DNA序列。DNA切割域在DNA結合域的幫助下，來到選定的位點進行切割。FokI內切酶是常見的切割工具。FokI需要形成二倍體（dimer）來進行切割，因此TALEN通常由2條分別靶向DNA正鏈和反鏈的TALEN組成。TALEN將會切割2個靶向序列之間的位置。CRISPRCRISPR，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，來源于細菌和其他微生物。CRISPR是細菌對抗病毒入侵的重要免疫機制，通過識別病毒基因序列，CRISPR可以引導細菌內的生物機制對病毒基因序列進行摧毀和消滅，使病毒無法在細菌體內復制繁殖。CRISPR是細菌基因組內的一片由短小DNA重復片段（回文）和spacer組成的區(qū)域。當某一種類病毒首次入侵時，病毒的部分基因片段會被整合存儲在spacer中。經過轉錄（transcription）和各類蛋白的處理，帶有病毒基因序列的

CRISPRRNA（crRNA）形成，并引導分子切割機制對病毒基因進行切割。由于序列直接由病毒基因復制得到，因此crRNA與病毒基因的識別匹配程度非常高。CRISPR機制賦予了一個可靠的定位機制。在此基礎上，一個完整的基因編輯工具還需要切割機制來對DNA鏈進行切割。自然界中，細菌的CRISPR免疫系統(tǒng)中包含的Cas家族基因（CRISPR-associatedgene）便可以完成這一工作。Cas家族中包含多個不同的基因，擁有不同的功能或切割方式。gRNA負責是CRISPR基因編輯的定位器。gRNA由crRNA和tracrRNA組成。crRNA攜帶有目標序列的RNA。crRNA和tracrRNA形成互補結構，科學家進一步研究發(fā)現，將crRNA和tracrRNA相連，并不影響整體機制的運作和活性。形成的單鏈gRNA（sgRNA）更為便捷。Cas蛋白是負責切割DNA鏈的剪刀。Cas蛋白中，HNH域負責切割靶序列，RuvC域負責切割靶序列的互補鏈。切割位點與PAM序列相關。此前CRISPR無法在哺乳動物細胞中發(fā)揮作用，原因是CRISPR-Cas系統(tǒng)無法穿過核膜進入細胞核。張鋒團隊在Cas蛋白序列上添加了NLS（Nuclearlocalizationsequence），NLS與入核載體相互作用，將Cas運載進入細胞核?；蚓庉嬛委熉窂剑后w內VS.體外基因編輯治療根據基因編輯發(fā)生的場景主要分為2條路徑：體內（invivo）和體外（exvivo）。體內基因編輯指將基因編輯工具遞送進入患者體內，基因編輯發(fā)生在人體內。而顧名思義，體外基因編輯治療中，基因編輯發(fā)生在體外（例如實驗室等），通常需要提取患者細胞，在實驗室中對患者細胞進行基因編輯，再將經工程化改造后的細胞回輸至患者體內。整體流程類似于現有的CART細胞治療。兩條路徑各有優(yōu)勢，也各有不同的技術挑戰(zhàn)。目前來看，采用體外基因編輯路徑的公司相對更多。這一選擇可能是由于體內基因編輯對安全性的要求更高、技術難度更大。體內基因編輯–基因敲除結構與機理體內基因編輯是指將基因編輯工具遞送進入人體，在人體中對致病基因進行編輯處理的治療方式。從編輯方式來看，可分為敲除（knock-out）和敲入（knock-in）兩種模式，也可同時進行敲除和敲入。敲除，顧名思義，即是將某些錯誤表達或過度表達的基因進行抑制，使得患者身體不再繼續(xù)生產錯誤的蛋白。相反，敲入則是將患者缺失的基因遞送進入體內，使患者能夠正常生產之前缺失的蛋白。相較于敲除，敲入的技術難度較高，目前進度也相對滯后。從技術角度來說，敲入包含了敲除所需的所有技術步驟，同時還需要額外的插入技術。因此，本章節(jié)中將主要介紹敲除，在下一章節(jié)簡單介紹敲入。目前這一路徑的領導者是諾貝爾獎得主、UCBerkeley

教授JenniferDoudna作為共同創(chuàng)始人的IntelliaTherapeutics。以Intellia的管線之一NTLA-2002為例，以此窺探體內基因編輯療法的大概原理。NTLA-2002的有效成分由脂質微粒（lipidnanoparticle，LNP）包裹，以內含體（endosome）的形式進入細胞。藥物有效成分主要由2種分子組成：靶向目標基因序列（此處NTLA-2002中，即KLKB1基因）的guideRNA（gRNA），以及編碼Cas9的mRNA。Cas9mRNA在進入細胞質后被核糖體翻譯為Cas9蛋白。Cas9蛋白與gRNA形成結合體，并進入細胞核。gRNA將結合體引導至設定的基因序列，Cas9對其進行切割。