核轉(zhuǎn)錄因子κB與磷脂酶A2在腦缺血再灌注損傷中的相互作用

核轉(zhuǎn)錄因子κB與磷脂酶A2在腦缺血再灌注損傷中的相互作用

【關(guān)鍵詞】核轉(zhuǎn)錄因子κB磷脂酶A2腦缺血再灌注

腦缺血再灌注損傷是由興奮性中毒、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等多種因素參與的病理過(guò)程。以往對(duì)CIRI機(jī)制的研究主要集中在前三個(gè)方面，但近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)CIRI與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡也有著密切的關(guān)系。研究表明，CIRI的發(fā)生不僅有細(xì)胞壞死，而且有一個(gè)主動(dòng)的、由基因控制的、一系列酶參與的、高度有序的死亡過(guò)程，即細(xì)胞凋亡過(guò)程，50%的缺血性細(xì)胞死亡是因?yàn)榈蛲觥?/p>

核轉(zhuǎn)錄因子κB又稱(chēng)k基因結(jié)合核因子，是一類(lèi)能與多種基因啟動(dòng)子部位的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄DNA結(jié)合蛋白的總稱(chēng)，是一種多效可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)和產(chǎn)生細(xì)胞因子，還能調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡，在缺血再灌注損傷中起重要作用。而作為炎癥介質(zhì)及活性物質(zhì)的磷脂酶A2，則是一種能催化磷脂甘油分子上二位?；乃饷?，亦是花生四烯酸、前列腺素及血小板活化因子等生物活性物質(zhì)生成的限速酶，所產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)在炎癥和組織損傷時(shí)，在膜通道的活化、信息傳遞、血流動(dòng)力學(xué)及病理生理過(guò)程中，以及在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外代謝等方面起了關(guān)鍵性作用，是危重病發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。因此探討核轉(zhuǎn)錄因子NFκB和PLA2在缺血再灌注腦損傷中的作用，以及NFκB與PLA2之間的相互影響機(jī)制，將會(huì)對(duì)研究腦缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制有重要的意義。

1NFκB的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用途徑

NFκB屬于Rel蛋白家族，是由兩種Rel家族亞基RelA、RelB、cRel和NFκcB1、NFκcB2中任意兩種NFκB/Rel蛋白亞單位構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)均具有能與DNA結(jié)合的特性，又稱(chēng)DNA結(jié)合亞單位，其中發(fā)揮主要生理功能的是p50與p65構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。在大多數(shù)細(xì)胞中，NFκB二聚體與IκB結(jié)合成三聚體。IκB覆蓋于NFκB的核定位信號(hào)區(qū)，使之以無(wú)活性形式存在于胞漿中。細(xì)胞受到活化信號(hào)刺激后，由活化信號(hào)誘導(dǎo)激活的IκB激酶引起IκBα蛋白第32和36位絲氨酸的磷酸化，磷酸化的IκBα則由泛素蛋白在多個(gè)位點(diǎn)形成泛素化。最后，泛素化的IκBα被26S蛋白酶水解降解，暴露出Rel蛋白上的NLS，這樣就使NFκB快速易位進(jìn)入核內(nèi)，與DNA特定序列結(jié)合，引起靶基因表達(dá)增加［2］。另外，在細(xì)胞核內(nèi)水平，通過(guò)p65亞單位磷酸化引起NFκB結(jié)構(gòu)改變而調(diào)節(jié)NFκB的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，NFκB還存在著不典型的激活途徑，即IκK獨(dú)立的激活途徑。

2NFκB在CIRI中的作用

NFκB在腦部疾病中的作用已引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，因?yàn)镹FκB是應(yīng)激和炎癥基因表達(dá)最重要的介質(zhì)之一，NFκB活化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。目前普遍認(rèn)為的是NFκB對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用具有兩重性，既可介導(dǎo)BclXS、P53、Cmyc等凋亡蛋白引起細(xì)胞凋亡［3］，又可通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)阻止細(xì)胞凋亡［4］。

