免疫組化染色操作步驟

免疫組織化學(xué)染色原理和操作步驟一、免疫組織化學(xué)原理免疫組織化學(xué)（IHC）又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是根據(jù)抗原—抗體特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用帶有可見標(biāo)記的特異性抗體作為探針，檢測組織和細(xì)胞中抗原性物質(zhì)的一種技術(shù)。免疫組化技術(shù)主要有直接法和間接法：直接法是以標(biāo)記的一抗孵育標(biāo)本以檢測其中的抗原成分；間接法則先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗復(fù)合體以達(dá)到檢測該抗原的目的，該法因二抗的放大作用而具有較高的敏感性。間接法常用的有過氧化物酶—抗過氧化物酶（PAP）法、親和素—生物素—過氧化物酶（ABC）法和鏈霉親和素—過氧化物酶（SP）法。PAP法一抗和二抗均不標(biāo)記，避免了標(biāo)記過程對抗體活性的影響，但需要制備過氧化物酶的抗體，與適量過氧化物酶混合形成PAP復(fù)合物（含3個酶分子和2個抗體分子），染色時依次加入一抗、二抗、PAP復(fù)合物孵育標(biāo)本，最后用H2O2和二氨基聯(lián)苯（DAB）為底物顯示過氧化物酶，即可檢測標(biāo)本中的抗原成分。生物素為含硫的雜環(huán)單羧酸，可通過其羧基與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合，從而標(biāo)記抗體和酶。親合素又稱抗生物素蛋白，與生物素有很高的親合力，1分子親合素可結(jié)合4分子生物素，ABC法即在此基礎(chǔ)上建立。ABC法與PAP法相似，一抗不標(biāo)記，二抗用生物素標(biāo)記，染色前按一定比例將親和素與生物素標(biāo)記的過氧化物酶混合，制成ABC復(fù)合物，并使親合素分子上至少空出一個生物素結(jié)合位點(diǎn)。在標(biāo)本孵育過一抗和二抗后，再加入ABC復(fù)合物使其結(jié)合到二抗的生物素上，最后加入DAB進(jìn)行顯色。ABC法的敏感性較PAP法更高。液，充分混勻后調(diào)整pH值至6.0，即得2×母液，貯存?zhèn)溆?。?%鹽酸酒精濃鹽酸與75%酒精按照1:99比例混合，充分混勻。三、免疫組化操作步驟1.組織片脫蠟水化①將組織片依次放入3個裝有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15min。②依次放入2個裝有無水乙醇的玻璃缸，每缸5min。③依次放入2個裝有95%乙醇的玻璃缸，每缸5min。④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2min，取出。⑤放入自來水、蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。2.抗原修復(fù)將切片浸入1×檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，高壓煮沸后繼續(xù)加熱2min，然后停止加熱讓切片自然冷卻。注意：抗原修復(fù)過度或不足，均會影響最終染色結(jié)果。切片驟冷可致脫片，必須自然冷卻！封閉內(nèi)源性過氧化氫酶①放入3%H2O2溶液的玻璃缸中，浸泡15min。②放入蒸餾水的玻璃缸中清洗，重復(fù)3次。③放入PBS緩沖液的玻璃缸中，浸泡5min。4.抗體雜交①甩去PBS余液，將組織片平輔在濕盒中，加正常山羊血清1滴20μl（試劑盒中的A液，根據(jù)組織大小調(diào)整用量），28℃放置20min，甩干。②加稀釋好的一抗1滴（20~50μl，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），置于濕盒4℃過夜。③置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min，更換PBS緩沖液，同法操作4次，甩干。④加入生物素偶聯(lián)的二抗20~50μl（試劑盒中的B液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），放置濕盒，37℃放置20min。⑤置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。5.顯色①加鏈親和素-辣根過氧化物酶20~50μl（試劑盒中的C液，根據(jù)組織塊大小進(jìn)行調(diào)整），濕盒內(nèi)28℃放置5~20min，甩干。②置PBS緩沖液的玻璃缸中，緩慢振蕩清洗5min，更換PBS緩沖液，同法操作3次，甩干。③滴加新鮮配制的DAB工作液100μl（以覆蓋組織為宜），放置觀察反應(yīng)部位呈現(xiàn)黃褐色時（3~5min），置裝有自來水玻璃缸中涮洗3次；6.復(fù)染浸入蘇木精溶液中復(fù)染，放置5min后，用自來水反復(fù)涮洗至水不變色，再用1%鹽酸酒精分化1—2s后，自來水沖洗后，反藍(lán)水洗2min。7.脫水、透明和封片①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；②依次放入2個無水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。③依次放入2個裝有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。④滴加適量中性樹膠，封片，晾干。8.注意事項(xiàng)①整個染色過程中組織塊要保持濕潤，不能干片，否則會導(dǎo)致非特異性染色。②組織切片邊緣易干，因此抗體、封閉液、顯色液等試劑要充分覆蓋組織塊，避免干片。四、結(jié)果判定1.陽性細(xì)胞判斷DAB顯色呈黃色。每批染色都要有特異性陽性和陰性對照為基礎(chǔ)，才能對染色結(jié)果作出判斷?？乖磉_(dá)必須在特定部位，對于臨床診斷來說，不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的著色多系內(nèi)源干擾或人為因素所致，不能視為陽性?？乖磉_(dá)評價免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計(jì)量，我們常用的免疫組化評分方法如下：細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：0（無染色），1（弱染