持續(xù)性心房顫動心肌纖維化的實驗研究

持續(xù)性心房顫動心肌纖維化的實驗研究【摘要】目的探討心房顫動心肌纖維化的發(fā)生機制。方法雜種犬15條，隨機分三組：正常對照組、單純房顫組、房顫+Miberfradil組。采用vanGieson染色、免疫組織化學方法，結(jié)合高清晰彩色圖像分析系統(tǒng)，觀察正常對照組、單純房顫組和房顫+Miberfradil組心房組織總膠原、Ⅲ型膠原的表達。結(jié)果單純房顫組和房顫+Miberfradil組心房組織總膠原均明顯高于正常對照組。房顫+Miberfradil組的總膠原表達明顯減少，與單純房顫組相比較，差異有顯著性。單純房顫組Ⅲ型膠原的表達明顯高于正常對照組。房顫+Miberfradil組Ⅲ型膠原的表達明顯低于單純房顫組。結(jié)論持續(xù)性房顫有明顯的心肌纖維化改變，T型鈣通道阻滯劑能夠減輕心肌纖維化的程度。

【關(guān)鍵詞】心房顫動；心肌纖維化；膠原纖維

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemechanismsofthecardiacfibrosisduringatrialfibrillation.MethodsFifteenadultmongreldogswererandomlydividedinto3group:pureatrialfibrillationgroup,atrialfibrillationaddedmibefradilgroupandcontrolgroup.van-Giesonstainwasusedtodetecttotalcardiaccollagen.CardiaccollagensubtypeⅢwerestudiedbyimmunohistochemistryandimageanalysis.ResultsTotalcardiaccollagenwassignificantlyincreasedinpureatrialfibrillationgroupandatrialfibrillationaddedmibefradilgroupcomparedwiththatofcontrolgroup.Totalcardiaccollagenmarkedlydecreasedinatrialfibrillationaddedmibefradilgroupcomparedwiththatofpureatrialfibrillationgroup.TheexpressionofcardiaccollagensubtypeⅢwassignificantlyhigherinpureatrialfibrillationgroupthanthatofcontrolgroup.TheexpressionofcardiaccollagensubtypeⅢwasmarkedlylowerinatrialfibrillationaddedmibefradilgroupthanthatofpureatrialfibrillationgroup.ConclusionCardiacfibrosiswasobservedduringpersistentatrialfibrillationanditwasrelievedbyT-typecalciumchannelblocker.

【Keywords】atrialfibrillation;cardiacfibrosis;collagenfiber

心房顫動是臨床常見的心律失常，并發(fā)癥嚴重。持續(xù)性房顫可以引起心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌纖維化、心肌細胞肥大，部分肌溶解現(xiàn)象［1］。這些改變成為房顫發(fā)生過程中興奮傳導障礙和加重功能障礙的結(jié)構(gòu)基礎。到目前為止，對于房顫心肌纖維化的發(fā)生機制尚不清楚。本文采用vanGieson染色、免疫組織化學方法，結(jié)合高清晰彩色圖像分析系統(tǒng)，研究持續(xù)性房顫心房組織膠原表達的變化，探討房顫心肌纖維化的機制，為臨床治療和防止房顫的復發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

動物模型雜種犬15條，體重22～28kg，雌雄不拘，由中國人民解放軍總醫(yī)院提供。隨機分三組，每組5條。分為正常對照組、單純房顫組、房顫+Miberfradil組。房顫組均用3%的戊巴比妥鈉靜脈麻醉，切開右側(cè)頸部皮膚，鈍性游離右側(cè)頸內(nèi)靜脈，穿刺針行頸內(nèi)靜脈穿刺，在X線透視下送入“J”型傘狀心房單極電極，電極頭固定于右耳，將電極尾端與埋藏式高頻率心臟起搏器連接，起搏頻率520次/min。起搏器埋置于皮下胸鎖乳突肌表面的囊袋內(nèi)。正常對照組不植入起搏器。房顫＋mibefradil組在術(shù)后第2天開始給mibefradil原藥，按人與犬的藥物劑量換算計算用藥量，制成口服膠囊，每日服1次。術(shù)后觀測24周。處死動物前采血，用高效液相層析法紫外光測定mibefradil的血藥濃度為/ml。

實驗方法取心肌組織標本常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚度3μm。常規(guī)脫蠟至水。

