基因工程的原理和技術(shù)

什么叫基因工程？基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。核心——構(gòu)建重組DNA分子科技探索之路基因工程誕生的理論基礎(chǔ)：DNA是生物遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立以及遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定基因工程的技術(shù)保障：？DNA重組技術(shù)的基本工具準(zhǔn)確切割DNA的工具（“基因的剪刀”）DNA片段的連接工具（“基因的針線”）基因轉(zhuǎn)移工具（“運(yùn)載體”）基因的大小以納米計(jì)算，要對(duì)它進(jìn)行剪切、拼接等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：重播大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。一、“基因的剪刀”——限制性核酸內(nèi)切酶二、“基因的針線”——

DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。作為運(yùn)載體的必要條件能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害三、基因的運(yùn)載工具——運(yùn)載體常用的運(yùn)載體：1）細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒

2）噬菌體或某些動(dòng)植物病毒質(zhì)粒是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。存在于細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中。1.水母發(fā)光蛋白由236個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中Asp、Gly、Ser構(gòu)成發(fā)光環(huán)，現(xiàn)已將這種蛋白質(zhì)的基因作為生物轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，這種蛋白質(zhì)的作用是 A．促使目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中 B．使目的基因容易被檢測(cè)出來C．促使目的基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制 D．使目的基因容易成功表達(dá)B2．現(xiàn)有一長(zhǎng)度為3000堿基對(duì)(bp)的線性DNA分子，用限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，進(jìn)行凝膠電泳，使降解產(chǎn)物分開。用酶H單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖l。用酶B單獨(dú)酶切，結(jié)果如圖2。用酶H和酶B同時(shí)酶切，結(jié)果如圖3。下列相關(guān)敘述正確的是BA．酶H有2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)B．酶B和酶H同時(shí)切割時(shí)，有3個(gè)識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)C．酶B和酶H同時(shí)切割時(shí)，能產(chǎn)生完全相同的酶切片段D．酶B和酶H有相同的識(shí)別和切割位點(diǎn)3．下列關(guān)于生物工程中常用的幾種酶的敘述中，錯(cuò)誤的是A．一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列，能用于提取目的基因B．DNA連接酶可把目的基因與運(yùn)載體黏性末端的堿基黏合，能形成重組DNAC．纖維素酶、果膠酶可分解細(xì)胞壁，能用于原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)D．胰蛋白酶能使動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞，能用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)B練習(xí)1.下圖表示一項(xiàng)重要的生物技術(shù)，對(duì)圖中物質(zhì)a、b、c、d的描述，判斷正誤

A．a(chǎn)通常存在于細(xì)菌體內(nèi)，目前尚未發(fā)現(xiàn)真核生物體內(nèi)有類似的結(jié)構(gòu)B．b識(shí)別特定的核苷酸序列，并將A與T之間的氫鍵切開C．c連接雙鏈間的A和T，使黏性末端處堿基互補(bǔ)配對(duì)×××2.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C．增加質(zhì)粒分子的分子量D．便于與外源基因連接B第二節(jié)基因工程的原理和技術(shù)閱讀課本P5-7頁(yè)回答以下問題:1.簡(jiǎn)述基因工程的基本原理2.概述基因工程操作的基本步驟獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因的表達(dá)一、獲取目的基因1.獲取目的基因的方法（1）已知目的基因序列時(shí)，可以用人工合成的方法反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法目的基因的提取方法：人工合成A.反轉(zhuǎn)錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成已知目的基因的序列時(shí)B.可以從無(wú)到有合成2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。可以獲得大量的目的基因。循環(huán)變性退火延伸目的基因的擴(kuò)增呈指數(shù)形式擴(kuò)增（2n）PCR技術(shù)①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________。前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制模板(已知基因的核苷酸序列)四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增必須對(duì)目的基因有一定的了解，需要設(shè)計(jì)引物⑥過程：a.DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b.退火（復(fù)性50℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c.延伸（70℃-75℃）：在DNA聚合酶的作用下，從引物延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA雙鏈

