SDSPAGE分離膠配方表及其原理

SDSPAGE分離膠配方表及其原理TheStandardizationOfficewasrevisedontheafternoonofDecember13,2020SDS電泳原理：聚丙烯酰胺凝膠是山丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N,N，—亞中基雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋口質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋口質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。山于SDS可設(shè)法將電泳時(shí)蛋口質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計(jì)的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋口質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。TEMED:通過催化過硫酸皺形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。過硫酸鞍（AP）:提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺與雙丙烯酰胺所必須的自由基。SDS—PAGE可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂“不連續(xù)”是指電泳體系山兩種或兩種以上的緩沖液、pH和凝膠孔徑等所組成。1?蛋白樣品濃縮效應(yīng)在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液（Tris—Gly,、濃縮膠緩沖液（Tris—HCl,、分離膠緩沖液（Tris—HC1,，兩種凝膠的濃度（即孔徑）也不相同。在這種條件下，緩沖系統(tǒng)中的HC1兒乎全部解離成C1-,兩槽中的Gly（pl=，pKa=只有很少部分解離成Gly的負(fù)離子，而酸性蛋口質(zhì)也可解離出負(fù)離子。這些離子在電泳時(shí)都向正極移動(dòng)。C1—速度最快（先導(dǎo)離子），其次為蛋白質(zhì)，Gly負(fù)離子最慢（尾隨離子）。由于C1—很快超過蛋白離子，因此在其后面形成一個(gè)電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度最高，這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性，導(dǎo)致蛋口質(zhì)和Gly離子加快移動(dòng)，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之詢，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳的分辨率。2.分子篩效應(yīng)蛋口質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后，條件有很大變化。山于其pH升髙（電泳進(jìn)行時(shí)常超過，使61『解離成負(fù)離子的效應(yīng)增加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋口質(zhì)的泳動(dòng)受到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化，使Gly的移動(dòng)超過蛋口質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的

大小移動(dòng)。分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分子質(zhì)量的蛋口質(zhì)來說，通過時(shí)受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會(huì)山于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。SDS電泳膠配制:分離膠(12%)4ml8ml10mlHzOmlAcr/Bis(30%)mlTris-HClSDS(30%)40gl80gllOOglAP(10%)40gl80gl100glTEMEDMllOOgl水対30分鐘濃縮膠(5%)2ml4ml5mlh2omlmlmlAcr/Bis(30%)mlTris-HClmlmlSDS(30%)20gl40gl50^1AP(10%)20gl40gl50^1TEMEDPl匚1SDS試劑配制：試劑名稱配制方法備注30%Acr/Bis29%(w/v)丙烯酰胺.1%(w/v)N.N?亞甲雙丙烯酰胺.一般配宜100ml,稱重Acr29g,Bislg.加溫?zé)岬娜ルx子水lOOmL溶解室溫?藏于棕色瓶子，幾個(gè)丿］需婆重新配制°具有強(qiáng)神經(jīng)禱性，易吸附于皮膚，配置是應(yīng)帶面具和手套。Tris-HClL?一般配宜lOOmL稱重，加去離子水100亳升.溶解須用Ttis堿,用HC1調(diào)節(jié)pHTris-HClL.一般配宜lOOmL稱重，加去離子水100亳升,溶解須用Ttis堿,用HC1調(diào)節(jié)pH10%SDS10%(w/v)?一般配置100ml.稱重10g,加去離子水100ml.溶解不同廠家的SDS相差較大，建議用同一家的統(tǒng)一級別的試劑10%過硫酸飲(AP)10%(w/v),稱重10g,加去離子水lOOmL溶解過硫酸飲容易分解，建議隔周配宜存于49冰箱或者分裝200^1?存于?20CTEMEDTris-tt氨酸電泳緩沖液5X緩沖液：25mmol/LTtis堿.250mmol/Ltt氨酸(電泳級.