由此，致病基因不再能夠產生致病蛋白。永久糾正致病基因由于體內基因編輯直接作用于人體DNA，因此其對基因的糾偏將被存儲于人體的遺傳信息中。細胞分裂后的子細胞將會繼承編輯后的DNA。因此，通過一次高效的基因編輯，致病基因有望永久被糾正。這一特征已在Intellia的兩個產品管線中體現。NTLA-2001，用于治療由轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（ATTR）造成的神經疾病和心肌疾病，只需1次給藥，便可使蛋白淀粉樣沉淀長時間維持較低水平。Intellia表示其有潛力在患者一生的時間內穩(wěn)定抑制TTR（“l(fā)ifelong,stableTTRreduction”）。另一管線，NTLA-2002，用于治療遺傳性血管水腫（HAE），同樣也只需1次給藥，從目前的臨床研究患者跟蹤來看，藥效明顯且持續(xù)。由于1次給藥即可發(fā)揮持久的藥效，基因編輯療法無需冗長繁瑣的療程，有望明顯提高患者的依從性。精確靶向致病源頭由于CRISPR對基因序列的識別具有較高的精度，因此體內基因編輯治療能夠精確靶向致病基因，而不影響人體其他機制的正常工作。LNP遞送已得到驗證體內基因編輯療法的主要作用成份是2種RNA，因此需要進入細胞后才可發(fā)揮作用。目前針對RNA疫苗及藥物，最主要的遞送系統(tǒng)之一便是脂質納米微粒（LNP）。LNP遞送系統(tǒng)在本次新冠mRNA疫苗中已獲得了較為充分的驗證。LNP由4種主要成分構成：可陽離子化脂質（cationicionizablelipid）、中性脂質、膽固醇、PEG。其中，可陽離子化脂質是核心成分，它深刻影響著RNA遞送進入細胞后的釋放。在進入細胞前，可陽離子化脂質在常規(guī)的生理環(huán)境下呈中性。包裹RNA藥物成分的LNP抵達細胞后，以內含體（endosome）的形式進入細胞。由于內含體內部環(huán)境逐漸酸性化（endosomalacidification），可陽離子化脂質質子化（protonate），與中性脂質互相作用，破壞原本LNP以及內含體的結構，使得RNA能夠逃離，進入細胞質內。因此，一個優(yōu)秀的可陽離子化脂質以及LNP結構能夠在藥物進入細胞前穩(wěn)定LNP結構，保護運載的RNA；在進入細胞后，又能夠充分打開包裹，使得RNA能夠充分地釋放到細胞質中，以實現較好的藥效。LNP能夠遞送較大分子量的藥物成分進入細胞。因此，能夠較好地包裹gRNA和Cas9mRNA。LNP具有生物降解性。因其主要構成成分為脂質，可通過人體正常的代謝活動降解，對人體造成的負擔有限。LNP安全性較好。相對于其他遞送系統(tǒng)，例如病毒載體，其本身的免疫原性較低，因此不易引起免疫系統(tǒng)過度反應。LNP規(guī)模化生產相對簡單，放大生產難度低，同時已有mRNA疫苗大規(guī)模生產的產業(yè)經驗。LNP可通過外層結構設計，來靶向特定的器官或細胞種類。除技術方面外，使用LNP目前面臨的一大挑戰(zhàn)是專利問題。目前最常見的規(guī)避專利的方法是自主設計可陽離子化脂質的分子結構。這對研發(fā)團隊在生物化學及分子生物學的素養(yǎng)提出了較高的要求。安全風險仍是重中之重，風險獲益比是適應癥選擇的關鍵由于CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的底層運作必須經過雙鏈斷裂（DSB，double-strandbreaking），而DSB對于基因而言是一個較大的變動，其本身可控性較差，難以預測可能造成的結果，帶來了腫瘤、免疫疾病的風險。相較于體外基因編輯可以通過質量控制來掌控進入人體的編輯產物，體內基因編輯無法進行類似的質量控制，因為體內基因編輯是將編輯工具送入人體內，在人體中完成編輯工作，因此，若出現脫靶事件，錯誤編輯的細胞仍會留在體內。因此，相較于體外基因編輯，體內基因編輯的安全風險更大，這也將是這類療法面臨監(jiān)管審批時最大的挑戰(zhàn)。因此，適應癥的選擇非常重要。在安全性未確定的情況下，未被滿足的醫(yī)療需求，尤其是目前尚未有有效療法，生存期較短和生存概率低的病癥，可能是體內基因編輯治療較好的選擇。體內基因編輯–基因敲入設計和技術原理如上文所述，體內基因編輯相較于體外基因編輯難度更高，而體內基因編輯中，基因敲入比基因敲除難度更高。因此，基因敲入所需掌握的技術復雜，要求高。因此目前進展也落后于其他路徑。