重溫先父遺傳：后代繼承他們母親前配偶的獲得性特征

用了幾天時間，終于將一篇2014年發(fā)表于高階學(xué)術(shù)期刊《生態(tài)學(xué)通訊》上的一篇關(guān)于先父遺傳的論文翻譯出來了。這篇論文用實驗證實了先父遺傳的存在。因為我認(rèn)識的人中有學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖的，所以很久之前我就聽說過先父遺傳現(xiàn)象，據(jù)說這種現(xiàn)象在養(yǎng)殖中是非常普遍的。但后來我看到的所有資料都痛批它是偽科學(xué)，而以前我是深信“主流科學(xué)”意見的，所以一直沒關(guān)注它。后來我發(fā)現(xiàn)并解釋了淫亂降低后代智力的規(guī)律，并一直堅持反淫亂宣傳，但那時我覺得，以性解放分子宣傳的歪理，中毒的人連自己的孩子是隔壁老王還是經(jīng)紀(jì)人老宋的都不在乎，哪還在乎自己的孩子帶有老婆的前炮友的相貌特征？所以先父遺傳即使被證實是真的，對反淫亂宣傳都沒什么卵用。前幾天有個網(wǎng)友在天涯這發(fā)出消息，說有科學(xué)團(tuán)隊用實驗證實先父遺傳，出于好奇，我立即去下載了這篇論文來看。一看之下很受啟發(fā)。至少這篇論文證明了，親代的生活習(xí)慣對后代性狀有極大影響。而事實上，2006年美國科學(xué)家皮特尼克就通過解剖發(fā)現(xiàn)了，淫亂物種大腦小睪丸大，而貞潔物種大腦大睪丸小，推斷淫亂物種智力低。而這個發(fā)現(xiàn)不被社會重視(或者相關(guān)研究被黑暗民族封殺)，原因就在于人們普遍有僥幸心理，認(rèn)為淫亂降低后代智力的過程起碼得有幾萬年，自己爽了再說，哪管它幾萬年后的事。而這篇論文用無可辯駁的實驗事實證明，你的生活習(xí)慣都可影響后代呢，淫亂降低后代智力哪用得了多久，你自己淫亂你的孩子就遭殃了。而現(xiàn)在歐美日的民眾普遍連個位數(shù)乘法都學(xué)不會的事實，更增加“淫亂降低后代智力”這一論斷的說服力下面是該論文的譯文。因為我此前一直做的是中譯英的工作，很少做英譯中方向的翻譯，并且國內(nèi)甚少有相關(guān)研究，我沒讀過相應(yīng)的中文資料，譯文不可避免地有不完善的地方，請讀者多多包涵！EcologyLetters,(2014)17:1545-1552Revisitingtelegony:offspringinheritanacquiredcharacteristicoftheirmother'spreviousmate生態(tài)學(xué)通訊(2014)17:1545-1552(此期刊最新的影響因子為10.772，算是僅次于世界頂級學(xué)術(shù)期刊的刊物了)重溫先父遺傳：后代繼承他們母親前配偶的獲得性特征AbstractNewlydiscoverednon-geneticmechanismsbreakthelinkbetweengenesandinheritance,therebyalsoraisingthepossibilitythatpreviousmatingpartnerscouldinfluencetraitsinoffspringsiredbysubsequentmalesthatmatewiththesamefemale(‘telegony').IntheflyTelostylinusangusticollis,malestransmittheirenvironmentallyacquiredconditionviapaternaleffectsonoffspringbodysize.Wemanipulatedmalecondition,andmatedfemalestotwomalesinhighorlowconditioninafullycrosseddesign.Althoughthesecondmalesiredalargemajorityofoffspring,offspringbodysizewasinfluencedbytheconditionofthefirstmale.Thiseffectwasnotobservedwhenfemaleswereexposedtothefirstmalewithoutmating,implicatingsemen-mediatedeffectsratherthanfemaledifferentialallocationbasedonpre-matingassessmentofmalequality.Ourresultsrevealanoveltypeoftransgenerationaleffectwithpotentialimplicationsfortheevolutionofreproductivestrategies.【摘要】新發(fā)現(xiàn)的非遺傳機制打破了基因與遺傳特征之間的聯(lián)系，從而也提高了前配偶能影響由后繼雄性與同一雌性交配授精所產(chǎn)后代的性狀的可能性(先父遺傳)。在一種澳大利亞蠅類(Telostylinusangusticollis)身上，雄性通過父親效應(yīng)把他們的環(huán)境獲得狀態(tài)(environmentallyacquiredcondition)中的身體大小傳導(dǎo)到后代中去。我們操縱雄性條件，讓雌性在一個完全交叉的設(shè)計中與兩個分別處于高或低狀態(tài)的雄性交配。雖然后繼雄性是絕大部分后代的遺傳意義上的父親，但后代的身體大小受前雄性身體狀態(tài)的影響。在雌性與前雄性接觸但沒有交配時，沒有觀察到這種效果，表明是精液介導(dǎo)這種效應(yīng)，而非基于交配前雄性品質(zhì)評估的雌性資源差異分配。我們的研究結(jié)果揭示了一種新代際效應(yīng)，這種效應(yīng)對生殖策略的演進(jìn)具有潛在影響。KeywordsCondition,diet,inheritanceofacquiredtraits,non-geneticinheritance,paternaleffect,plasticity,seminalproteins,telegony.關(guān)鍵詞狀態(tài)，飲食,獲得性狀遺傳，非遺傳遺傳，父系效應(yīng)，可塑性，精液蛋白，先父遺傳。EcologyLetters(2014)17:1545-1552INTRODUCTIONRecentadvancesinourunderstandingofinheritancehaverevealedthatoffspring-parentresemblancecannotbeexplainedsolelybythetransmissionofparentalgenes(seerecentreviews:Danchinetal.2011;Bonduriansky2012).Accumulatingevidenceshowsthatavarietyofinheritancemechanisms(includingbutnotrestrictedtoepigeneticinheritance)operatealongsideMendelianinheritance,suchthatbothgeneticandnon-geneticsourcesofvariation(andtheinteractionsbetweenthem)caninfluencephenotypicvariationandevolutionaryoutcomes.Therecognitionofnon-geneticprocessesinthetransmissionofvariationacrossgenerationsnecessitatesare-examinationofphenomenaexcludedbyclassicalgenetics.Beforetheadventofmoderngenetics,manybiologistsbelievedthatamalecanleaveamarkonhismate'sbody,causingthefemale'ssubsequentoffspringtoresembletheirmother'sfirstmate,despitebeingsiredbyanothermale(Rabaud1914;Ewart1920).Thishypothesisedphenomenon,dubbed‘telegony'byAugustWeismann,wasrejectedintheearly20thcenturybecauseitlackedunequivocalempiricalsupportandwasdeemedincompatiblewithMendeliangenetics(Burkhardt1979).However,recentdiscoverieshaverevealedtheexistenceofmolecularandphysiologicalmechanismsthathavethepotentialtomediatetelegony(Liu2011,2013).Althoughclassicdiscussionsoftelegonyfocusedoneffectscarriedoverfromonegestationtothenext,similarmechanismscouldenablemaleswhodonotsireanyoffspringtoinfluencethedevelopmentoffutureoffspringsiredbyothermales.Potentialmechanismsoftelegonyincludepenetrationofmaternalsomaticcellsbysperm,foetalgenesinmother'sblood,andtheabilityofRNAtoprogramgenomerearrangement(Liu2011,2013).Inaddition,malesprovidethefemalewithasuiteofproteinsandothermoleculesintheseminalfluid(Avilaetal.2011),theconcentrationandcompositionofwhichcanbealteredbythemale'senvironment(Wigbyetal.2009;Perry&Rowe2010;Sirotetal.2011).Seminalproductsareknowntohavecomplexeffectsonfemalefitnessandbehaviour(Gillott2003;Wigbyetal.2009;Perryetal.2013),andcaninfluenceoffspringhealthviaeffectsonthefemalereproductivetract(Bromfield2014;Bromfieldetal.2014).Hence,weproposethatthephenotypeofafemale'spreviousmatecouldpotentiallyinfluenceherfutureoffspring,siredbyothermales,viatheeffectsofseminalfluidonovuledevelopment(Fig.1).Previously,wehavedemonstratedintheneriidfly,Telostylinusangusticollis,thatmalesrearedonanutrient-richlarvaldiet(high-conditionfathers)producelargeroffspringthanmalesrearedonanutrient-poorlarvaldiet(low-conditionfathers)(Bonduriansky&Head2007;Adler&Bonduriansky2013).Thispaternaleffectisespeciallyinterestingbecausethereisnoevidenceofanyconventionalformofpaternalprovisioningornuptialgiftinthisspecies:meancopulationdurationisonly43s,thereisnoexternalorinternalspermatophoreormatingplug,andmeanejaculatesizeis<0.01%ofmalebodyvolume(Bonduriansky&Head2007;Bathetal.2012).Theeffectofpaternalconditiononoffspringsizecouldbemediatedbythetransferofcondition-dependentaccessoryglandproductsintheseminalfluid.TotestfortelegonyinT.angusticollis,wemanipulatedmalelarvaldietqualitytogeneratevariationinmalecondition,andmatedrecentlyeclosedfemaleswithamaleinhigh-orlowcondition(firstmale)toexposedevelopingovulestoseminalfluidfromthesemales.Twoweekslater,afterthefemales'eggsmatured,were-matedeachfemalewithanewhigh-orlow-conditionmale(secondmale)inafullycrosseddesign,andquantifiedphenotypictraitsinoffspringproducedafterthissecondmating(Fig.2a).Ovulesareencasedinahard,largelyimpermeablechorionshelluponreachingtheirmaturesize,andthenfertilisedastheypassdowntheoviductjustbeforeoviposition.Femalesstoresperminspermathecalducts,butfewfemaleslayviableeggs2weeksaftermating(AJCandRB,unpublisheddata).Wethereforeexpectedthesecondmaletobethegeneticsireoftheoffspring,andaskedwhetherthefirstmalecannonethelessinfluenceoffspringphenotypevianongeneticsemen-mediatedeffectsonthedevelopmentofpre-chorionatedovules(Fig.1).Asfirstmaleeffectsonoffspringcouldalsobemediatedbyfemaledifferentialallocationofresourcestodevelopingovulesbasedonpre-matingassessmentofmalequality(Burley1988;Sheldon2000),weconductedasecondexperimenttoverifytheroleofsemeninmediatingthefirstmaleeffect,wherebyrecentlyeclosedfemaleswereeitherallowedtomatewithamaleinhighorlowconditionorexposedtothemalewithoutmating(Fig.2b).