根結(jié)線蟲侵染不同階段的染色體鑒別方法

根結(jié)線蟲侵染不同階段的染色體鑒別方法

據(jù)估計，植物寄生線蟲每年造成約1570億美元的世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失。病原根結(jié)線蟲是植物寄生線蟲中一大類群,一些屬種在全世界嚴重地危害重要的農(nóng)經(jīng)作物。自1855年Berkeley在英國的感病黃瓜上首次觀察到根結(jié),并發(fā)現(xiàn)根結(jié)線蟲病原后,有關(guān)病原侵染寄主的動態(tài)變化、病原的形態(tài)、檢測與鑒定等,一直是植物病理學(xué)家關(guān)注的重要領(lǐng)域。病原根結(jié)線蟲屬于固著性內(nèi)寄生線蟲,在危害農(nóng)作物的侵染循環(huán)中,以蟲卵、雌蟲和幼蟲形態(tài)出現(xiàn)。初期以2齡幼蟲(Secondstagejuvenile,J2)侵入寄主植物的根系組織,在根內(nèi)常遷移至分化區(qū)的皮層組織內(nèi)定居,并刺激根組織形成巨型細胞,以提供其營養(yǎng)成分,分化的雌蟲進行生長和繁殖,進而產(chǎn)生由卵殼包裹大量卵粒的卵塊。蟲卵孵化成2齡幼蟲后,即可發(fā)生下一個侵染循環(huán)。一般而言,通過解剖鏡即可觀察到上述侵染循環(huán)中出現(xiàn)的病原形態(tài)。為了快速尋找和確定病原、侵染過程中病原動態(tài)變化的病理學(xué)觀察、檢測以及病原的分類鑒定等,方忠達和劉維志等根據(jù)研究結(jié)果及相關(guān)的報道,在他們的專著中分別對病原線蟲染色觀察的許多方法進行了闡述。根據(jù)線蟲的動態(tài)變化,近年來報道的關(guān)于根結(jié)線蟲染色方法中的主要染料包括對侵染初期根系組織內(nèi)J2幼蟲染色觀察的染料是酸性品紅[5~8];侵染根系后期,對巨型細胞內(nèi)部的病理學(xué)染色觀察時使用較多的染料也是酸性品紅或番紅-固綠對染;對根系表面的卵塊染色觀察使用的染料是phloxineB(PB)或cochenilleredA(CA);對死幼蟲與活幼蟲鑒別的染料使用的是熒光素二乙酸酯(FDA);對活幼蟲標記所用的染料有異硫氰酸熒光素(FITC)[14~15]和熒光素二乙酸酯;對雌蟲會陰花紋進行染色觀察使用的染料是甲烯藍。對病原根結(jié)線蟲在不同侵染時期進行染色觀察,有助于對病原進行組織病理學(xué)的研究、檢測、形態(tài)鑒別及抗性評價等。文章對報道的一些染色方法進行了嘗試和比較,探索了以甲基藍和吖啶橙染料的染液分別對J2幼蟲的死蟲與活蟲染色鑒別方法及利用CA染料的染液對卵塊團和雌蟲會陰花紋的染色觀察方法。1材料和方法1.1染料、試劑和儀器煙草(NicotianatabacumLinn)品種為紅花大金元和云煙97,由云南省煙草公司紅河州公司提供。油蘿卜(Raphanussativusvar.oleiferus)品種為A24,油菜(Brassicanapus)品種為Madora,番茄(LycopersiconesculentumMiller)品種為Moneymaker,由德國JKI-InstituteforBreedingResearchonHorticulturalandFruitCrops的H.Budahn博士提供。南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)為種植煙草病圃土中的蟲卵和J2幼蟲,病圃土采自云南省彌勒市太平鎮(zhèn)發(fā)生根結(jié)線蟲病害的煙田。北方根結(jié)線蟲(M.hapla)為德國JKI-InstituteforBreedingResearchonHorticulturalandFruitCrops的H.Budahn博士提供的J2幼蟲。染料:酸性品紅(天津市標準科技有限公司);溴酚藍(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);番紅(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);甲基藍(天津市標準科技有限公司);吖啶橙(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);PhloxineB(Sigma-Aldrich);CochenilleRedA(AppliChem)。試劑:碘(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司,AR);碘化鉀(天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司,AR);次氯酸鈉(有效氯天津市富宇精細化化工有限公司,AR);無水乙醇(四川西隴化工有限公司,AR);異丁醇(西隴化工股份有限公司,AR);甲醛(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司,AR);乳酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司,AR);甘油(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā),AR);三乙醇胺(天津市化學(xué)試劑三廠,AR);蔗糖(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,CR)。