從步驟上來看，基因敲除通過CRISPR系統(tǒng)gRNA和Cas在特定位點剪切DNA鏈，造成雙鏈斷裂（DSB），使靶點基因無法正常表達。根據Intellia的設計思路，基因敲入同樣需要CRISPR系統(tǒng)先剪切DNA雙鏈，再通過病毒載體（Intellia目前使用的是腺相關病毒AAV作為載體）在剪切位置插入缺失的基因。因此基因敲入由2個部分組成。第一部分由LNP作為遞送系統(tǒng)包裹用于定位的gRNA和編碼Cas（用于切割）的mRNA，在設定位點進行切割。第二部分由病毒載體作為遞送系統(tǒng)，將患者缺失的基因遞送進入細胞核，并整合進患者基因中。AAV可將希望遞送的基因片段包裹進病毒載體顆粒。病毒載體經細胞表面的受體識別，由內含體（endosome）包裹進入細胞內。進入細胞后，部分病毒顆粒從內含體逃逸至細胞質內，部分病毒顆粒則跟隨內含體到達溶酶體（lysosome）后再逃逸進入細胞質。隨后，病毒顆粒進入細胞核，并褪去外殼，將攜帶的基因釋放出來。在上一步中，gRNA和Cas蛋白已在DNA上的特定位點進行了剪切。細胞的修復機制會試圖將斷裂的DNA重新連接在一起。常見的修復機制有兩種，HDR（homology-directedrepair，同源介導修復）和NHEJ（non-homologousend-joining，非同源末端接合）。實現基因敲入需要HDR修復，而NHEJ無法幫助實現基因敲入。HDR：是最為重要且常見的修復方式，同時也是實現基因敲入所需要的修復方式。HDR通過模版序列來修復斷裂的部分。模版序列可來自另一條姊妹染色體也可來自外部引入的DNA模版。模版序列的特征是擁有和斷裂DNA兩端相同的序列。HDR修復機制會根據模版序列將斷裂部分填補上，因此，若以姊妹染色體作為模版序列，斷裂的DNA將被恢復成原樣；若以外部引入的序列作為模版，修復后的DNA將包含模版中間的序列。因此，設計的序列將在兩端包含DNA斷裂兩側的序列，中間則是希望敲入的基因序列。在通過AAV將序列遞送進入細胞核后，便可作為模版序列供HDR對DNA進行修復，修復后的DNA便包含了希望敲入的基因。NHEJ：作為最主要的DNA雙鏈斷裂的修復方式，本身具有較大的不確定性，在修復后常常會引入不同種類的突變（插入、刪除、替換），因此可能會產生框架漂移，導致錯誤的基因表達。由于基因突變通常會抑制基因的正常表達，因此NHEJ一般能夠在基因敲除中發(fā)揮作用。但在基因敲入方面，則不希望出現NHEJ，因為NHEJ重新連接斷裂DNA的序列是不確定的。HDR修復機制是合適的修復種類，因為HDR可能采用利用AAV病毒載體遞送進來的基因物質作為模板，對斷裂的DNA進行修復。NHEJ是不合適的修復機制。因為NHEJ修復僅僅將斷裂的DNA連接起來，但如何連接是隨機的。NHEJ不僅不會按照AAV遞送的模板基因序列進行修復，還有可能引入其他突變。因此，如何使細胞盡可能多地采用HDR修復，是目前研究的關鍵點之一。DNA修復機制不確定性較高DNA雙鏈斷裂（DSB）的修復具有較高的不確定性。不確定性主要來自2方面：修復方式的選擇和修復方式本身的隨機性。首先，如上文所述，DNA雙鏈斷裂的修復機制主要是HDR和NHEJ。其中，只有HDR有可能實現基因敲入；NHEJ無法實現敲入，相反，NHEJ常常引入更多不確定的突變，例如：插入、刪減、替換，有可能造成框架漂移，引起腫瘤或其他疾病。因此，在CRISPR系統(tǒng)引入雙鏈斷裂后，希望人體盡可能多地使用HDR作為修復方式，并盡量減少NHEJ的發(fā)生。但是，細胞會選擇哪一種修復方式是不確定的，并且，修復方式的選擇受多種因素影響。在一項發(fā)表在Nature的研究中，來自Bio-Rad和UCSF的團隊試圖量化HDR和NHEJ發(fā)生的比例，并找到增加HDR、減少NHEJ的變量。研究發(fā)現，影響HDR和NHEJ發(fā)生比例的因素多種多樣，例如基因編輯工具的種類、Cas蛋白的選擇、gRNA的組合、方向、細胞種類、編輯位點等，都會對HDR和NHEJ的占比產生影響。因此，針對不同適應癥、不同基因位點、不同細胞種類，基因敲入治療所需的gRNA、Cas蛋白、AAV序列等成分均需要新設計，同時進行排列組合，找出最佳搭配。在初始階段，這一過程需要大量的實驗驗證，研發(fā)時間長，因此，如果能夠成功，行業(yè)領軍者將獲得明顯的先發(fā)優(yōu)勢護城河。當實驗數據的積累足夠充分后，后續(xù)的研發(fā)有望逐漸提速，因此，先發(fā)者的先發(fā)優(yōu)勢將有可能逐漸擴大。不確定性還來自于HDR機制本身。