總膠原纖維檢測蒸餾水洗5min，用vanGieson液染色45s,95%酒精6s,無水乙醇16s，松節(jié)油20s,封片。

免疫組化染色檢測Ⅲ型膠原抗原修復：用枸櫞酸鹽緩沖液,97℃,18min，降至室溫;過氧化氫溶液孵育10min，水洗2min,PBS沖洗5min×2,放入濕盒;血清封閉15min;加入一抗，放入4℃冰箱過夜；PBS洗5min×3,滴加羊抗兔二抗，室溫孵育25min,PBS沖洗5min×2;滴加DAB顯色液;蘇木素復染30s,脫水透明，中性樹膠封片。

結(jié)果判斷vanGieson液染色后，心肌纖維染成黃色，膠原染成紅色，并在心肌間質(zhì)中表達。結(jié)果用LeicaQWinV3高清晰彩色圖像分析系統(tǒng)進行分析,每個標本選一張切片，每張切片隨機選5個無血管視野進行統(tǒng)計分析，求得平均值。

免疫組化染色顯示：Ⅲ型膠原陽性反應為棕黃色顆粒，在心肌間質(zhì)中表達。結(jié)果用LeicaQWinV3高清晰彩色圖像分析系統(tǒng)進行分析,統(tǒng)計分析中不包括血管自身膠原。每張切片任意選5個視野進行統(tǒng)計分析，求得平均值。

統(tǒng)計學處理測量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用方差分析，以P＜為差異有顯著性。

2結(jié)果

單純房顫組和房顫+Miberfradil組的總膠原明顯高于正常對照組，單純房顫組總膠原又高于房顫+Miberfradil組，差異均有顯著性。Ⅲ型膠原的表達在房顫組最高，房顫＋Miberfradil組居中，正常對照組最低。單純房顫組與房顫+Miberfradil組相比，兩組間差異有顯著性。圖像分析結(jié)果見表1。

3討論

心肌纖維化是指心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量聚集，膠原濃度明顯增高或膠原容積分數(shù)顯著增加［2］，它是心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一。到目前為止，房顫時心肌纖維化的機制尚不完全明了。心?、癖?各組Ⅲ型膠原、總膠原的表達的圖像分析結(jié)果注：與正常對照組比較，*；與單純房顫組比較，**

型、Ⅲ型膠原是心肌的主要間質(zhì)成分，構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡的支架，對心肌起支持、協(xié)調(diào)同步舒縮的作用。心肌間質(zhì)膠原的變化能夠反映心肌組織結(jié)構(gòu)和成分的重塑。本實驗研究結(jié)果顯示，持續(xù)房顫6個月的單純房顫組和房顫+Miberfradi組心肌間質(zhì)總膠原及Ⅲ型膠原的表達明顯高于正常對照組，而單純房顫組又高于藥物組，表明持續(xù)性房顫心肌有明顯的膠原纖維增生。膠原網(wǎng)架的重塑增加了心房傳導的不均一性，導致房內(nèi)微折返環(huán)形成，使心房具有形成多個折返激動的異常基質(zhì)，從而促進房顫的發(fā)生和持續(xù)［3］。有研究表明，細胞內(nèi)鈣超載是心房顫動和持續(xù)的主要機制，T型鈣通道可能在此過程中起重要作用［4］。Miberfradi是一種新型T型鈣通道阻滯劑，主要作用是阻斷T型鈣通道。我們的研究結(jié)果顯示，房顫+Miberfradil組的總膠原及Ⅲ型膠原的表達高于正常組，但明顯低于單純房顫組。說明T型鈣通道阻滯劑能夠減輕心肌的纖維化，對心肌具有保護作用。減輕心肌細胞內(nèi)鈣超載可能減輕心肌纖維化，這也提示細胞內(nèi)鈣超載與心肌纖維化有關(guān)，相關(guān)機制有待進一步研究。

【參考文獻】

1FrusraciA,ChimentiC,BellocciF,etsubstrateofaterialbiopsiesinpatientswithloneatrialfibrillation.Circulation,1997,96:1180-1184.

2張海燕.心肌膠原網(wǎng)絡重構(gòu)的研究進展.心血管病學進展，2003,24：359-362.

3何偉雄，黃從新，劉唐威，等.風濕性心臟病心房顫動患者心房細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白與纖維的變化.中國心臟起搏與心電生理雜志，2002,1