2020年fz第六章-分子生物學(xué)基本研究法(下)-基因功能研究技術(shù)參照模板課件

第六章分子生物學(xué)基本研究法（下）—基因功能研究技術(shù)?第六章分子生物學(xué)基本研究法（下）—基因功能研究技術(shù)?1基因表達(dá)研究技術(shù)基因敲除技術(shù)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)基因芯片及數(shù)據(jù)分析利用酵母鑒定靶基因功能其他分子生物學(xué)技術(shù)?基因表達(dá)研究技術(shù)?2

6.1基因表達(dá)研究技術(shù)6.1.1基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）以DNA序列測定為基礎(chǔ)定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個(gè)堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，可用特定限制性核酸內(nèi)切酶分離轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中具有基因特異性的9-10個(gè)堿基序列并制成標(biāo)簽。將10-50個(gè)序列標(biāo)簽連接、克隆、測序后，根據(jù)其占總標(biāo)簽數(shù)的比例即可分析所對(duì)應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率。?6.1基因表達(dá)研究技術(shù)6.1.1基因表達(dá)系列分析技3

常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程連接子1和連接子2的5ˊ端分別加有氨基，以防止5ˊ端相連接。分離提取合成cDNA用錨定酶AE消化分3ˊ端酶切兩份，分別與ⅡS類TE標(biāo)簽酶識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。標(biāo)簽酶TE酶切末端補(bǔ)平連接兩份，根據(jù)接頭1、2設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR得到雙標(biāo)簽，分離純化串聯(lián)入載體。連接10-50個(gè)標(biāo)簽進(jìn)行克隆，測序，分析?常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程分離提取合4LongSAGE技術(shù)傳統(tǒng)的SAGE技術(shù)用14個(gè)堿基的標(biāo)簽代表一個(gè)基因并不能覆蓋人類基因組內(nèi)所有的基因序列，因而又發(fā)展了LongSAGE技術(shù)。LongSAGE標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與傳統(tǒng)的ShortSAGE方法類似，只是用了不同的ⅡS類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程序做了相應(yīng)修改。?LongSAGE技術(shù)傳統(tǒng)的SAGE技術(shù)用14個(gè)堿基的標(biāo)簽代表56.1.2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個(gè)mRNA前體中產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程?？煞譃椋浩胶饧羟?；5’選擇性剪切；3’選擇性剪切；外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法（反轉(zhuǎn)錄PCR）研究某個(gè)基因是否存在選擇性剪切。RT-PCR：把RNA提取后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。?6.1.2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指6平衡剪切5’選擇性剪切3’選擇性剪切外顯子遺漏型剪切相互排斥性剪切?平衡剪切5’選擇性剪切3’選擇性剪切外顯子遺漏型剪切相互排斥7一般用RT-PCR法研究一個(gè)基因是否存在選擇性剪接。選擇性剪接使一個(gè)基因翻譯為多種蛋白質(zhì)序列。分析人類基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)60%的基因在表達(dá)中可通過選擇性剪接產(chǎn)生各種形式的mRNA。?一般用RT-PCR法研究一個(gè)基因是否存在選擇性剪接。選擇性剪8該基因編碼一個(gè)神經(jīng)無軸突定向受體，4號(hào)外顯子有12個(gè)變異體，6號(hào)外顯子有48個(gè)變異體，9號(hào)外顯子有33個(gè)變異體，17號(hào)外顯子有2個(gè)變異體。推測該基因共有12×48×33×2=38016剪接異構(gòu)體。?該基因編碼一個(gè)神經(jīng)無軸突定向受體，4號(hào)外顯子有12個(gè)變異體，96.1.3原位雜交技術(shù)原位雜交(InSituHybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段，分為兩大類：RNA原位雜交染色體原位雜交?6.1.3原位雜交技術(shù)原位雜交(InSituHy10RNA原位雜交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定性定量分析。?RNA原位雜交：一般用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）11用組織原位雜交技術(shù)檢測棉花纖維特異基因的表達(dá)?用組織原位雜交技術(shù)檢測棉花纖維特異基因的表達(dá)?12熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)首先對(duì)寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。?熒光原位雜交(fluorescenceinsituhy136.1.4基因定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)該方法通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變編碼的氨基酸序列，用于研究某個(gè)（些）氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。迄今尚未建立用于精確預(yù)測特定氨基酸變化對(duì)整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)及活性影響的模型，即使了解一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，也無法了解某個(gè)氨基酸殘基對(duì)其的影響。而基因定點(diǎn)突變?yōu)檫M(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了重要的手段。?6.1.4基因定點(diǎn)突變(site-directedm1470年代初，Smith等建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)，提高了突變效率。?70年代初，Smith等建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變15目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制：?目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在16圖6-7重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制首先模板DNA分別與引物對(duì)1（正向誘變引物FM和反向引物R2）及引物對(duì)2（正向引物F2和反向誘變引物RM）退火，通過PCR1和2反應(yīng)擴(kuò)增出兩種靶基因片段。然后，在PCR3反應(yīng)中變性后的FMR2和RMF2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，按虛線所示進(jìn)行延伸，形成全長雙鏈DNA。FMR2RMF2?圖6-7重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制首先模板DNA分別與引物17首先用正向突變引物（M）和反向引物（R1），擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)生雙鏈大引物（PCR1），與野生型DNA分子混合后退火并使之復(fù)性，第二輪PCR中加入正向引物（F2），與PCR1中產(chǎn)生的一條互補(bǔ)鏈配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈DNA。?首先用正向突變引物（M）和反向引物（R1），擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)186.2基因敲除技術(shù)6.2.1基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。?6.2基因敲除技術(shù)6.2.1基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（F19基因敲除（geneknock-out）又稱基因打靶：通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。?基因敲除（geneknock-out）又稱基因打靶：?20基因敲除分為：完全基因敲除條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）完全基因敲除：指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性；條件型基因敲除：指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。?基因敲除分為：?21關(guān)于基因敲除技術(shù)，噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。?關(guān)于基因敲除技術(shù)，噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gi221、完全基因敲除：Neo基因有雙重作用：①形成靶位點(diǎn)的插入突變；②作為正向篩選標(biāo)記。取代型插入型?1、完全基因敲除：取代型插入型?23由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率約為10-2～10-5，植物的概率為10-4～10-5，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞。所以，得用多種PCR及Southern雜交等多種分子篩選技術(shù)驗(yàn)證所獲得的確實(shí)是目的基因被敲除的細(xì)胞系。?由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率約為1242、條件型基因敲除：完全基因敲除往往導(dǎo)致胚胎死亡；而條件型基因敲除，由于具有可調(diào)節(jié)性而受到科學(xué)家的重視。特點(diǎn)：常將正向選擇標(biāo)記neor置于內(nèi)含子中。?2、條件型基因敲除：?256.2.2高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括：構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中。使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。主要實(shí)驗(yàn)流程及篩選步驟：?6.2.2高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路26模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ES)