雖然相較于NHEJ，HDR被認為是較為精準、不易出錯的修復方式，但仍有可能因為基因重組反應（recombination）產生突變。綜合以上兩點，對于基因敲入至關重要的修復機制卻有不可忽視的不確定性，這對于最終基因編輯能否正確成功完成提出了挑戰(zhàn)。AAV設計復雜，運載能力有限。AAV，Adeno-associatedvirus，腺相關病毒，是一種單鏈DNA病毒。自然界中，AAV在許多脊椎動物中被發(fā)現，但目前普遍認為AAV并不會引起人類疾病。AAV衣殼呈二十面體，直徑約26nm，AAV的基因組由正向或反向的單鏈DNA構成，長度約4.7kb，這也基本決定了AAV被改造為遞送載體后它的載荷大致在這一水平。AAV基因組兩側分別有1個ITR（invertedterminalrepeat）作為側翼，ITR呈T形，在病毒復制與包封過程中起重要作用。AAV作為載體時，將編碼病毒蛋白的基因組去除，并用遞送的基因序列代替。AAV的載荷在4.7kb左右，這其中除希望表達的基因外，部分情況下還包含調節(jié)表達的序列，例如啟動子（promoter）。因此，AAV能夠遞送的基因材料相對有限。人體免疫屏障可能降低AAV遞送效率AAV遞送可能會受到多種、多層人體免疫系統(tǒng)的抵抗，導致遞送效率降低。中和抗體：感染自然腺相關病毒后產生的中和抗體在人體中循環(huán)。中和抗體能夠識別AAV類病毒的衣殼，因此不僅靶向自然AAV，也靶向重組AAV。目前，有研究團隊正在探索衣殼改造的方法，以規(guī)避免疫系統(tǒng)的檢驗，但目前還處于早期階段。除此之外，也有空衣殼誘餌、血漿去除等其他策略正在研究中。另外，病毒衣殼還有可能誘導T淋巴細胞（CytotoxicTlymphocyte，CTL）免疫，AAV成功轉化的細胞將可能受到攻擊，導致成功進行了基因編輯的細胞被殺死。雖然相較于其他病毒載體（例如腺病毒載體），AAV誘導的CTL強度較低，但仍然影響整體遞送效率和基因編輯治療的有效性。體內基因編輯特點1：體內基因編輯有望實現“一次給藥，永久治愈”。特點2：相較于體外，體內基因編輯對技術的精準性和可靠性要求更高，因為基因編輯發(fā)生在人體內，所以無法通過質量控制環(huán)節(jié)篩除編輯失敗的細胞。特點3：體內基因編輯主要可分為基因敲除和基因敲入。其中基因敲入環(huán)節(jié)更多，需要掌握的技術也更多，目前基因敲入進展也較慢，尚未有產品進入臨床階段。特點4：基因敲除通常使用LNP遞送系統(tǒng)運輸CRISPR編輯工具進入體內，基因敲入不僅需要LNP遞送編輯工具，還需要遞送修復模版（通常使用病毒載體AAV作為遞送系統(tǒng)）。特點5：這一細分市場，參與者較少。目前IntelliaTherapeutics擁有較明顯的領跑優(yōu)勢。體外基因編輯體外基因編輯助力細胞治療相較于體內編輯，體外基因編輯是競爭者較多的細分賽道。主要原因是體外基因編輯可以通過質量控制保證基因編輯的質量，將不達標的細胞去除，從安全性的角度來看更為可靠，也更容易被監(jiān)管機構所接受。從某個角度來說，體外基因編輯是利用基因編輯工具賦能細胞治療。目前的細胞治療，受制于細胞免疫機制，以自體型為主。但自體型細胞治療的缺陷也較為明顯：首先，由于所有細胞均來自于患者自身，因此成本較高，也無法規(guī)模生產，導致價格一直居高不下。第二，由于每個患者接受的細胞治療都是個體化產品，因此制備所需時間較長。同時，治療過程較為繁瑣，對患者的生理和心理的消耗較大。由于自體型細胞治療有著上述的種種缺陷，通用型（Allogeneic）細胞治療吸引了大量關注。相較于自體型細胞治療，通用型細胞治療的優(yōu)勢在于：可以提前制備，不需患者等待。環(huán)節(jié)減少，不需要從患者體內提取細胞，減少患者負擔。產品一致性更佳，因此有望實現規(guī)模化生產，成本可能降低。但挑戰(zhàn)也隨之而來，自體型細胞治療最大的障礙便是降低免疫排異反應。多種人體免疫機制限制細胞治療排異反應來自多個人體免疫機制，例如T細胞和NK細胞（與HLA基因相關）。同時，若輸注的治療細胞量較大的話，輸注細胞可能會對人體細胞產生排異（與TCR相關）（GvHD）。基因編輯改造細胞，盡量避免不需要的免疫機制通過基因編輯，盡量干擾或阻斷引起排異反應的信號通路。Intellia在此提供了一些可能的改進思路。