前言我們在遺傳的探索方面的最新進(jìn)展顯示，后代--父母之間的相似性不能僅僅以父母基因的傳遞來解釋(參見最新回顧文章：Danchin等，2011；bonduriansky2012)。越來越多的證據(jù)表明，多種遺傳機制(包括但不限于表觀遺傳)與孟德爾遺傳共同發(fā)揮作用，如此遺傳和非遺傳源性的變異(以及它們之間的相互作用)可以影響表型變異和進(jìn)化結(jié)果。要識別變異的跨代傳遞中的非遺傳過程，必須重新審查被經(jīng)典遺傳學(xué)排斥的一些現(xiàn)象。現(xiàn)代遺傳學(xué)出現(xiàn)之前，許多生物學(xué)家認(rèn)為，雄性會在配偶身上留下印記，導(dǎo)致雌性其后生出的后代長得像它們母親的第一任配偶，即便這些后代是由另一只雄性授精所生(Rabaud1914；Ewart1920)。這個被AugustWeismann稱為“先父遺傳”的假設(shè)的現(xiàn)象,在第二十世紀(jì)二十年代被人排斥，因為它缺乏明確的實證支持，被視為與孟德爾遺傳學(xué)不相容burkhardt1979)。然而，最近的發(fā)現(xiàn)顯示，有分子和生理機制有潛在的能力可以介導(dǎo)先父遺傳(劉，2011，2013)。雖然經(jīng)典的討論主要集中在效應(yīng)通過從一次懷胎傳遞到下一次懷胎，但類似的機制可以使沒有為任何后代授精的雄性能夠影響未來的由其它雄性授精的后代的發(fā)育。潛在的先父遺傳機制包括精子穿透母體的體細(xì)胞，母體血液中的胎兒基因，以及RNA影響基因組重排的能力(劉2011，2013)。此外，雄性通過其精液中向女性提供一整套的蛋白質(zhì)和其他分子(Avila等2011)，其濃度和組成可因雄性生活的環(huán)境而改變(Wigby等2009;Perry&Rowe2010;Sirot等2011)。已知精液物質(zhì)對雌性的適合性和行為有復(fù)雜的影響(Gillott2003;Wigby等2009;Perry等2013)，并通過影響雌性生殖道影響后代健康(Bromfield2014;Bromfield等2014)。因此，我們假定，通過精液對卵子發(fā)育的影響，雌性的前任配偶的表型可能影響她未來由其它雄性授精的后代(圖1)。此前，我們已經(jīng)闡明，在蠅類neriid和Telostylinusangusticollis中，幼蟲時用營養(yǎng)豐富的飲食飼養(yǎng)的雄性(高狀態(tài)的父親)產(chǎn)生的后代比幼蟲時由低營養(yǎng)的飼料飼養(yǎng)的雄性(低狀態(tài)的父親)產(chǎn)生的后代體形更大(Bonduriansky和Head2007;Adler和Bonduriansky2013)。這種父親效應(yīng)特別有趣，因為在這種物種中，沒有任何任何傳統(tǒng)形式的證據(jù)表明父親提供供養(yǎng)或“彩禮”：此物種的平均交配持續(xù)時間只有43秒，它們沒有外部或內(nèi)部精包或交配塞，并且平均射精量小于雄性身體體積的0.01%(Bonduriansky和Head2007;Bath等2012).父親狀態(tài)對后代的身體大小的影響，可以由精液的條件依賴性附腺產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移所介導(dǎo)。為了在T.angusticollis上檢測先父遺傳，我們操縱雄性幼蟲的飲食質(zhì)量，以產(chǎn)生雄性狀態(tài)的變易，并讓新近生活在籠養(yǎng)環(huán)境里的雌性與一個高狀態(tài)或低狀態(tài)雄性交配，使其卵子暴露于這些雄性的精液中。兩周后，雌性的卵成熟，我們重新讓每個雌性在一個完全交叉設(shè)計中與一個新的高或低狀態(tài)雄性(后繼雄性)交配，并對在第二次交配中所產(chǎn)生的后代的表型性狀進(jìn)行定量描述(圖2A)。卵子在達(dá)到成熟之前被包裹在一個堅硬的基本上不可能穿透的外殼中，隨后它們在通過輸卵管時受精并被生出(產(chǎn)卵)。雌性儲存精子在精囊管，但極少雌性能在交配2周后還能產(chǎn)下能孵化的卵(AJC和Rb,未發(fā)表的數(shù)據(jù))。因此，我們預(yù)計第二個交配的雄性是后代的遺傳上的父親，并探討是否前雄性仍然可以通過非遺傳的精液介導(dǎo)的對未成熟卵子發(fā)育的效應(yīng)來影響后代的表型(圖1)。由于前雄性對后代的影響也可以被雌性的對卵子發(fā)育的差異化資源分配(基于交配前對雄性質(zhì)量評估)所介導(dǎo)(Burley1988；Sheldon2000),我們進(jìn)行了第二個實驗，以驗證精液在介導(dǎo)前雄性效應(yīng)中的作用，其中新近封閉喂養(yǎng)的雌性一部分被允許與高或低狀態(tài)雄性交配，另一部分與這類雄性接觸但沒有交配(圖2B)。MATERIALSANDMETHODSStudyspeciesTelostylinusangusticollisarepolyandrous,formingmixed-sexmatingaggregationsonthetrunksofbeetle-damagedAcacialongifoliatrees.Asinallholometabolousinsects,adultsizeandshapeisfixeduponeclosion.Malesrearedonarichlarvaldietdevelopexaggeratedsecondarysexualcharactersandaremuchlargerthanfemales,whereasmalesandfemalesrearedonapoorlarvaldietaresimilarinsizeandshape(Bonduriansky2007;Sentinellaetal.2013).Largebodysizeisadvantageousinmale-malecontestsforaccesstoterritoriesandfemales(Bonduriansky&Head2007;Bathetal.2012).LaboratorystocksofT.angusticolliswerecollectedfromFredHollowsReserve,Sydney,Australia(33.912°S,151.248°E),andmaintainedinthelaboratoryasalargeoutbredpopulation,supplementedannuallywithnewwild-collectedflies.ManipulationofconditionToobtainmalesinhighandlowcondition,eggscollectedfromstockcagesweretransferredintocontainersof50eggsper200mLoffresh‘rich'or‘poor'larvalmedium,whichrepresentsadlibitumfoodforlarvae(Bonduriansky&Head2007).Richlarvalmediumcontains3-foldhigherconcentrationsofproteinandcarbohydratesthanpoorlarvalmedium(seeBonduriansky2007fordetails).Malesraisedonarichlarvaldietweresignificantlylargerthanmalesraisedonapoorlarvaldiet(malethoraxlengthmeanSE:rich=2.5520.046mm,poor=1.7260.017mm;t100=17.111,P<0.001).材料與方法：研究物種Telostylinusangusticollis行一妻多夫混交生活，在被甲蟲損害的長葉相思樹樹干上形成混合性交配聚合。作為一種完全變態(tài)昆蟲，它們的成蟲的大小和形狀在羽化時就固定了。在幼蟲階段以豐富食物飼養(yǎng)的雄性發(fā)育出夸張的第二性征，體形也遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雌性，而幼蟲時以貧乏食物喂養(yǎng)的雄性和雌性在大小和形狀都相似(bonduriansky2007；Sentinella等，2013)。巨大體型在獲得領(lǐng)土和雌性的雄性間競爭中是有利的(Bonduriansky和Head2007;Bath等2012).T.angusticollis的實驗室?guī)齑媸占诎拇罄麃喯つ岬母トR德洞保護(hù)區(qū)(南緯33.912°，東經(jīng)151.248°)，并作為一個遠(yuǎn)交群保持在實驗室，每年補充新收集的野生蠅。獲得高、低狀態(tài)雄性的操作：從庫存籠收集的蟲卵被轉(zhuǎn)移到容器中，每50個蟲卵配以200毫升新鮮的“豐富”或“貧乏”的幼蟲培養(yǎng)液，構(gòu)成幼蟲自由采食的食物(Bonduriansky和Head2007)。豐富幼蟲培養(yǎng)液中含有的蛋白質(zhì)和碳水化合物比貧乏幼蟲培養(yǎng)液要高3倍(細(xì)節(jié)見bonduriansky2007)。在幼蟲階段由豐富飲食喂養(yǎng)的雄性顯著大于在幼蟲階段由貧乏飲食喂養(yǎng)的雄性(雄性胸部長度均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差：豐富=2.552±0.046毫米，貧乏=1.726±0.017毫米；T=17.111,PV0.001)。100Larvalcontainerswerekeptinacontrolled-environmentchambersettoanalternatinglight-dark12—12hcycleof25/23°Cand50%humidity,andperiodicallymistedwithwater.Uponeclosion,flieswereseparatedbysexandlarvaldiettreatment,andhousedwithadlibitumfood(brownsugarandyeast)andwater:poorfemaleswerediscarded;richfemaleswerehousedindividuallyin250mLcontainers;richandpoormaleswerehousedingroupsof10individualsin2Lcontainers.幼蟲培養(yǎng)器被放置于控制環(huán)境參數(shù)的小室之中，明-暗更替周期為12-12小時，溫度為25/23。C,濕度為50%,并定期進(jìn)行水噴霧。在羽化時，蠅體根據(jù)性別和幼蟲飲食進(jìn)行分組，并安置于有供自由采食的食物(紅糖、酵母)和水的環(huán)境中：舍棄狀態(tài)不佳的雌性；狀態(tài)佳的雌性被單獨安置在250毫升容器中;高和低狀態(tài)的雄性以10個一組的形式安置在2升容器中。Offemalesusedasmothersintheexperiment(n=26pertreatmentcombination),twodiedbeforethesecondmating(onelow-high,onehigh-hightreatment)andwereexcludedfromanalysis.Femalebodysizedidnotdifferamongtreatmentgroups(F2,101=0.702;P=0.498).Notreatmentmalesdiedduringtheexperiment.在實驗中使用為母親的雌性(每個處置組合樣本量為26)，其中兩只母蠅(一個低-高處置，一個高-高處置治療)在第二次交配前死亡，被排除在分析之外。各處置組之間雌性的體形大小沒有顯著差異f=0.702；P=0.498)。實驗期間沒有雄性死亡。2101TelegonyexperimentSevendaysaftereclosion(whiletheirovuleswerestillimmature),femaleswerepairedwitheitherahigh-condition(richlarvaldiet)orlow-condition(poorlarvaldiet)male,andlefttomatefor24h.Themaleswerethenreturnedtotheirgroupcagesandfemaleslefttomatureintheirindividualcages.Femalesdonotlayeggsunlessgivenappropriateovipositionmedia,andthereforedidnotlayanyeggsduringthistime.Twoweeksaftertheinitialmating(whentheirovulesweremature),femaleswerepairedtoasecondmalefor24hinafullycrosseddesign,resultinginfourcombinationsoffirstandsecondmalecondition(high—high,high—low,low—high,low—low),andgivenovipositionmediumtolayeggs(Fig.2a).Toavoidcohorteffects,thesecondmalewasdrawnfromthesamesetofmalesthathadbeenusedforthefirstmating,suchthateachmalewasusedbothasafirstmaleandasasecondmale.Weallowed2weeksbetweenthefirstandsecondmatingstoallowfemales'ovulestomatureandminimisetheprevalenceofviablespermfromthefirstmatinginfemalesperm-storageorgans.Twentyrandomlychoseneggsfromeachfemaleweretransferredintoacontainerwith100mLofpoorlarvalmedium.Asubsampleofeggsfromeachfemale(meann=9.08,SD=2.30,TableS1)wasalsophotographedunderaLeicaMS5stereoscope(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)fittedwithaLeicaDFC420camera,andeggareawasmeasuredfromimagesusingImageJsoftware(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Maryland,USA).先父遺傳實驗：羽化后第七天(此時卵子仍不成熟)，雌性與高狀態(tài)(豐富幼蟲飲食誘導(dǎo))或低狀態(tài)(貧乏幼蟲飲食誘導(dǎo))雄性交配，并讓其交配24小時。其后，雄性回到它們分組的籠子里，而雌性留在自己的籠子里發(fā)育成熟。雌性在給予適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)卵媒介之前是不產(chǎn)卵的，因此它們在此期間沒有產(chǎn)卵。初次交配兩周后（卵子成熟時），以完全交叉設(shè)計的模式，雌性與第二只雄性交配24小時，從而形成前雄性與后繼雄性的四種狀態(tài)組合（高—高，高—低，低一高，低-低），并提供產(chǎn)卵媒介以促產(chǎn)卵（圖2A）。為避免隊列效應(yīng)，后繼雄性是從同一組雄性中抽取，即從已用于第一次交配的雄性中抽取，如此，每一個雄性都既用作前雄性又用作后繼雄性。在第一和第二交配之間我們安排了2周時間，讓雌性卵子成熟，并最大限度減少在第一次交配時存在雌性精子儲存器官中的精子的存活率。隨機選擇20只蟲卵并轉(zhuǎn)移到一個含有100毫升貧乏幼蟲培養(yǎng)液的容器中。從每個雌性的蟲卵中選取子樣本（均數(shù)n=9.08，標(biāo)準(zhǔn)差=2.30，表S1）并用配備徠卡dfc420相機的徠卡MS5立體鏡（徠卡公司，韋茨拉爾，德國）拍攝圖片，而蟲卵面積使用ImageJ圖像測量軟件（美國國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)，馬里蘭州，美國）在圖片上計算。Larvaewerelefttodevelopinacontrolled-environmentchamber,asdescribedabove.Adultflies（offspring）wereallowedtoemergeinto2Lcages,withfoodandwaterprovidedadlibitum.Thedateoffirstemergencewasrecordedforeachfamily（replicate）,andafter10days（whenflieshadceasedemerging）alladultoffspringwerecountedandfrozen（seeTableSIforsamplesize）.Inthreereplicates（onefromeachtreatmentcombinationexceptlow-low）noneoftheeggscollectedemergedasadults,sothesereplicateswereexcludedfromanalysesofoffspringbodysize.Offspring（ntotal=1415）werelatersexedandphotographedinlateralview（afterremovingwingsandlegs）usingtheLeicaMS5stereoscope,andImageJwasusedtomeasurethoraxlengthasanindexofbodysize.幼蟲生長在受控環(huán)境參數(shù)的小室里，如上所述。成年蠅（后代）在一個容量2L的籠里羽化，提供食物和水供其自由采食。每個家系（副本）首次羽化的日期都被記錄下來，10天后（當(dāng)蒼蠅停止羽化）對所有成年后代計數(shù)和冷凍（見表S1中的樣本大?。Ｔ谌齻€副本（除了低-低組合外的每個處置組合）中沒有一個收集到的蟲卵成功羽化，因此，這些副本被排除出后代的身體大小分析。后代（總樣本量n=1415）隨后被鑒定性別并使用徠卡MS5立體鏡拍攝側(cè)面圖片（除去翅膀和腿后），并利用ImageJ軟件來測量胸部長度，以作為身體大小的指標(biāo)。PaternityanalysisAllparentalgenerationmalesandfemaleswerefrozenimmediatelyaftermating/ovipositionandtheirthoraxlengthslatermeasuredasdescribedabove.DNAwasextractedfromtheparentsandasubsampleoffiveoffspringperfamilywherepossible（TableS1）fromhigh-lowandlow-hightreatmentgroups.DNAwasextractedwithaGentraPureGeneDNAextractionkit（Qiagen）,andsixmicrosatellitemarkers（Tangus2,8,9,10,15,20（seeKoppsetal.2013）;TableS2）wereamplifiedasdescribedinKoppsetal.（2013）,runonanABI3730DNAAnalyser,andanalysedwithGeneMapperver.3.7software（bothAppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA）.父系分析所有親代雄性和雌性在交配/產(chǎn)卵后立即被冷凍，測量它們的胸部長度，方法如上所述。提取親本和每個家系的5個后代（可能來自于高一低和低一高處置組，表一）的DNA。DNA使用GentraPuregeneDNA提取試劑盒提?。≦iagen公司），而6個微衛(wèi)星標(biāo)記［Tangus2,8，9,10,15,20（見Kopps等,2013）；表S2］進(jìn)行PCR擴增，方法參考Kopps等人的描述（2013），擴增在一臺ABI3730DNA分析儀上進(jìn)行，使用GeneMapperver。3.7軟件（皆來自AppliedBiosystems公司，福斯特城，CA,美國）來分析。