丹參提取物中丹參素和原兒茶醛在體腸吸收動力學研究

丹參提取物中丹參素和原兒茶醛在體腸吸收動力學研究

丹參是嘴唇科植物的丹參。它含有丹參素、原兒茶素、a、原兒茶素、酸、胺和其他化合物。具有微循環(huán)、抗凝、抗高血壓、抗高血壓、抗血郁等功效。它通常用于治療冠狀動脈粥樣硬化和心絞痛?？诜o藥時,腸道是藥物吸收的主要部位,因此研究藥物在腸道的吸收情況對于明確藥物在體內(nèi)的作用途徑及吸收機制具有重要意義。目前關于丹參中活性成分的單體在腸道吸收情況的研究已有報道,但研究這些活性成分在化學成分復雜的提取物中的腸吸收機制的較少,而這種研究更符合藥物真實的吸收情況。本實驗采用大鼠在體單向灌流模型,通過穩(wěn)定性預試驗,選取丹參素、原兒茶醛作為指標成分,研究其在大鼠腸吸收情況,以期為丹參新制劑的研發(fā)提供生物藥劑學依據(jù)。1藥材、藥品與試劑LEAD—1型電子蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司);Agilent1100型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD)(美國惠普公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);AL104分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。丹參素對照品(批號110855-200507)、原兒茶醛對照品(批號110810-200506),中國藥品生物制品檢定所;丹參藥材購于安徽亳州中正中藥飲片有限公司,經(jīng)江西中醫(yī)學院龔千峰教授鑒定為正品。Kreb-Ringer’s營養(yǎng)液(K氏液,每1L含NaCl7.8g、KCl0.35g、CaCl20.37g、NaH2PO40.32g、NaHCO31.37g、MgCl20.02g、葡萄糖1.4g),生理鹽水(批號06111613,開開援生制藥股份有限公司),戊巴比妥鈉(批號020919,北京化學試劑公司)。雄性SD大鼠,體質量(210±20)g,江西中醫(yī)學院清潔級實驗動物中心提供,合格證號:SCXXK(贛)2005-0001。2方法和結果2.1乙醇的回收取丹參藥材約100g,加水500mL,煎煮2次(1.5、1h),合并煎液,濾過,濾液減壓濃縮至含生藥1.3g/mL,加乙醇使其體積分數(shù)為70%,冷藏(4℃)24h,濾過,減壓回收乙醇,濃縮至含生藥2.5g/mL,再加乙醇,使乙醇體積分數(shù)達85%,冷藏24h,濾過,減壓回收乙醇,加水至200mL,冷藏24h,濾過,噴霧干燥,收集干粉備用。精密稱取噴干物30mg,置于25mL量瓶中加水溶解,并稀釋至刻度,按照“2.2”項下色譜條件,測得噴干粉中丹參素、原兒茶醛的質量分數(shù)分別為4.03%、1.06%。2.2丹參素和原始茶的測定2.2.1流動相3442色譜柱為HypersilODS2C18柱(250mm×4.6mm,5μm,大連依利特分析儀器有限公司);流動相為水-甲醇-二甲基甲酰胺-冰醋酸(90∶4∶4∶2);柱溫35℃;體積流量0.8mL/min;檢測波長280nm;進樣量10μL。2.2.2對照品儲備液的制備精密稱取丹參素對照品7.14mg,置100mL量瓶中,用K氏液溶解并稀釋至刻度,搖勻,得71.4μg/mL丹參素對照品儲備液。精密稱取原兒茶醛對照品5.32mg,置25mL量瓶中,用K氏液溶解并稀釋至刻度,搖勻,得212.8μg/mL原兒茶醛對照品儲備液。2.2.3供試品溶液配制收集大鼠灌流6h后的空白腸灌流液,以此腸灌流液配制質量濃度為1.5mg/mL的丹參提取物溶液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,濾液作為供試品溶液。