例如：通過敲除治療細胞的TCR來避免移植物排斥宿主病（GvHD）；通過基因敲入引入CAR或TCR來增強細胞對腫瘤的殺傷；敲除II型HLA基因來避免CD-4介導的排異反應；敲除HLA-A來避免CD-8介導的排異反應；調整HLA-B和HLA-C來避免NK細胞介導的排異反應CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產品設計也遵循類似的設計理念：通過敲除β2M來去除MHC1的表達，使CAR-T細胞不容易被患者的免疫系統(tǒng)識別；通過干擾TCR的表達，使CAR-T細胞不再排斥患者體內的細胞；利用CRISPR技術，將CAR序列精準插入至TRAC位點，提高一致性和安全性?；蚓庉嫺脑旒毎訌妼δ[瘤細胞的殺傷力通過基因編輯，除了可以干擾或阻斷引起排異反應的信號通路，也可以增強治療細胞的有效性。CRISPRTherapeutics第二代體外基因編輯產品是針對腫瘤的一款細胞治療，產品設計在第一代基礎上繼續(xù)改進：通過干擾Regase-1的表達，使細胞素分泌增加，增強對腫瘤細胞的毒性；敲除TGFBR2，使CAR-T細胞對腫瘤細胞分泌的TGF-β不再敏感，加強殺傷。CRISPRTherapeutics第一代體外基因編輯產品的設計主要利用基因編輯技術增強了產品的安全性，避免不必要的免疫排斥。第二代體外基因編輯產品設計在第一代基礎上的改進主要是為了增強工程細胞對腫瘤細胞的殺傷力。對不同基因的編輯，給細胞治療帶來了更大的設計空間，更多的改進方向。尋找合適的策略和編輯位點，考驗研發(fā)機構對細胞機制的理解水平基因編輯提供了有力的改進細胞治療的方法和工具箱。如何利用好基因編輯，使基因編輯發(fā)揮最大的效益，考驗研發(fā)團隊對細胞機制的理解水平。CRISPRTherapeutics提供了一個范例。CRISPRTherapeutics的研發(fā)人員們發(fā)現，CAR-T細胞不需過長的體內留存時間。CAR-T細胞在人體內的PK特征呈現較明顯的3個階段。第一階段CAR-T細胞尋找腫瘤所在的靶點；第二階段CAR-T細胞開始擴增，攻擊腫瘤細胞；第三階段，CAR-T細胞被自身免疫系統(tǒng)清除。研究發(fā)現CAR-T細胞進入體內后便內快速響應，一般不需留存28天便能實現持續(xù)的病情緩解。此外，NK細胞未在腫瘤處聚集，意味著繼續(xù)降低CAR-T免疫原性的收益不高。因此，研發(fā)團隊轉向尋找提高有效性的方案。體外基因編輯特點特點1：相較于體內，體外基因編輯安全性、可控性更佳。特點2：許多體外基因編輯管線可以看作是細胞治療的升級，是使用基因編輯技術賦能細胞治療，改善治療細胞的免疫原性、提高安全性、增強針對腫瘤細胞的殺傷力（若適應癥為癌癥）。特點3：針對不同適應癥，可進行不同的設計，使治療細胞的不同能力得到加強。特點4：基因編輯提供了大量細胞治療升級的可能性，但哪些方向、策略最有價值，非?？简炑邪l(fā)團隊對細胞機制的理解和積累。AI在其中可能能夠提升篩選效率。特點5：CRISPRTherapeutics與Vertex合作開發(fā)的Exa-cel有望成為首個獲批的基因編輯療法。該產品用于治療TDT和SCD的上市申請已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。Exa-cel已獲得FDA授予的RMAT、快速通道、孤兒藥認證，和EMA授予的優(yōu)先藥物（PRIME）認證。全球研發(fā)進展案例1：NTLA-2001——體內基因編輯-基因敲除NTLA-2001是IntelliaTherapeutics目前進展最快的管線之一。NTLA-2001用于治療由轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（TransthyretinAmyloidosis，ATTR）引起的疾病。目前已開展了2項臨床I期研究，分別針對由ATTR引起的多發(fā)性神經疾病和心肌疾病。ATTR病癥及患者規(guī)模：疾病負擔沉重及醫(yī)療需求未被滿足的罕見病ATTR蛋白淀粉樣變性是由于錯誤折疊的轉甲狀腺素蛋白不斷積累產生的。ATTR主要影響神經及心臟功能。根據Intellia官網2023Q1CorporateOverview信息，全球范圍內，受遺傳性ATTR困擾的患者規(guī)模約50000人，野生型ATTR患者20-50萬人。ATTR伴隨心肌疾病患者診斷后的預期生存周期約2-7年，ATTR伴隨多發(fā)性神經疾病患者的預期生存期約10年。ATTR可能引起多種不良反應，例如心衰、呼吸困難、虛弱、知覺喪失等，且治療通常需要延續(xù)一生，疾病負擔較重。研究證明TTR基因表達的抑制，可以改善ATTR引起的多發(fā)性神經疾病的癥狀。