回交顯微注射篩選后的ES細(xì)胞注入母體重組載體中的DNA整合到內(nèi)源基因組中得以表達(dá)將正向選擇標(biāo)記neor置于載體中與ES細(xì)胞重組篩選重組后的ES細(xì)胞?模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。胚胎干細(xì)胞(27顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。?顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注286.2.3植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。T-DNA：是農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒中的一段DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中，已成為植物分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化載體，是Ti質(zhì)粒上的片斷。Ti質(zhì)粒因?yàn)樽陨硪恍﹥?yōu)點(diǎn)很適合作為導(dǎo)入外源基因的載體。報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。?6.2.3植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前29a.引物設(shè)計(jì)。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物，目的基因片段(設(shè)為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。b，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。由T-DNA介導(dǎo)目的基因片段LB為插入載體的引物PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果整合導(dǎo)致基因失活已知序列通過設(shè)計(jì)引物分離靶基因?a.引物設(shè)計(jì)。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是306.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)（Yeastone-hybridsystem）是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。?6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.3.1酵母單雜31將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子（minimalpromoter，Pmin）的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcription-activatingdomain,AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。?將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子（minimalpro32轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合，激活最基本啟動(dòng)子Pmin，使報(bào)告基因表達(dá)。若接入3個(gè)以上順式作用元件，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別和結(jié)合效率。上游下游結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)子二者融合導(dǎo)入酵母細(xì)胞?轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合，激活最基本啟動(dòng)子Pmin，使報(bào)告33圖6-16從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基本流程示意圖。酵母單雜交體系主要用于：確定某個(gè)DNA分子與某個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；分離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他DNA位點(diǎn)的功能蛋白編碼基因；驗(yàn)證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。由于該方法的敏感和可靠性，已被廣泛用于克隆細(xì)胞中含量極低且用生物化學(xué)手段難以純化的那部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。?圖6-16從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的346.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeasttwo-hybridsystem）真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。?6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeasttwo-hybr35DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）能與特定基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄。由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。?DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）能與特定基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基36BDAD雜合蛋白激活轉(zhuǎn)錄功能?BDAD雜合蛋白激活轉(zhuǎn)錄功能?376.3.5RNAi（RNAinterference,RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用RNAi技術(shù)：利用設(shè)計(jì)的雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。?6.3.5RNAi（RNAinterference,38RNAi作用機(jī)制示意圖。初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA雙鏈小RNA核酸酶RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核蛋白體RISC介導(dǎo)切割siRNAmRNA被降解，翻譯受抑制?RNAi作用機(jī)制示意圖。初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雙鏈小RNA核酸酶RNA39研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長的雙鏈RNA（30個(gè)核苷酸以上）首先被降解形成21～25個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效地定位目標(biāo)mRNA。?研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈R40siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介。具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團(tuán)和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。?siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中416.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)，是能同時(shí)監(jiān)測大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄的變化規(guī)律?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法。?6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip），又42??43簡易基因芯片使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過物理吸附作用達(dá)到固定化。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。?簡易基因芯片使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過44大規(guī)?；蛐酒膽?yīng)用?大規(guī)?；蛐酒膽?yīng)用?45基因芯片可用于進(jìn)行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖，用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，確定哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。?基因芯片可用于進(jìn)行基因診斷。?46作業(yè)：1、簡述酵母單雜交系統(tǒng)的主要原理。2、簡述酵母雙雜交系統(tǒng)的主要原理。3、基因敲除技術(shù)?作業(yè)：1、簡述酵母單雜交系統(tǒng)的主要原理。?479、有時(shí)候讀書是一種巧妙地避開思考的方法。10月-2310月-23Thursday,October5,202310、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。21:54:0121:54:0121:5410/5/20239:54:01PM11、越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。10月-2321:54:0121:54Oct-2305-Oct-2312、越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。21:54:0121:54:0121:54Thursday,October5,202313、知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。10月-2310月-2321:54:0121:54:01October5,202314、意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。05十月20239:54:01下午21:54:0110月-2315、最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。。十月239:54下午10月-2321:54October5,202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/10/521:54:0121:54:0105October202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。9:54:01下午9:54下午21:54:0110月-239、有時(shí)候讀書是一種巧妙地避開思考的方法。10月-2310月-23Thursday,October5,202310、閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。21:54:0121:54:0121:5410/5/20239:54:01PM11、越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。10月-2321:54:0121:54Oct-2305-Oct-2312、越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。21:54:0121:54:0121:54Thursday,October5,202313、知人者智，自知者明。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。10月-23