2.2.4空白腸灌流液測定分別取丹參素對照品溶液、原兒茶醛對照品溶液、供試品溶液及空白腸灌流液依法測定,色譜圖見圖1。丹參素和原兒茶醛的保留時間分別為8.6min和15.6min,供試品溶液主峰保留時間與對照品溶液一致,空白灌流液無干擾。2.2.5對照品溶液的制備分別精密量取丹參素對照品儲備液和原兒茶醛對照品儲備液0.25、0.5、1、2、4、8mL置10mL量瓶中,用K氏液稀釋并定容至刻度,分別得到一系列質量濃度的丹參素和原兒茶醛對照品溶液。各進樣10μL,測定,分別以峰面積積分值對對照品質量濃度進行線性回歸,得回歸方程:丹參素Y=725.73X+0.6667(R2=0.9993),表明丹參素在1.8~57.1μg/mL線性關系良好;原兒茶醛Y=5904.6X-28.071(R2=0.9999),表明原兒茶醛在5.32~170.2μg/mL線性關系良好。2.2.6精密度和標準曲線分別精密稱取丹參素對照品和原兒茶醛對照品適量,用空白腸灌流液稀釋至不同倍數(shù),得高、中、低(丹參素依次為7.14、14.28、29.54μg/mL;原兒茶醛依次為21.17、42.98、84.42μg/mL)3個質量濃度的對照品溶液,于1d中不同時間取樣,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,進樣10μL,測定,以1d內(nèi)測定的5次結果計算精密度。計算得丹參素峰面積的RSD分別為3.70%、1.18%、1.82%;原兒茶醛峰面積的RSD分別為2.93%、1.47%、2.21%。2.2.7白腸灌流液參數(shù)估計分別精密稱取丹參素和原兒茶醛對照品適量,先用1%冰醋酸溶解,定容至25mL。精密吸取1mL,用空白腸灌流液稀釋至不同倍數(shù),得高、中、低3個質量濃度(丹參素依次為7.14、14.28、29.54μg/mL;原兒茶醛依次為21.17、42.98、84.42μg/mL)的供試品溶液,各依法測定3次,計算回收率。丹參素和原兒茶醛的平均回收率分別為101.39%、100.05%,RSD分別為2.17%、2.23%。2.2.8不同濃度對原兒茶醛峰面積的rsd分別用K氏液和空白腸灌流液配制1.5mg/mL的丹參提取物溶液各3份,37℃水浴孵育6h,分別于1、2、3、4、5、6h取樣,進行HPLC分析,在K氏液和空白腸灌流液中計算得丹參素峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%;原兒茶醛峰面積的RSD分別為1.3%、1.6%。表明在37℃水浴中放置6h,樣品中丹參素和原兒茶醛基本穩(wěn)定(RSD<2%)。2.3大鼠通過個體一側流暢地吸收2.3.1術后吸附法:提取干酵母,固定施工工藝實驗前用供試液將管路(不包含被考察腸段)飽和一段時間,直至出口藥液質量濃度與供試液質量濃度相等,以消除實驗過程中管路對藥物的吸附作用。將禁食一夜(自由飲水)的大鼠稱定質量,ip戊巴比妥鈉(劑量為0.4mg/kg),麻醉后加以固定。沿腹中線打開腹腔(長約3cm)。分離出待考察的腸段,取約10cm于兩端切口,于切口處插管(出口液插管約3cm),結扎,并用37℃預熱的生理鹽水輕緩地將腸內(nèi)容物沖洗干凈。將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕,在紅外燈下對大鼠保溫。將大鼠連接到灌流裝置中。2.3.2小瓶收集一次10min7進口處用已測定質量的裝有供試液的小瓶進行灌流,開動蠕動泵,體積流量0.2mL/min,每隔15min在出口處用另一已測定質量的小瓶收集一次(同時更換下一個供試液小瓶和收集液小瓶),稱量此時供試液小瓶和收集液小瓶的質量,并測定丹參素、原兒茶醛的質量濃度。實驗持續(xù)時間為105min(15min×7)。最后將大鼠處死,剪下被灌流的腸段,測量其長度和直徑。