此前，FDA批準的首個siRNA藥物Patisiran（商品名Onpattro，由Alnylam公司研發(fā)）通過小核酸干擾機制抑制TTR蛋白的表達，改善了患者癥狀。在Patisiran的研究中，研究者發(fā)現改良神經病變損傷評分mNIS+7與轉甲狀腺素水平有著密切聯(lián)系。目前全球對于ATTR的治療手段非常匱乏。在2017年FDA批準siRNA藥物Patisiran上市前，幾乎沒有有效藥物，只能通過肝臟移植以及僅在部分國家獲批的氯苯唑酸進行治療。ATTR是一種典型的醫(yī)療需求未被滿足的罕見病。近年來，FDA陸續(xù)批準了Onpattro、Amvuttra、Tegsedi、Vyndamax、Vyndaqel用于ATTR引起的不同病癥。但上述藥物價格都較為昂貴。臨床設計Intellia的NTLA-2001已進入臨床I期研究，這是一項針對2項適應癥進行的開放標簽、多中心研究。研究分別對藥物在遺傳性ATTR引起的多發(fā)性神經疾?。ˋTTRv-PN）和ATTR引起的心肌疾?。ˋTTR-CM）的治療展開了探索。兩個適應癥的給藥方式均采取1劑次靜脈注射（IV）。兩個適應癥的研究均分為兩個部分，第一部分為單劑次劑量爬坡，第二部分為劑次擴張（以第一部分研究后選定的劑量為基礎）。主要臨床終點為安全性、耐受性、PK及PD，對血清TTR水平進行監(jiān)測。次要臨床終點分別對神經功能和心臟類疾病進行監(jiān)測評判。針對ATTRv-PN多發(fā)性神經疾病，單劑量爬坡研究設置的劑量組分別為1.0mg/kg、0.7mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg。次要臨床終點中的評判標準為NIS（神經損傷評分，neuropathyimpairmentscore）和mNIS+7（改良神經損傷評分+7，modifiedNIS+7）。針對ATTR-CM心肌疾病，單劑量爬坡研究中，研究者根據NYHA分類將患者分為3個組別：針對I型/II型患者給藥0.7mg/kg、針對III型患者給藥0.7mg/kg、針對I型/II型患者給藥1.0mg/kg。次要臨床終點的評判中包含了心電圖、生物標記物、心肺測試、6分鐘行走測試。安全性：不良反應概率較高，但大部分不良反應較輕NTLA-2001在兩項適應癥的研究中均出現了較高的不良反應概率。在針對多發(fā)性神經疾?。ˋTTRv-PN）的研究中，所有15個受試者均出現了不良反應，其中1級不良反應73.33%（11/15），2級不良反應13.33%（2/15），3級不良反應13.33%（2/15）。按劑量組來看，2級和3級不良反應案例均出現在0.7mg/kg和1.0mg/kg兩個高劑量組，兩個低劑量組（0.1mg/kg、0.3mg/kg）出現的不良反應均為1級。在針對心肌疾?。ˋTTR-CM）的研究中，在共12人的受試者中9人（75%）出現了不同程度的不良反應，其中，共2級不良反應出現概率16.67%（2/12）和3級不良反應8.33%（1/12）。不良反應的出現概率、程度、以及具體原因仍舊需要繼續(xù)觀察。有效性：TTR抑制明顯且持久NTLA-2001在有效性方面顯示出令人興奮的競爭力?；颊咴诮邮躈TLA-2001治療后，體內TTR水平受到明顯抑制，并且目前已有數據顯示藥效持續(xù)時間長。在對多發(fā)性神經疾?。ˋTTRv-PN）的研究中，除最小劑量組0.1mg/kg外，其他劑量組（0.3、0.7、1.0mg/kg）均在給藥后1個月內實現TTR降低80%以上，并且抑制作用持久。截至2022年6月24日，0.3mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時間已到達給藥后12個月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第12個月時平均抑制效果約89%。0.7mg/kg劑量組（n=3）跟蹤時間到達給藥后6個月，期間TTR平均抑制效果保持在80%以上，第6個月時平均抑制效果約87%。1.0mg/kg劑量組（n=6）中有3位受試者跟蹤時間到達9個月，其余3人到達6個月；期間TTR平均抑制效果90%以上，第6個月、第9個月時平均抑制效果均在93%左右。所有劑量組在給藥后1個月內，TTR抑制水平便已接近峰值，并且一直穩(wěn)定在峰值附近。在針對心肌疾?。ˋTTR-CM）的研究中，NTLA-2001也顯示出良好的有效性。