產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及酶解產(chǎn)物鑒定

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及酶解產(chǎn)物鑒定譚海剛;李靜;趙祥穎【摘要】幾丁質(zhì)酶是一種專一性降解幾丁質(zhì)的水解酶.在工業(yè)上，幾丁質(zhì)酶可用于制備功能性甲殼低聚糖.結(jié)合平板透明圈法和搖瓶發(fā)酵測(cè)酶活力的方法，從土壤中篩選到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株L012,酶活力為0.75IU/mL;采用離子色譜法對(duì)菌株L012產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步確定產(chǎn)物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖以及聚合度小于10的寡糖.【期刊名稱】《糧油食品科技》【年(勤期】2013(021)002【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P65-67)【關(guān)鍵詞】幾丁質(zhì);幾丁質(zhì)酶;幾丁寡糖【作者】譚海剛;李靜;趙祥穎【作者單位】山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室仙東濟(jì)南250013【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】TS201.3幾丁質(zhì)酶專一性降解幾丁質(zhì)，水解得到的幾丁寡糖、幾丁二糖或N-乙酰葡萄糖胺在食品及藥物方面有廣泛的用途。幾丁質(zhì)酶(chitinase,EC3.4.1.14)的酶源相當(dāng)豐富，自從Benecke[1]首次報(bào)道分離到幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌以來(lái)，發(fā)現(xiàn)微生物中細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母及某些病毒都能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。不同來(lái)源的微生物的酶

系有所不同，酶學(xué)性質(zhì)差異較大。一般微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶系含有外切幾丁質(zhì)酶、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)二糖酶等。本文采用平板透明圈法和搖瓶發(fā)酵相結(jié)合的方法從土壤等樣品中篩選到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，并用離子色譜法對(duì)該菌株酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分析、鑒定。1材料與方法1.1土樣采自山東沿海等地區(qū)的土樣。1.2主要試劑膠體幾丁質(zhì)(Colloidalchitin):按SunChulKang［2］的方法制備，細(xì)粉幾丁質(zhì):濟(jì)南海得貝公司，DNS試劑:參照文獻(xiàn)［3］，磷酸緩沖液:參照文獻(xiàn)［4］,其他試劑均為分析純。1.3培養(yǎng)基1.3.1富集培養(yǎng)基1.3.1富集培養(yǎng)基細(xì)粉幾丁質(zhì)2.5g/l,MgSO4?7H2O0.5g/l,K2HPO40.7g/l,KH2PO40.3g/l,FeSO4?7H2O0.01g/l,pH7.0~7.2,121°C滅菌20min。1.3.2平板分離培養(yǎng)基膠體幾丁質(zhì)2.5g/l,K2HPO40.7g/l,KH2PO40.3g/l,MgSO4-7H2O0.5g/l,FeSO4?7H2O0.01g/l,瓊脂15g/l,pH7.0,121C滅菌20min。1.3.3斜面培養(yǎng)基［4］。參考文獻(xiàn)［4］1.3.4搖瓶篩選培養(yǎng)基細(xì)粉幾丁質(zhì)10g/l,蛋白腺5g/l,酵母膏5g/l,K2HPO40.7g/l,KH2PO40.3g/l,MgSO4?7H2O0.5g/l,FeSO4?7H2O0.01g/l,ZnSO40.01g/l,pH7.0,1211滅菌20min。1.4培養(yǎng)方法1.4.1富集培養(yǎng)30mL富集培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，滅菌后接入土樣，30°C、180r/min搖瓶培養(yǎng)24h，得到富集的菌液。1.4.2平板透明圈篩選將富集培養(yǎng)液過(guò)濾，梯度稀釋至適當(dāng)濃度，吸取0.2mL稀釋液涂布于平板，30C培養(yǎng)4-7d,觀察、挑取產(chǎn)透明圈菌株，移接于合適的斜面。1.4.3搖瓶復(fù)篩30mL搖瓶篩選培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，1支接3瓶接入1~2環(huán)復(fù)篩菌株斜面菌種，30C、180r/min振蕩培養(yǎng)3-4d,發(fā)酵液離心得粗酶液，測(cè)定酶活力，選取產(chǎn)酶活力高的菌株。1.5酶活力分析方法1.5.1透明圈與菌落直徑比直接量取透明圈及菌落的直徑，計(jì)算比值。1.5.2幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定參考文獻(xiàn)［5］。酶活單位定義:在酶促反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1pmolN-乙酰氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位(IU)。1.6酶解產(chǎn)物制備稱取10g細(xì)粉幾丁質(zhì)，用磷酸緩沖液配制成濃度為10%的懸濁液，按照1：1(V/V)的比例加入粗酶液，45C反應(yīng)4h，然后將酶解液3000r/min離心10min，取上清液，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，放置過(guò)夜，離心去除沉淀，上清液減壓濃縮至還原糖濃度達(dá)1%［6］。1.7酶解產(chǎn)物分析離子色譜法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析。流動(dòng)相：10mMNaOH，淋洗液:200mMNaOH，柱子:PA-20糖柱，標(biāo)準(zhǔn)樣:1mg/mL氨基葡萄糖溶液，1mg/mLN-乙酰氨基葡萄糖溶液。2結(jié)果與分析2.1產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株篩選結(jié)果結(jié)合透明圈方法和搖瓶發(fā)酵測(cè)酶活力的方法，對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株篩選結(jié)果見(jiàn)表1。