2.3.3灌流腸段的大小全可疑的偶然誤差值的計算凈水流量(NWF)、藥物吸收速率常數(shù)(Ka)、藥物表觀吸收系數(shù)(Papp)的計算如下:Qin和Qout分別為腸道進出口灌流液的體積(mL,假設進出口灌流液的密度均為1.0mg/mL);l和r分別為被灌流腸段的長度(cm)和橫截面半徑(cm);Q為灌流體積流量(約0.2mL/min),V為灌流腸段的體積(cm3)根據(jù)Grubbs法對每組數(shù)據(jù)中獲得的7個Ka和Papp值進行偶然誤差值的取舍,取舍后必須保證3個以上的Ka和Papp值無顯著誤差,最終的Ka和Papp值分別為這幾個相近值的平均值。Grubbs法-G檢驗法檢驗步驟如下:a)算出包括可疑值在內(nèi)的平均值;b)計算可疑值與平均值之差;c)算出包括可疑值在內(nèi)的標準偏差S;d)用標準偏差除可疑值與平均值之差,得G值:G=|X可疑-X|/S;e)查G的臨界值表,若計算的G值大于表中查到的臨界值,就可以把可疑值舍棄。2.4灌流體積流量對藥物吸收kras-papp的影響將8只大鼠隨機分成兩組,以小腸(約為10cm)為灌流部位,供試液藥物質量濃度(以丹參提取物計)為1.5mg/mL,pH值6.8,灌流體積流量分別為0.2、0.4、0.8mL/min。第1組灌流體積流量從0.2mL/min逐漸升至0.8mL/min;第2組灌流體積流量從0.8mL/min逐漸降至0.2mL/min。每次灌流體積流量更換前用10mL供試液對腸道進行清洗,每種灌流體積流量下持續(xù)時間45min(15min×3),用質量法計算Ka和Papp,比較不同灌流體積流量下藥物吸收的Ka和Papp值。由圖2、3可知,灌流體積流量對于丹參素和原兒茶醛的吸收參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)。隨著灌流體積流量的增大,這兩種指標成分的Ka和Papp均呈線性增大,線性方程分別為:丹參素KaY=13.511X-2.365,R2=0.9844;原兒茶醛KaY=11.686X-1.76,R2=0.9876;丹參素PappY=18.9X-3.41,R2=0.9826;原兒茶醛PappY=16.189X-2.545,R2=0.9859。灌流體積流量在一定程度上代表了腸道的蠕動狀態(tài),因此任何影響腸道蠕動狀態(tài)的因素都可能影響藥物在腸道的吸收。為了減少試驗誤差,在本實驗過程中,灌流體積流量固定為0.2mL/min。2.5ph值對藥物吸收papp的影響用稀鹽酸和稀氫氧化鈉調節(jié)供試液的pH值分別為7.4、6.8、5.5,供試液質量濃度(以丹參提取物計)1.5mg/mL,以小腸(約10cm)為灌流部位,體積流量0.2mL/min,每種pH值條件下實驗持續(xù)105min(15min×7),用質量法計算Ka和Papp,比較3種不同pH值條件下藥物在小腸吸收的Ka和Papp值,結果見表1。經(jīng)ANOVA分析表明,在考察pH值范圍內(nèi),供試液的pH值對藥物吸收有顯著影響(P<0.05),丹參素和原兒茶醛的Ka和Papp均隨pH值的降低而升高,pH5.5與pH6.8的吸收無顯著差異,而pH5.5與7.4的吸收差異顯著(P<0.05)。2.6兩組papp的計算以小腸(約為10cm)為灌流部位,供試液藥物質量濃度(以丹參提取物計)為1.5mg/mL,灌流體積流量0.2mL/min,pH值6.8,比較膽管結扎與不結扎條件下小腸吸收的Ka和Papp值,每組實驗持續(xù)105min(15min×7),用質量法計算Ka和Papp,結果見表2。經(jīng)ANOVA分析表明,膽管結扎組與不結扎組的丹參素和原兒茶醛小腸吸收參數(shù)均無顯著差異,說明膽管結扎與否對丹參素和原兒茶醛小腸吸收沒有顯著影響,提示丹參素和原兒茶醛小腸吸收可能不受膽汁排泄與分泌的影響,且不存在肝腸循環(huán)。