促凋亡作用

腦缺血再灌注時(shí)NFκB的激活能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞死亡。剔除P50亞單位鼠與野生鼠相比，梗死面積縮小，予以PDTC通過(guò)抑制IκB降解，阻止NFκB的激活，減少梗死面積的大小，這進(jìn)一步提示腦缺血后NFκB特別是它的P50亞單位似乎在腦缺血中起著有害作用［2］。JamesA等［2］在實(shí)驗(yàn)中將腦內(nèi)4條血管閉塞30min造成短暫全腦缺血，發(fā)現(xiàn)NFκB在再灌注后的72h選擇性地在海馬CA1神經(jīng)元中被激活，與該處神經(jīng)元凋亡時(shí)間近似吻合，由此推測(cè)瀕臨死亡的CAI神經(jīng)元中NFκB的升高或許與細(xì)胞凋亡或壞死機(jī)制有關(guān)。NurmiA等［5］發(fā)現(xiàn)在持續(xù)性局灶性腦缺血中，NFκB能促進(jìn)腦梗塞的形成。Caroll等［2］發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注15～30min后，半球缺血區(qū)NFκB顯著激活，較基礎(chǔ)水平增高3～4倍，同時(shí)應(yīng)用抗氧化劑NAC可完全取消NFκB的早期激活，明顯降低缺血半球梗死區(qū)的大小。Stephenson等［2］用有神經(jīng)保護(hù)作用的抗氧化劑LY341122可以減低NFκB的激活，使再灌注后DNA片段減少，梗死面積縮??；WangYH等［6］發(fā)現(xiàn)黃衫素可通過(guò)其抗氧化作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)NFκB的活化而減輕腦缺血再灌注損傷，間接證明了NFκB有神經(jīng)損害作用。

抑制凋亡作用

很多實(shí)驗(yàn)也證明了NFκB可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡。UrnoweyS等［7］證實(shí)在腦缺血1h，聚合酶鏈反應(yīng)顯示NFκB圈套寡核苷酸有效抑制腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素和細(xì)胞粘附分子mRNA表達(dá)，在缺血7d明顯減少神經(jīng)損傷。HirabayashiT等［8］在研究低溫對(duì)腦缺血損傷的作用機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)其腦保護(hù)作用部分是通過(guò)減少I(mǎi)κK活性,抑制核轉(zhuǎn)錄因子NFκB活化產(chǎn)生的。而運(yùn)用免疫組化和Western印跡也可以檢測(cè)到NFκB在大腦中動(dòng)脈閉塞3h后被活化，閉塞后6～8h在缺血皮質(zhì)區(qū)可檢測(cè)到NFκB核移位和結(jié)合活性下降，提示其活性下降可能加劇缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［2］。

不同研究關(guān)于NFκB對(duì)細(xì)胞凋亡作用得出不同的結(jié)論，雖不能排除細(xì)胞凋亡的作用途徑及機(jī)制，如上游機(jī)制包括NFκB依賴(lài)途徑、P53依賴(lài)途徑及BCL家族中促凋亡成員，而激活從線粒體釋放細(xì)胞色素C的級(jí)聯(lián)反應(yīng)則是下游機(jī)制，最后caspase3形成引起DNA斷裂及細(xì)胞死亡。但也可能因?yàn)镹FκB在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的雙重作用。輕度至中度細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)NFκB的激活或許有保護(hù)作用，但是強(qiáng)烈刺激引起的NFκB激活促進(jìn)細(xì)胞死亡［9］。Kahschmidt等［10］認(rèn)為低濃度的淀粉樣13蛋白成分可激活NFκB產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，而高濃度淀粉樣13蛋白具有神經(jīng)毒性作用，提示NFκB在阿爾茨海默病中可能既參與毒性作用，又參與神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。因此，NFκB對(duì)腦具有保護(hù)作用還是損傷作用，主要取決于NFκB產(chǎn)生部位、刺激物、產(chǎn)生量和持續(xù)時(shí)間等［11］。

3PLA2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用

人類(lèi)幾乎所有的細(xì)胞均含有PLA2,PLA2在人體內(nèi)的分布主要為兩種亞細(xì)胞分布，一種為膜結(jié)合性PLA2，另一種為溶酶體和胞液中可溶性PLA2。MaPLA2存在于各種細(xì)胞的生物膜上，尤以腦細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及肺泡中含量豐富，生理?xiàng)l件下參與細(xì)胞膜磷脂轉(zhuǎn)換、花生四烯酸代謝、化學(xué)趨化作用、有絲分裂作用、細(xì)胞毒性作用及刺激釋放耦連作用［12］。病理狀態(tài)下，溶酶體及線粒體PLA2分泌至間質(zhì)、關(guān)節(jié)腔或血管間隙，參與炎癥及急性損傷的致病過(guò)程［13，14］。而SPLA2能夠分泌進(jìn)組織液、腹腔液、滑膜液及皮下組織，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)及臨床中多種炎癥病理?yè)p傷［1］。