表1菌株篩選結(jié)果菌號(hào)菌落特征菌類直徑比(透明圈/菌落)酶活(IU)B001濕潤(rùn)，邊緣整齊細(xì)菌1.560.24F039淺綠色孢子，絮狀霉菌1.120.21F048粉紅色，絨狀霉菌1.230.16F104暗綠色，蓬松絮狀霉菌1.150.26B006黃綠色，濕潤(rùn)，小細(xì)菌1.320.18B289濕潤(rùn)，圓形菌落細(xì)菌1.410.22L010產(chǎn)紫色色素，孢子微綠放線菌1.840.22L011白色，菌落小，不易挑起放線菌2.080.48L012黃色，皮革狀皺褶放線菌2.150.75L411褐色，皺褶放線菌1.740.38F382孢子黑色霉菌1.330.14表1顯示:菌株L012產(chǎn)酶活力達(dá)0.75IU，明顯優(yōu)于其他菌株。2.2菌株L012的菌落特征及發(fā)酵產(chǎn)酶特性將菌株L012點(diǎn)種到高氏I號(hào)平板培養(yǎng)基上，301培養(yǎng)2~3d時(shí)菌落小，呈土黃色，表面光滑、邊緣整齊，微突起，似細(xì)菌菌落，但是不透明，用接種針挑取時(shí)發(fā)現(xiàn)菌落與培養(yǎng)基結(jié)合非常緊密，難以挑取;培養(yǎng)5~7d時(shí)，菌落變成橙黃色，不規(guī)則型，表面有明顯的皺褶，呈皮革狀，疏松易挑取。根據(jù)菌落特點(diǎn)初步判斷其為放線菌。在以幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的形態(tài)及形成透明圈的情況見(jiàn)圖1。圖1菌株L012菌落形態(tài)及形成的透明圈液體培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酶進(jìn)程見(jiàn)圖2。圖2菌株L012生長(zhǎng)及產(chǎn)酶進(jìn)程圖2表明:菌株L012增殖速度快，在培養(yǎng)30h時(shí)菌體就開(kāi)始大量產(chǎn)生和分泌胞外幾丁質(zhì)酶，發(fā)酵48h可以達(dá)到產(chǎn)酶高峰，在48-72h內(nèi)酶活力保持不變。2.3菌株L012酶解產(chǎn)物的初步鑒定采用離子色譜法分析酶解樣品，標(biāo)準(zhǔn)糖和酶水解糖的產(chǎn)物分析結(jié)果分別見(jiàn)圖3~圖6。圖3氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣(1mg/mL)的離子色譜圖譜顯示:溶劑保留時(shí)間為1.37min,氨基葡萄糖保留時(shí)間在6.56min;圖4N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣(1mg/mL)的離子色譜圖譜顯示:乙酰氨基葡萄糖保留時(shí)間為9.46min。圖5水解糖對(duì)照體系圖譜顯示:該體系中物質(zhì)成分較復(fù)雜，受聚糖和酶液兩種成分的影響，除在1.4min出現(xiàn)的溶劑峰外，在2.5、3.16、6.4、7.9min時(shí)也有明顯的峰出現(xiàn)，但是峰值都不高。(對(duì)照的制作:滅活的酶液加入反應(yīng)底物幾丁聚糖中，與測(cè)酶活力時(shí)一樣將該體系在45°C保溫10min，然后離心得到產(chǎn)物，將該產(chǎn)物進(jìn)行離子色譜分析。)圖6菌株L012酶解產(chǎn)物的離子色譜圖譜顯示:制得的酶解產(chǎn)物體系中成分多樣，除去在1.3min的溶劑峰外，在2.6、3.26、6.6、7.96、8.46、8.93、9.8、11.56、12.5min等時(shí)間有較明顯的峰;與圖3~圖5對(duì)照、比較，可以認(rèn)為在2.6、3.26min的峰與圖5中的酶反應(yīng)對(duì)照體系中出峰保留時(shí)間一致，為酶液與聚糖的混合物所攜帶；6.6min時(shí)的出峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣氨基葡萄糖的出峰時(shí)間基本一致，證明酶的水解產(chǎn)物中含有氨基葡萄糖；9.8min出峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣乙酰氨基葡萄糖的出峰時(shí)間保持一致，證明了產(chǎn)物中有乙酰氨基葡萄糖存在;缺乏寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，難以準(zhǔn)確地判斷在7.96、8.46、8.93、11.56、12.5min等時(shí)間的峰具體成分。但是因?yàn)樵陉庪x子交換柱中，糖類對(duì)陰離子交換固定相的親和力按下列順序增加：糖醇〈單糖〈寡糖〈多糖，即大分子糖的保留時(shí)間大于小分子的保留時(shí)間。本文根據(jù)糖在柱中保留時(shí)間的相對(duì)長(zhǎng)短，推測(cè)后面的峰為聚合度大于等于二的幾丁寡糖或殼寡糖。根據(jù)這一推測(cè)判斷該酶具有內(nèi)切酶活性。3結(jié)論3.1篩選結(jié)果通過(guò)以幾丁質(zhì)為唯一碳氮源的選擇性平板篩選培養(yǎng)基的初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，獲得—株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較高的菌株L012，酶活力0.75IU/mL。3.2產(chǎn)物鑒定采用離子色譜法對(duì)菌株L012所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明菌株L012的酶解產(chǎn)物中含有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖、各聚合度的寡糖?？梢耘袛啾疚膱?bào)道的幾丁質(zhì)酶具有內(nèi)切酶活性。參考文獻(xiàn)：[1]李靜，趙祥穎，劉建軍.微生物幾丁質(zhì)酶及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用[J].食品工程，2006,(1):47-48.[2]SunChulKang,SanggyuPark,DongGyuLee.PurificationandCharacterizationofaNovelChitinasefromtheEntomopathogenicFungus,Metarhiziumanisopliae[J].JournalofInvertebratePathology,1999,(73)：276-281.鮮喬，蔣家新，張擁軍，等.高活性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生茵的篩選及鑒定[J].中國(guó)計(jì)量學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,20(3