基因組文庫(kù)的構(gòu)建

將總DNA經(jīng)過酶解，分離不同長(zhǎng)短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫(kù)。3.如果未知基因的序列:建立基因文庫(kù)基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中通過克隆而儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因比較基因、目的基因、基因文庫(kù)的區(qū)別基因：有遺傳效應(yīng)的DNA片段，是控制生物性狀的遺傳物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位目的基因：是基因工程操作中需要的外源基因二、形成重組DNA分子——核心步驟質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIHindIIISmaI目的基因質(zhì)粒1.圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒,能不能使用SmaI切割?為什么?思考2.若將圖中的目的基因插入載體,需要用哪一種限制酶同時(shí)切割載體和目的基因?3.與只使用EcoRI相比較,使用BamHI和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？三、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)獲得重組質(zhì)粒體外顯微注射入受精卵受精卵移植1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)（最多、最有效）3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理，以增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。四、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞導(dǎo)入過程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞很少怎樣篩選？AmprTetr氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因目的基因插入四環(huán)素抗性基因中將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上然后將菌落平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)從分子水平進(jìn)行篩選DNA分子雜交DNA探針含有目的基因不含目的基因重組DNA鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等五、目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá)是基因工程完成的標(biāo)志插入哪一條染色體、插入某一染色體的位置都是隨機(jī)的，這樣可能破壞正?；虻慕Y(jié)構(gòu)和功能，使受體細(xì)胞不能完成某項(xiàng)生命活動(dòng)甚至死亡。目的基因插入動(dòng)植物細(xì)胞基因組的隨機(jī)性問題糖蛋白是蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工完成的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這種細(xì)胞器，因此，由大腸桿菌中生產(chǎn)糖蛋白是不可能的。基因工程中生產(chǎn)糖蛋白，為什么不選大腸桿菌而選酵母菌為受體細(xì)胞？這就可以解釋基因工程中為何用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素原、而用酵母菌生產(chǎn)干擾素。◆用基因工程技術(shù)可使大腸桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是A．常用相同的限制性內(nèi)切酶處理的基因和質(zhì)粒B．DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒D．導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá)

B◆下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 ②從基因組文庫(kù)中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提取 ④利用PCR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥ C．①②③④ D．①②④⑥D(zhuǎn)◆基因工程又叫基因拼接技術(shù)。

(1)在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的

為模板，

成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成

。

(2)基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、

。(3)假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運(yùn)載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運(yùn)載體與目的基因，將切割后的運(yùn)載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有

種環(huán)狀DNA分子，它們分別是

。信使RNA

逆轉(zhuǎn)錄

雙鏈DNA(目的基因)動(dòng)植物細(xì)胞

3

質(zhì)粒自連的、目的基因片段自連的、質(zhì)粒與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子◆繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：（1）將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是___________。（2進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是，通常要將外源基因轉(zhuǎn)入___________中，原因是_____________。（3）通常采用_______技術(shù)檢測(cè)外源基因是否插入了小鼠的基因組（4）在研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)使外源基因在小鼠的________細(xì)胞中特異表達(dá)。

(5）為使外源基因在后代長(zhǎng)期保持，可將轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞的___

__轉(zhuǎn)入________細(xì)胞中構(gòu)成重組細(xì)胞，使其發(fā)育成與供體具有相同性狀的個(gè)體。該技術(shù)稱為_______顯微注射法

受精卵（早期胚胎）

受精卵（或早期胚胎）具有全能性，可使外源基因在相應(yīng)組織細(xì)胞表達(dá)DNA分子雜交

膀胱上皮

細(xì)胞核

去核的卵

核移植（或克?。?/p>

◆（2009高考-X江蘇）人體細(xì)胞內(nèi)含有抑制癌癥發(fā)生的P53基因，生物技術(shù)可對(duì)此類基因的變化進(jìn)行檢測(cè)。（3）已知限制酶E識(shí)別序列為CCGG,若用限制酶E分別完全切割正常人和患者的P53基因部分區(qū)域（見上圖），那么正常人的會(huì)被切成_____個(gè)片段，而患者的則被切割成長(zhǎng)度為________對(duì)堿基和________對(duì)堿基的兩種片段。（4）如果某人的P53基因部分區(qū)域經(jīng)限制酶E完全切割后，共出現(xiàn)170、220、290和460堿基對(duì)的四種片段，那么該人的基因型是________（以P+表示正?；颍琍n表示異?；颍?。◆（10江蘇卷）下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圈l、圈2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。請(qǐng)回答下列問題：（1