Wesuccessfullygenotyped205individualoffspring,their48mothersandprobablesires（secondmales）,and30of51alternativepotentialfirstmales（malesfromlow-lowandhigh-hightreatments）.Individualswereexcludedfromthedatasetiflessthanfourmicrosatellitelociamplifiedsuccessfully(25offspringand26potentialsires),orifoffspringhadanymismatcheswiththeirmother(7individuals).Theindividualidentityofthesecondmalewasknown,andthegenotypesofmostpotentialalternativesireswerepresentinthedataset.Hence,weassessedpaternityfortheputativesire(secondmale)andpotentialalternativesires(firstmales)bynon-exclusion(i.e.zeromismatchingalleleswiththesecondmaleafterthematernalcontributionwasaccountedfor,seeSupportingInformationforfurtherdetails)usingtheoutputtableinCervus我們成功確定了205個后代蠅體，它們的48位母親和可能的雄性親代(后繼雄性)，以及51個潛在的前雄性中的30個(來自于低-低和高-高處置組的雄性)的基因型。如果成功擴增的微衛(wèi)星位點少于4個(25個后代和26個潛在的雄性親本)，則個體被排除出分析數(shù)據(jù)集，如果后代與他們的母親有任何不匹配(7個個體)也會被排除。后繼雄性的個體身份是已知的，并且最有潛力的替代親本的基因型也納入數(shù)據(jù)集。因此，我們在Cervus軟件的輸出表上用非排他性法評估了假定親本(后繼雄性)和潛在替代親本(前雄性)的父系身份(即在排除母系貢獻(xiàn)后與后繼雄性等位基因零錯配，詳情見支持信息)。(Marshalletal.1998).FemaledifferentialallocationexperimentTodeterminewhethertheeffectofthefirstmale'sconditiononoffspringbodysizewasmediatedbysemen-bornefactorsorbyfemaledifferentialallocationbasedonpre-matingassessmentofmalequality,weperformedaseparateexperimentinwhichfemaleswereeithermatedtothefirstmale(matingtreatment),allowedtointeractbutnotmatewiththefirstmale(no-matingtreatment),orhousedadjacenttothefirstmalewithameshpartitionbetweenthemaleandfemale(partitiontreatment)(Fig.2b).Thematingtreatmentallowedsementransferbybothmales(asinthetelegonyexperiment),whereastheno-matingtreatmentpreventedejaculatetransferbythefirstmale,thusallowingustotestfordifferentialallocationbasedonpre-matingassessment.Thepartitiontreatmentwasintendedtoestablishwhethermalechemosensoryand(limited)visualcuesweresufficienttoallowforfemaleassessmentofmaleconditionanddifferentialallocation(ifany).雌性差異性分配實驗:為了確定前雄性的身體狀態(tài)對后代身體大小的影響是通過精液源性因素，還是通過交配前男性品質(zhì)評估決定的雌性差異化資源分配來起作用，我們另外進(jìn)行了單獨的實驗，其中部分雌性與前雄性交配(交配處置)，部分雌性允許與前雄性互動但不交配(無交配組)，或安置在與前雄性相鄰但被篩網(wǎng)分隔的培養(yǎng)室(分區(qū)處置)(圖2b)。交配處置(允許蠅交配)允許前雄性和后繼雄性實施精液轉(zhuǎn)移(就像在先父遺傳實驗中一樣)，而無交配處置阻止了前雄性的射精轉(zhuǎn)移，從而使我們能夠測定基于交配前評估差的差異分配。分隔處理的目的是確定雄性的化學(xué)感受器和(有限的)視覺線索是否足以讓雌性評價雄性的狀態(tài)和決定分配差異(如果有的話)。Inthematingtreatment,week-oldfemaleswereallowedtomatewithamaleineitherhighorlowcondition(nhigh=18,nlow=18)overaperiodof24h,asdescribedabove.Intheno-matingtreatment,femaleswerepairedwithahigh-conditionorlow-conditionmale(nhigh=19,nlow=19)for24h,butmatingwaspreventedbygluingthemalegenitaliashut.Maleswerebrieflyimmobilisedbycooling,andadropofmedicalglue(LeukosanUltraHighViscosityCyanoacrylate)wasplacedovertheepandriumtosealthegenitalia.Followingrecovery,malesbehavednormally,butwereunabletoachieveintromissionorspermtransfer(AJC,pers.obs.).Allmalesinthistreatmentwerefrozenafter36h.Inthepartitiontreatment,femalesbetween1and3weeksofagewerehousedwithahigh-orlow-conditionmale(nhigh=19,nlow=18)ontheoppositesideofameshpartition.Atage3weeks,femalesfromalltreatmentswereprovidedwithovipositionmediatoverifythatnomatinghadoccurredintheno-matingandpartitiontreatments:asexpected,onlyfemalesinthematingtreatmentlaidfertilisedeggsthathatchedintolarvae.Allfemaleswerethenmatedtoanewmale（alllow-condition）,andprovidedwithfreshovipositionmedium.Fromeachfemale,20eggsweretransferredtopoorlarvalmediumasdescribedabove,andadultoffspringwerecounted,sexedandmeasuredasdescribedabove（seeTableS3forsamplesizes）.