在所有三個干預組中，所有受試者的血清TTR水平在給藥后的第28天均下降了90%以上，并且維持在這一穩(wěn)定水平。截至2022年11月5日，NYHAI/II型患者接受0.7mg/kg的受試組到達給藥后6個月時間點，第6個月TTR平均抑制效果約93%，另外兩個組別到達給藥后4個月時間點，TTR平均抑制效果92%、94%。案例2：NTLA-2002——體內基因編輯-基因敲除NTLA-2002是IntelliaTherapeutics另一條已進入臨床研究階段的管線。NTLA-2002用于治療遺傳性血管水腫（HereditaryAngioedema，HAE）。目前已開展了2項臨床I期研究，分別針對由ATTR引起的多發(fā)性神經疾病和心肌疾病。HAE病癥及患者規(guī)模：隨機發(fā)病且可能導致致命后果的醫(yī)療需求未被滿足的罕見病HAE臨床表現為反復的、嚴重的、身體隨機部位的腫大。HAE對某些部位或器官的攻擊是非常危險的，例如咽喉部位的腫大可能導致窒息。HAE發(fā)病時間、部位隨機，嚴重時可導致住院或死亡。未經治療的患者，平均7-14天便會受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。全球范圍內，平均每50000人中有1個HAE患者。美國與歐洲HAE患者超15000人。根據Intellia援引的GlobalData2022和Redbook2022數據，2026年全球市場空間可能達到40億美金。美國目前已有的預防性治療的年化治療費用約50萬美金。HAE疾病病理及NTLA-2002機制KLKB1基因對Kallikrein（激肽釋放酶血管舒緩素）的水平起著重要作用，而Kallikrein對HMWKininogen（HMW激肽原）轉化Bradykinin（緩激肽）起促進作用。緩激肽是一種血管擴張劑，緩激肽過高可能引起水腫。NTLA-2002通過抑制KLKB1基因表達，控制緩激肽的水平，降低血管擴張造成的水腫的風險。臨床設計NTLA-2002臨床I期研究是一項開放標簽的單劑量爬坡研究，分為3個劑量組：75mg（3人）、50mg（4人）、25mg（3人）。主要研究終點為安全性、耐受性，其他研究終點是PK、PD、有效性（發(fā)病數）。臨床II期研究是一項對推薦劑量進行確認的擴展隨機研究。分為3組：推薦劑量組1（10人）、推薦劑量組2（10人）、安慰劑組（5人）。主要研究終點是有效性（16周內發(fā)病數），其他研究終點包括PD、PK、安全性和耐受性、QoL生活質量。安全性：未出現重度不良事件研究證明了NTLA-2002的安全性和耐受性。所有劑量組中，最常出現的不良反應是注射相關反應和疲憊。所有不良反應均為輕度（n=5）或中度（n=2）。所有不良反應均自行緩解。未出現緊急嚴重不良反應（emergentSAE）或三級及以上治療期不良反應（TEAE）。有效性：TTR抑制明顯且持久受試者接受NTLA-2002給藥后，所有劑量組患者血清中Kallikrein水平明顯下降。所有劑量組給藥后28天內，基本已達到最大抑制效果。25mg組抑制水平大約64%，75mg組抑制水平約92%，50mg組給藥后時間較短，尚不能確定抑制水平。更值得注意的是，NTLA-2002帶來了顯著的臨床癥狀改善。實驗時間較長的25mg組和75mg組患者在給藥后發(fā)病頻率明顯下降。25mg組中，患者在給藥后16周內，平均發(fā)病頻率降低91%；75mg組這一數據為78%。案例3：NTLA-3001——體內基因編輯-基因敲入NTLA-3001是IntelliaTherapeutics進展最快的基因敲入管線，公司表示預計將在2023年下半年向FDA提交IND申請。Intellia目前布局了2條路徑，靶向AATD疾病。a)NTLA-3001：插入功能正常的SERPINA1基因，使A1AT蛋白持續(xù)正常表達。主要為解決AATD相關的肺疾病。b)NTLA-2003：敲除突變的SERPINA1基因，減少并防止錯誤的A1AT蛋白累積。主要解決AATD相關的肝疾病。AATD病癥及患者規(guī)模：可能致命的疾病負擔較重的遺傳性罕見病AATD，Alpha-1AntitrypsinDeficiency，胰蛋白酶缺乏癥。是一種以血清中Alpha-1抗胰蛋白酶水平下降為主要特征的常染色體共顯性遺傳病。與新生兒肝炎、嬰幼兒和成人肝硬化、肺癌、肺氣腫等關系密切。發(fā)病時間、部位隨機，嚴重時可導致住院或死亡。未經治療的患者，平均7-14天便會受到HAE攻擊發(fā)病。HAE伴隨一生，目前的治療方法也需持續(xù)一生。