4PLA2的激活及表達(dá)

PLA2的激活及異常表達(dá)與多種細(xì)胞因子的表達(dá)誘導(dǎo)相關(guān)。危重病狀態(tài)下，機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)，刺激單核巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，這些CKs刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞等激活PLA2，導(dǎo)致炎癥“瀑布效應(yīng)”，同時(shí)產(chǎn)生脂類(lèi)介質(zhì)，如前列腺素、白三烯等，造成已受累的細(xì)胞、組織及器官發(fā)生不可逆性損傷。可見(jiàn)，PLA2前連CKs，后接破壞性極強(qiáng)的脂類(lèi)介質(zhì)，其非特異性活化將會(huì)造成災(zāi)害性后果，介導(dǎo)危重病惡化發(fā)展。

5PLA2在CIRI中的作用

腦組織含有大量磷脂成分，而PLA2是水解細(xì)胞膜磷脂的關(guān)鍵酶。在急性組織缺血再灌注損傷時(shí)，可致PLA2激活及釋放，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞磷酯水解后，釋放大量的AA。而AA的級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成的炎癥介質(zhì)，廣泛參與缺血再灌注腦損傷炎性反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)．進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加重腦組織的損傷。程清洲等［15］在腦I/R實(shí)驗(yàn)中觀察到胞漿型PLA2的活性被抑制后，TNFα誘導(dǎo)的凋亡被抑制，提出cPLA2在TNFα誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中起“死亡介質(zhì)”的作用。王東吉等［16］在實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠腦缺血再灌注時(shí)cPLA2蛋白表達(dá)早于TNFα，提示PLA2在缺血再灌注早期便參與了細(xì)胞凋亡的表達(dá)。

在缺血再灌注損傷中PLA2激活及異常表達(dá)，既參與了局部組織損傷，也參與了遠(yuǎn)離組織的臟器損傷［17］，提示PLA2在腦缺血再灌損傷中起重要作用，因而對(duì)PLA2的抑制可能將是抗腦細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

6NFκB與PLA2在腦缺血再灌注損傷中的相互作用機(jī)制

腦缺血再灌注損傷中各種刺激引起的NFκB激活需要Ca2+完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且鈣離子信號(hào)途徑與其它信號(hào)途徑有協(xié)同作用。NFκB激活不是由單一孤立的信號(hào)途徑調(diào)控，而是由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞遭遇缺血再灌注損傷時(shí)，細(xì)胞外Ca2+通過(guò)谷氨酸受體離子通道及胞膜L電壓依賴(lài)性Ca2+通道等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+也進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高，觸發(fā)NFκB被激活。而PLA2尤其是cPLA2作為體內(nèi)重要的Ca2+依賴(lài)性水解酶，在腦缺血再灌注損傷中隨細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度升高而被激活。被激活的PLA2又能使Ca2+內(nèi)流或使細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，形成惡性循環(huán)，使神經(jīng)細(xì)胞游離Ca2+濃度持續(xù)增加，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷［4，18］。

在腦缺血再灌注損傷時(shí)，NFκB與PLA2的激活途徑中都存在Ca2+這一調(diào)控通路，都增大炎癥信號(hào)，加重腦損傷［4，19］。JeSeong等［19］研究也顯示分泌型PLA2、cPLA2參與TNFα、ILβ誘導(dǎo)的NFκB激活，應(yīng)用sPLA2或cPLA2抑制劑可抑制NFκB的激活。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)予以cPLA2抑制劑，抑制了NFκB向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，研究同時(shí)指出PLA2基因中也含有NFκB共有序列，全腦缺血后，可通過(guò)NFκB基因轉(zhuǎn)錄而激活PLA2。應(yīng)用NFκB抑制劑能抑制脂多糖誘導(dǎo)的IIPLA2和cPLA2激活。另一方面，有研究顯示PLA2可激活多種炎性細(xì)胞NFκB的表達(dá)，予以PLA2抑制劑，炎性細(xì)胞NFκB表達(dá)也受到顯著抑制。

總之，NFκB與PLA2的激活均參與了腦缺血再灌腦損傷后的病理生理過(guò)程，是創(chuàng)傷后疾病進(jìn)展的中間環(huán)節(jié)。但NFκB與PLA2之間的相互影響機(jī)制，PLA2的參與決定NFκB起促凋亡還是抗凋亡作用，是在什么條件下起作用以及NFκB與PLA2之間的相互關(guān)系等問(wèn)題仍不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。

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