基因工程的原理和技術

什么叫基因工程？基因工程又叫基因拼接技術或DNA重組技術。就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。核心——構建重組DNA分子科技探索之路基因工程誕生的理論基礎：DNA是生物遺傳物質的發(fā)現(xiàn)、DNA雙螺旋結構的確立以及遺傳信息傳遞方式的認定基因工程的技術保障：？DNA重組技術的基本工具準確切割DNA的工具（“基因的剪刀”）DNA片段的連接工具（“基因的針線”）基因轉移工具（“運載體”）基因的大小以納米計算，要對它進行剪切、拼接等操作，沒有非常精細的工具是不行的。進行基因操作最少需要以下三種工具：重播大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。一、“基因的剪刀”——限制性核酸內切酶二、“基因的針線”——

DNA連接酶

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。作為運載體的必要條件能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存；具多個限制酶切點，以便與外源基因連接；具有某些標記基因，便于進行篩選。對受體細胞無害三、基因的運載工具——運載體常用的運載體：1）細菌細胞質的質粒

2）噬菌體或某些動植物病毒質粒是細胞染色體外能夠自主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、酵母菌和放線菌等生物中。1.水母發(fā)光蛋白由236個氨基酸構成，其中Asp、Gly、Ser構成發(fā)光環(huán)，現(xiàn)已將這種蛋白質的基因作為生物轉基因的標記，在轉基因技術中，這種蛋白質的作用是 A．促使目的基因導入宿主細胞中 B．使目的基因容易被檢測出來C．促使目的基因在宿主細胞中復制 D．使目的基因容易成功表達B2．現(xiàn)有一長度為3000堿基對(bp)的線性DNA分子，用限制性核酸內切酶酶切后，進行凝膠電泳，使降解產(chǎn)物分開。用酶H單獨酶切，結果如圖l。用酶B單獨酶切，結果如圖2。用酶H和酶B同時酶切，結果如圖3。下列相關敘述正確的是BA．酶H有2個識別位點和切割位點B．酶B和酶H同時切割時，有3個識別位點和切割位點C．酶B和酶H同時切割時，能產(chǎn)生完全相同的酶切片段D．酶B和酶H有相同的識別和切割位點3．下列關于生物工程中常用的幾種酶的敘述中，錯誤的是A．一種限制酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列，能用于提取目的基因B．DNA連接酶可把目的基因與運載體黏性末端的堿基黏合，能形成重組DNAC．纖維素酶、果膠酶可分解細胞壁，能用于原生質體的制備和培養(yǎng)D．胰蛋白酶能使動物組織分散成單個細胞，能用于動物細胞培養(yǎng)B練習1.下圖表示一項重要的生物技術，對圖中物質a、b、c、d的描述，判斷正誤

A．a(chǎn)通常存在于細菌體內，目前尚未發(fā)現(xiàn)真核生物體內有類似的結構B．b識別特定的核苷酸序列，并將A與T之間的氫鍵切開C．c連接雙鏈間的A和T，使黏性末端處堿基互補配對×××2.人們常選用的細菌質粒分子往往帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是A．提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性B．有利于對目的基因是否導入進行檢測C．增加質粒分子的分子量D．便于與外源基因連接B第二節(jié)基因工程的原理和技術閱讀課本P5-7頁回答以下問題:1.簡述基因工程的基本原理2.概述基因工程操作的基本步驟獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導入受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞目的基因的表達一、獲取目的基因1.獲取目的基因的方法（1）已知目的基因序列時，可以用人工合成的方法反轉錄法化學合成法目的基因的提取方法：人工合成A.反轉錄法：目的基因的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成已知目的基因的序列時B.可以從無到有合成2.利用PCR技術擴增目的基因聚合酶鏈式反應(PCR)，在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。可以獲得大量的目的基因。循環(huán)變性退火延伸目的基因的擴增呈指數(shù)形式擴增（2n）PCR技術①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③條件：_______________________、

_______________、___________、___________。前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制模板(已知基因的核苷酸序列)四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物⑥過程：a.DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b.退火（復性50℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c.延伸（70℃-75℃）：在DNA聚合酶的作用下，從引物延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA雙鏈