美國AATD患者超60000人，全球約25萬AATD患者。亞洲發(fā)病率較低，較為罕見。臨床前研究顯示，敲入基因能夠成功穩(wěn)定表達在非人類靈長類（non-humanprimate，NHP）的臨床前研究顯示，基因敲入后，人A1AT（hA1AT）表達穩(wěn)定，即使在猴（Cyno）A1AT（cA1AT）基因被敲除后，cA1AT水平出現明顯下滑，但hA1AT表達仍舊基本穩(wěn)定在同一水平，說明敲入的hA1AT基因正在持續(xù)表達，并且不受cA1AT敲除的影響。在嚙齒動物的臨床前研究顯示，敲入人FIX（hFIX）基因后，效果在12個月觀察期中持續(xù)存在，證明基因編輯的效果已經被攜帶在正常的細胞循環(huán)中（與之相反，傳統(tǒng)藥物或治療帶來的效果會隨時間遞減，并逐漸消失）。隨后，研究團隊進行了部分肝臟切除（PHx），以探究基因編輯是否也會被攜帶進再生細胞中。研究結果顯示，基因編輯的效果能夠被再生細胞繼承，對照組基因治療則無此能力。研究顯示，傳統(tǒng)的基因治療在肝臟部分切除后，敲入的基因表達明顯下降（第54天表達下降85%，第85天下降95%）。而基因編輯治療后，即使經過肝臟部分切除，基因表達仍然明顯，且較為穩(wěn)定。說明基因編輯敲入的基因已被保存于動物模型的基因組中，有可能已實現了永久敲入。案例4：Exa-cel（CTX-001）——體外基因編輯Exa-cel是CRISPRTherapeutics與Vertex聯(lián)合研發(fā)的體外基因編輯療法，也是目前進展最快的基因編輯管線，公司表示該產品用于治療TDT和SCD的上市申請已于2023年1月獲EMA受理，于2023年4月3日完成了向FDA提起的BLA。適應癥及患者規(guī)模：為遺傳性血液疾病的治愈帶來曙光Exa-cel的適應癥為Beta地中海貧血（β-thalassemia）、鐮狀細胞性貧血（sicklecelldisease，SCD）。地中海貧血患者在出生后癥狀可能會進行性加重，并有可能由于嚴重貧血、心力衰竭、營養(yǎng)不足及感染導致死亡。鐮狀細胞癥可能會造成血管阻塞導致器官功能障礙，可能表現為疼痛危象、肝脾進行性腫大、組織缺氧、炎癥等。BCL11A基因位于2號染色體上。BCL11A會抑制新生兒血紅蛋白（fetalhemoglobin，HbF）的形成。新生兒血紅蛋白HbF能夠改善上述疾病的癥狀。通過體外基因編輯，研發(fā)團隊對CD34+HSPC細胞中紅細胞（erythroid）特異的BCL11A基因的加強子（enhancer）進行抑制，以此得到改造后的細胞并給患者進行回輸。Exa-cel的治療流程與CAR-T治療類似，預計定價較高。首先需要對患者進行預前篩查，并收集患者自身的血液干細胞。而后，這些干細胞被送至生產中心進行基因編輯改造，以及安全性檢查，質控通過后冷凍儲藏。同時，患者接受輸注前的準備性化療，通常使用白消安（Busulfan，二甲磺酸丁酯）。化療結束后，患者接受治療細胞的輸注、移植。出院后持續(xù)進行跟蹤，了解預后情況。本質上，Exa-cel是一個升級版的細胞治療產品。預計Exa-cel成本較高，定價也可能較昂貴。由于Exa-cel也是個體化方案，因此估計成本較高，定價可能會參考現有的CAR-T細胞治療產品療法。臨床設計Exa-cel針對TDT和SCD分別開展了臨床研究。2項研究均取得了令人興奮的數據，并顯示Exa-cel能夠給患者帶來臨床獲益。有效性研究顯示Exa-cel能夠降低TDT患者對血液輸注的需求以及SCD患者發(fā)生血管閉塞危象的概率。在針對TDT適應癥的研究中，受試者接受exa-cel治療后，42/44患者已停止輸注紅細胞。其中持續(xù)時間最長的已有36.2個月沒有進行輸注。2位還未停止輸注的患者，所需輸注的紅細胞量已明顯減少，分別下降了75%、89%。在針對SCD適應癥的研究中，接受exa-cel治療后，所有31個患者均未出現血管閉塞危象VOC，其中持續(xù)時間最長的已有32.3個月未出現VOC。盡管機理尚不完全清晰，HbF能夠對TDT和SCD引起的貧血起到改善作用。Exa-cel治療后，TDT或SCD患者的HbF均有提升。Exa-cel治療后，含HbF的細胞比例明顯提升，TDT組由基線的約10%提升至90%-100%區(qū)間，SCD組由基線的約20%提升至90%-100%。且提升后比例穩(wěn)定維持在高位區(qū)間，TDT組最長觀察期已達36個月，SCD組30個月。同時基因編輯已反映在骨髓（bonemarrow，CD3