在交配處置組，允許一周齡雌性與一只高或低狀態(tài)雄性交配24小時（高=18，低=18）,方法如上所述。在無交配處置組，雌性與一只高狀態(tài)或低狀態(tài)的雄性（高=19，低=19）配對24小時，但通過關(guān)閉雄性生殖器阻止交配的發(fā)生。隨后雄性立即進(jìn)行簡單的冷凍制動，用一滴醫(yī)用膠（leukosan超高粘度氰基丙烯酸酯）滴到雄蟲第九背片上以密封生殖器。恢復(fù)后，雄性表現(xiàn)正常，但無法實現(xiàn)插入或精子傳遞（AJC,pers.obs）。所有雄性在接受這種處置36小時后被冷凍。在分隔處理組，1周齡到3周齡之間的雌性被安置在與一只高或低狀態(tài)雄性（高=19，低=18）相鄰的地方，雙方以網(wǎng)格分隔。在3周齡時，向接受所有處置方法的雌性提供了產(chǎn)卵介質(zhì)，以驗證無交配組和分隔處置組沒有交配發(fā)生：正如預(yù)期的那樣，只有交配處置組的雌性產(chǎn)下受精卵并孵化成幼蟲。然后讓所有的雌性與一個新的雄性交配（皆為低狀態(tài)），并提供新鮮產(chǎn)卵介質(zhì)。從每個雌性的蟲卵中取20個轉(zhuǎn)移到如上所述的貧乏幼蟲培養(yǎng)液中，并計數(shù)其成年后代，性別鑒定和測量方法如上所述（見表S1中的樣本大?。?。Approximately80%offemalesinthisexperimentproducedadultoffspringformeasurementofadultbodysize（ntotal=994adultoffspring,TableS3）.約80%的雌性在這個實驗中產(chǎn)下了具有成體大小的成年后代（總樣本量=994個成年后代，表S3）。Dataanalysis數(shù)據(jù)分析AlldatawereanalysedusingJMP（version10.0.0,SASInstituteInc.,Cary,NC,USA）.Fromthetelegonyexperiment,offspringbodysize（thoraxlength）andeggsize（area）wereanalysedusinglinearmixedmodelsfittedbyrestrictedmaximumlikelihood（REML）,withfamilyincludedasarandomeffect,firstmalecondition（highorlow）,secondmalecondition（highorlow）andoffspringsexincludedasfixed,categoricaleffects,andmaternalbodysize,secondmalebodysizeanddevelopmenttimefittedascovariates.Modelswerere-fittedafterremovingnon-significantinteractions（alwaysleavingallmaineffects）（Quinn&Keough2002）.Toeliminatemulticollinearitybetweenbodysizeandcategoricalpredictors,malebodysize（thoraxlength）wasnormalised（mean=0,SD=1）withindiettreatment,andoffspringbodysizewasnormalisedwithinsex.所有數(shù)據(jù)分析采用JMP（10.0.0版，SAS研究公司，卡里，北卡羅來納，美國）。在先父遺傳實驗中，后代的身體尺寸（胸廓長度）和卵的大小（面積）使用線性混合模型中的約束最大似然擬合法（REML）來分析，其中以家系為隨機效應(yīng)，前雄性狀態(tài)（高或低），后繼雄性狀態(tài)（高或低）和后代性別作為固定和分類的效應(yīng)，而母親的身體大小，后繼雄性的身體大小和發(fā)育時間擬合為協(xié)變量。模型重新擬合后剔除掉非顯著的相互作用（總是留下所有的主要影響）（Quinn和Keough，2002）。為了消除身體尺寸和分類預(yù)測之間的多重共線性，雄性身體尺寸（胸廓長度）與飲食的關(guān)系進(jìn)行正態(tài)化處理（均數(shù)=0，標(biāo)準(zhǔn)差=1），而后代身體尺寸與性別的關(guān)聯(lián)也進(jìn)行正態(tài)化處理。Egg-to-adultviabilitywasmeasuredasthenumberofoffspringoutof20eggsthatemergedasadults,anddevelopmentaltimewasquantifiedasdaysbetweenovipositionandfirstadultemergence.BothvariableswereanalysedusingageneralisedlinearmodelwithPoissondistributionandloglinkfunction.Toverifythatfirstmaleconditionaffectedoffspringsiredbythesecondmale,were-analysedoffspringbodysizeusingonlythoseoffspringthatshowedageneticmatchtothesecondmale.Wefittedalinearmixedmodelasdescribedabove,exceptthatinsteadoffirstandsecondmalediet,wetestedatreatmenteffectdenotingfirstandsecondmale'sconditionincrossovertreatments(low-highvs.high-low).Wealsotestedwhetherpaternityvariedwithexperimentaltreatmentbyfittingageneralisedlinearmodel(Poissondistribution,loglinkfunction),withthenumberofoffspringperfamilysiredbythesecondmaleasthedependantvariable,treatment(high-loworlow-high)includedasafixed,categoricaleffect,andmaternalbodysize,secondmalebodysizeandnumberofgenotypedoffspringperfamilyfittedascovariates.蟲卵到成年的生存率定義為從20個蟲卵孵化長成成蟲的后代數(shù)量，而發(fā)育時間則確定為從產(chǎn)卵和成蟲羽化之間的天數(shù)。這兩個變量使用廣義線性模型泊松分布和log-link函數(shù)進(jìn)行了分析。為了驗證前雄性狀態(tài)能影響后繼雄性的后代，我們重新分析后代的身體大小，分析只納入那些表現(xiàn)出與后繼雄性遺傳匹配的后代。