基因組文庫的構建

將總DNA經(jīng)過酶解，分離不同長短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質?；蚴删w載體上，轉染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基因組文庫。3.如果未知基因的序列:建立基因文庫基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中通過克隆而儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因比較基因、目的基因、基因文庫的區(qū)別基因：有遺傳效應的DNA片段，是控制生物性狀的遺傳物質的基本結構和功能單位目的基因：是基因工程操作中需要的外源基因二、形成重組DNA分子——核心步驟質粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種一個切口兩個黏性末端抗生素抗性基因SmaIBamHIHindIIIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIHindIIISmaI目的基因質粒1.圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒,能不能使用SmaI切割?為什么?思考2.若將圖中的目的基因插入載體,需要用哪一種限制酶同時切割載體和目的基因?3.與只使用EcoRI相比較,使用BamHI和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優(yōu)點是什么？三、將重組DNA分子導入受體細胞常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。1）將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法2.將目的基因導入動物細胞顯微注射技術獲得重組質粒體外顯微注射入受精卵受精卵移植1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法2.將目的基因導入動物細胞顯微注射技術（最多、最有效）3.將目的基因導入微生物細胞Ca2+處理，以增加細菌細胞壁的通透性。四、篩選含有目的基因的受體細胞導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少怎樣篩選？AmprTetr氨芐青霉素抗性基因四環(huán)素抗性基因目的基因插入四環(huán)素抗性基因中將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上然后將菌落平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)從分子水平進行篩選DNA分子雜交DNA探針含有目的基因不含目的基因重組DNA鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等五、目的基因的表達目的基因的表達是基因工程完成的標志插入哪一條染色體、插入某一染色體的位置都是隨機的，這樣可能破壞正常基因的結構和功能，使受體細胞不能完成某項生命活動甚至死亡。目的基因插入動植物細胞基因組的隨機性問題糖蛋白是蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網(wǎng)上加工完成的。內質網(wǎng)存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這種細胞器，因此，由大腸桿菌中生產(chǎn)糖蛋白是不可能的。基因工程中生產(chǎn)糖蛋白，為什么不選大腸桿菌而選酵母菌為受體細胞？這就可以解釋基因工程中為何用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素原、而用酵母菌生產(chǎn)干擾素?！粲没蚬こ碳夹g可使大腸桿菌合成人的蛋白質。下列敘述不正確的是A．常用相同的限制性內切酶處理的基因和質粒B．DNA連接酶和RNA聚合酶是構建重組質粒必需的工具酶C．可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測大腸桿菌中是否導入了重組質粒D．導入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達

B◆下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成 ②從基因組文庫中提取③從受體細胞中提取 ④利用PCR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成A．①②③⑤B．①②⑤⑥ C．①②③④ D．①②④⑥D◆基因工程又叫基因拼接技術。

(1)在該技術中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉錄的

為模板，

成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成

。

(2)基因工程中常用的受體細胞有細菌、真菌、

。(3)假設以大腸桿菌質粒作為運載體，并以同一種限制性內切酶切割運載體與目的基因，將切割后的運載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有

種環(huán)狀DNA分子，它們分別是

。信使RNA

逆轉錄

雙鏈DNA(目的基因)動植物細胞

3

質粒自連的、目的基因片段自連的、質粒與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子◆繼哺乳動物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進展。最近，科學家培養(yǎng)出一種轉基因小鼠，其膀胱上皮細胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中。請回答：（1）將人的生長激素基因導入小鼠受體細胞，常用方法是___________。（2進行基因轉移是，通常要將外源基因轉入___________中，原因是_____________。（3）通常采用_______技術檢測外源基因是否插入了小鼠的基因組（4）在研制膀胱生物反應器時，應使外源基因在小鼠的________細胞中特異表達。

(5）為使外源基因在后代長期保持，可將轉基因小鼠細胞的___

__轉入________細胞中構成重組細胞，使其發(fā)育成與供體具有相同性狀的個體。該技術稱為_______顯微注射法

受精卵（早期胚胎）

受精卵（或早期胚胎）具有全能性，可使外源基因在相應組織細胞表達DNA分子雜交

膀胱上皮

細胞核

去核的卵

核移植（或克?。?/p>

◆（2009高考-X江蘇）人體細胞內含有抑制癌癥發(fā)生的P53基因，生物技術可對此類基因的變化進行檢測。（3）已知限制酶E識別序列為CCGG,若用限制酶E分別完全切割正常人和患者的P53基因部分區(qū)域（見上圖），那么正常人的會被切成_____個片段，而患者的則被切割成長度為________對堿基和________對堿基的兩種片段。（4）如果某人的P53基因部分區(qū)域經(jīng)限制酶E完全切割后，共出現(xiàn)170、220、290和460堿基對的四種片段，那么該人的基因型是________（以P+表示正常基因，Pn表示異常基因）?！簦?0江蘇卷）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圈l、圈2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（1