2.7不同腸段其對k-pa的吸收各腸段區(qū)間如下:十二指腸段(自幽門下1cm處開始往下10cm止),空腸段(自幽門下15cm起往下10cm止),回腸段(自盲腸上行20cm處開始往下10cm止),結腸段(盲腸后端開始往下10cm止),整腸段(自十二指腸上端起至回腸下端止)。以1.5mg/mL的丹參提取物溶液對各腸段灌流,體積流量0.2mL/min,pH值6.8。將各段上的插管分別接上恒流泵,每個腸段試驗持續(xù)105min(15min×7),用質量法計算Ka和Papp,比較各腸段藥物吸收的Ka和Papp值,結果見表3。經(jīng)ANOVA分析表明,對于丹參素,Ka和Papp在十二指腸和空腸沒有顯著差異,其他各腸段之間均有顯著差異(P<0.05),吸收按照十二指腸、空腸、回腸和結腸的順序依次下降,丹參素的腸上端吸收要比下端好;而原兒茶醛在各腸段均有良好的吸收,不存在吸收特異性部位。2.8質量濃度對papp的影響采用K氏液配制質量濃度分別為0.8、1.5、2.2mg/mL的供試液(以丹參提取物計)。以小腸為灌流部位,灌流體積流量0.2mL/min,pH值6.8,每種質量濃度試驗持續(xù)105min(15min×7),用質量法計算Ka和Papp,比較低、中、高3種質量濃度下丹參素和原兒茶醛在小腸吸收的Ka和Papp值,結果見表4。經(jīng)ANOVA分析表明在考察質量濃度范圍內(nèi),原兒茶醛在小腸吸收的Ka和Papp無明顯變化,提示其主要以被動擴散機制吸收進入體循環(huán);而丹參素的Ka和Papp均隨其質量濃度的升高而降低,即丹參素在小腸的吸收有自身濃度抑制作用,考慮其吸收機制除被動擴散外,還可能有主動轉運或易化擴散。2.9p-糖蛋白p-gdp對丹參素和原兒茶醛的吸收有影響3質量法測定參素及原兒茶醛含量與傳統(tǒng)的“在體循環(huán)法”相比,單向灌流法的實驗條件與口服給藥后藥物接觸的腸道環(huán)境更接近,因為口服給藥后溶解的藥物并不存在腸內(nèi)循環(huán)過程。文獻報道健康志愿者體內(nèi)腸灌流技術中多采用灌流體積流量2~3mL/min,由于大鼠腸道直徑約為人體腸道直徑的1/10,因而選用較低灌流體積流量的單向灌流法比在體循環(huán)法更能符合人體的實際情況。由于該方法的灌流時間只有十幾分鐘,可以避免一些相對不穩(wěn)定藥物由于在腸道內(nèi)較長時間循環(huán)含量降低而對吸收結果造成的干擾。腸的吸收過程中,不僅吸收藥物,也吸收或分泌水分,導致供試液體積發(fā)生變化,故不能用直接測定藥物質量濃度的方法計算剩余的藥量。目前多采用腸道不吸收的酚紅作為灌流液體積的標識物。然而,在長時間的灌流過程中,酚紅也存在一定程度的腸吸收,另外酚紅本身還可能干擾某些化合物在腸道的轉運和分析測定。本實驗采用的質量法不涉及“標識物”的測定,避免了空白灌流液給紫外吸收帶來的干擾,數(shù)據(jù)更精確,與傳統(tǒng)的酚紅法相比大大減少了工作量。HPLC法同時測定制劑中丹參素、原兒茶醛已有報道。經(jīng)對比,選用水-甲醇-二甲基甲酰胺-冰醋酸(90∶4∶4∶2)為流動相。丹參素分子結構中有鄰二酚羥基,易被氧化成苯醌而變色,其水溶液不穩(wěn)定,宜現(xiàn)配現(xiàn)用。用1%冰醋酸制備的對照品溶液,質量濃度在3周內(nèi)基本不變。采用本實驗所建立的色譜條件亦可同時測定丹參提取物中丹酚酸B的量,但預試驗表明丹酚酸B在結腸灌流液中不穩(wěn)定,2h降低30%。故本實驗選取在腸灌流液中相對穩(wěn)定的丹參素和原兒茶醛作為檢測丹參提取物腸吸收的指標成分。實驗結果表明,2種指標成分均隨供試液pH值的降低而呈現(xiàn)吸收增加的趨勢,這符合pH分配假說。丹參素和原兒茶醛均屬于弱酸性物質,當pH值降低時其解離程度下降,使分子型藥物比例上升,有利于藥物透膜吸收。丹參素和原兒茶醛在全腸段均有一定吸收,丹參素在小腸的吸收隨提取物質量濃度