我們擬合了一個如上所述的線性混合模型，除了前雄性和后繼雄性的飲食，我們測試了能夠提示在交差設(shè)計中的前雄性和后繼雄性(低-高與高-低)的身體狀態(tài)的處置效果，我們還使用廣義線性模型(泊松分布，log-link函數(shù))來測試了父系血緣是否隨實驗處置變化，以每個由后繼雄性授精的家系子代的數(shù)量為因變量，以處置方法(高■低或低-高)為固定的分類的效應(yīng)，而母親的身體大小，后繼雄性的身體大小和基因分型后的后代數(shù)量擬合為協(xié)變量。Fromthedifferentialallocationexperiment,offspringbodysizewasanalysedusingalinearmixedmodelfittedbyREML,withfamilyfittedasarandomeffect,firstmalecondition(highorlow),housingtreatment(mating,no-mating,partition)andoffspringsexasfixed,categoricaleffects,anddevelopmenttime,maternalbodysizeandsecondmalebodysizefittedascovariates,alongwithalltwo-andthree-wayinteractions.在差異分配實驗中，后代的身體尺寸用基于最大似然擬合法擬合的線性混合模型分析，其中以家系為隨機效應(yīng)，以前雄性狀態(tài)(高或低)，安置處置(交配，無交配，分隔)，后代性別作為固定的，分類的效應(yīng)，發(fā)育時間，母蠅和后繼雄性的身體大小，以及所有兩方和三方的相互作用作為協(xié)變量,。Thismodelwasre-fittedaftereliminatingcovariatesandinteractionsthatwerefarfromsignificance(P>0.2),andinteractioncontrasts(Quinn&Keough2002)werecarriedoutwithinthismodelbyassigningcoefficients(1or1)tospecificcombinationsoftreatmentlevelssoastodefineandtesttheinteractionsofinterestbetweenfirstmaledietandthelevelsofthehousingtreatment(matingvs.no-mating;matingvs.partition).Femaledifferentialallocationbasedonpre-matingassessmentwouldbemanifestedasanoverall(main)effectoffirstmalecondition.Semen-mediatedeffectsoffirstmaleconditionwouldbemanifestedasafirstmaleconditionXhousingtreatmentinteraction,wherebyhighfirstmaleconditionconferredincreasedoffspringbodysizeonlywhenthefirstmalewasallowedtomatewiththefemale.在剔除遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到顯著差異的協(xié)變量(P〉0.2)后該模型被重新擬合，并通過賦與特定處置水平組合一定的系數(shù)(1或T)進(jìn)行交互作用對比(Quinn&Keough2002),以便確定并檢測前雄性飲食與安置處置水平(交配：無交配；交配：隔離)之間的利益交互。雌性基于交配前評估的資源差異分配表達(dá)為前雄性狀態(tài)的一個整體(主要)的影響。精液介導(dǎo)的前雄性狀況的效應(yīng)表達(dá)為一種前雄性狀態(tài)X安置處置交互，只有當(dāng)前雄性被允許與雌性交配時，高的前雄性狀態(tài)賦予后代更大的身體尺寸。RESULTSFirstandsecondmaleconditionandoffspringphenotypeWefoundthattheadultbodysizeofoffspringwasinfluencedpositivelybytheconditionoffemales'initialmate(‘firstmale'):offspringwere?0.5SDlargerwhenthefemalewasinitiallymatedtoahigh-conditionmalethanwhenthefemalewasinitiallymatedtoalow-conditionmale(Fig3a).However,offspringbodysizewasnotaffectedbytheconditionoffemales'subsequentmate(‘secondmale'),oraninteractionbetweenfirstandsecondmales'condition(Tablela;Fig.3a;TableS4a;Fig.SI).結(jié)果前雄性和后繼雄性狀態(tài)和后代表型：我們發(fā)現(xiàn)，后代的成體大小受到雌性的初次交配(第一個雄性)的正向影響：當(dāng)雌性初次交配的雄性是高狀態(tài)的時，后代相比初次與低狀態(tài)雄性交配要大0.5個標(biāo)準(zhǔn)差(圖3a)。然而，后代的身體尺寸并不被雌性后繼擇偶條件(第二個雄性)的影響，也不被前雄性與后繼雄性的狀態(tài)之間的互動影響(表1A；圖3A；表S4A；圖S1)。Offspringbodysizewaspositivelyrelatedtomaternalbodysize,butnotrelatedtothebodysizeofthesecondmale(putativesire).Therewasalsoanassociationbetweenoffspringbodysizeanddevelopmentaltime(Tablela).However,developmentaltimewasnotaffectedbyfirstorsecondmalecondition(TableS4d).Theeffectoffirstmaleconditiononoffspringbodysizewasnotmediatedbyeggsize:largerfemalestendedtoproducelargereggs,buteggsizewasnotaffectedbyeitherthefirstorsecondmale'scondition(Table1b).后代身體尺寸與母體身體尺寸呈正相關(guān)，但與后繼雄性(假定的父親)的體型不相關(guān)。后代的身體大小和發(fā)育時間之間也有關(guān)聯(lián)(表la)。然而，發(fā)育時間不受前雄性或后繼雄性的身體狀態(tài)影響(表S4d)。前雄性狀態(tài)對子代身體尺寸的影響不是由蟲卵大小介導(dǎo)的：較大的雌性往往產(chǎn)下較大的蟲卵，但蟲卵大小并不受前雄性以及后繼雄性影響(表1B)。Weobservedatrendtowardshigheregg-to-adultviabilityofoffspringwhenthefirstmalewasi