根系組織內(nèi)線蟲染液的配制:魯戈氏碘液:4g的碘與6g碘化鉀用水溶解定容到100mL。乳甘合劑:20mL乳酸+40mL甘油+25mL蒸餾水。0.05%(0.1%酸性品紅:0.085g酸性品紅加蒸餾水定容到100mL)。0.1%次氯酸鈉:10mL次氯酸鈉加蒸餾水定容到100mL。50%和70%的酒精:50mL無水乙醇加蒸餾水定容到100mL;70mL無水乙醇加蒸餾水定容到100mL。1%的溴酚藍染液:稱取1g溴酚藍溶解于100mL的50%酒精。取配制的溴酚藍染液20mL,加50%酒精定容到200mL,配制成0.1%的溴酚藍稀染液。70%異丁醇:70mL異丁醇加無水乙醇定容到100mL。0.0002%的番紅溶液:0.002g番紅用1000mL蒸餾水。根系上卵塊團與雌蟲會陰花紋染液:各稱取0.5g的PhloxineB和CochenilleRedA,分別溶解于5000mL的蒸餾水中混勻,配制成100mg/L的PB和CA染色液。死蟲與活蟲鑒別染液的配制:根據(jù)不同的染色方法,參照文獻分別配制1%甲基藍和1%吖啶橙溶液,染色時終濃度為0.5%。TAF固定液:依次取40%甲醛7mL、三羥基乙胺2mL加入棕色試劑瓶中,再加入蒸餾水91mL,混勻。解剖鏡和顯微鏡:OlympusSZX10解剖鏡、OlympusBX51光學(xué)顯微鏡。Opton3RS多功能光學(xué)顯微鏡,ZEISSStemiSV11解剖鏡、ZEISSAxioskop40光學(xué)顯微鏡。1.2自動培養(yǎng)和分離播種育苗:選用162穴/盤的漂盤和煙草育苗專用基質(zhì)(彌勒市煙用物資有限責(zé)任公司生產(chǎn)),取紅花大金元和云煙97品種分別點種培養(yǎng)4盤,按漂浮育苗常規(guī)方法育苗。培養(yǎng)瓶和土壤樣品的準備:取10cm×10cm×13cm的透明、潔凈的塑料瓶,在底部開5個直徑約3~4mm圓孔,便于瓶內(nèi)土壤多余水分的滲漏和通氣。將采自彌勒市太平鎮(zhèn)發(fā)生根結(jié)線蟲病害煙田的土壤敲碎,分裝入塑料瓶中(塑料瓶容積的70%,約1kg/瓶),每品種150瓶,共300瓶。煙苗移栽:取紅花大金元和云煙97兩個品種的健壯煙苗各150株,苗齡為40d,分別將煙苗移栽至裝有病圃土的塑料瓶中,1苗/瓶,澆適量水(約100mL)。煙苗培養(yǎng):將上述移栽至塑料瓶中的煙苗置于培養(yǎng)間中培養(yǎng),光照時間為每天12h;白天室內(nèi)氣溫為25℃(由培養(yǎng)間中安裝的空調(diào)調(diào)節(jié))、土壤溫度約22℃,與光照的開關(guān)時間同步;夜間室內(nèi)氣溫自然(約14~16℃,空調(diào)關(guān)閉)、土壤溫度約17~19℃。根據(jù)煙苗生長狀況,適時澆水。番茄、油蘿卜和油菜苗的播種、育苗、移栽和培養(yǎng)與文獻相同,每種材料30株。在人工氣候培養(yǎng)間中的苗長出3~4片真葉時,接種M.hapla的J2幼蟲,幼蟲懸液為400條/mL,攪動懸液的同時,用5mL的移液器取幼蟲懸液,每盒(株)接種2mL,約800條/株。接種后與上述相同條件在人工氣候培養(yǎng)間中培養(yǎng),60d后取樣檢查。煙苗在培養(yǎng)間中培養(yǎng)至第4d,開始取出煙株的根系,每2d分別取紅花大金元和云煙97品種各15株樣品,共取樣7次。取出煙株的根系后,在水中洗凈根系上所攜帶的土壤,待染色和鏡檢。在云南省彌勒市太平鎮(zhèn)發(fā)生根結(jié)線蟲病害的煙田,煙株生長約4個月時,挖取已明顯表現(xiàn)出受病原根結(jié)線蟲侵入的煙株根系,略帶少量根系土壤,共取20株,分別裝入塑料樣品袋。抖落每株根系上的土壤,收集約1kg根際土壤于樣品袋。采用高滲蔗糖溶液分離法與分樣篩分離法相結(jié)合的分離方法,分離和收集J2幼蟲懸液約100mL,獲得約100000條蟲(含活蟲和死蟲)。利用100μl的移液器,在解剖鏡下用移液器分別吸取僵硬的J2死幼蟲100條和活幼蟲200條,分為死蟲1組、活蟲2組,每組蟲分裝于5支(20條/支)1.5mL的離心管中,待染色鏡檢。上述培養(yǎng)的煙草、番茄、油蘿卜和油菜植株,經(jīng)培養(yǎng)60d后,剪去植株莖基以上的莖葉,從塑料盒中盡可能完整地取出根系,用自來水漂洗去根系所攜帶的土壤。云南省彌勒市太平鎮(zhèn)發(fā)生根結(jié)線蟲病害的煙田,煙株生長約3個月時,挖取已明顯表現(xiàn)出受病原根結(jié)線蟲侵染的煙株根系,剪去植株莖基上部,用自來水漂洗去根系所攜帶的土壤。采集的煙株,洗凈煙株根系后,取根系上具有根結(jié)的部分根系組織,在盆中搗碎根系組織,先用20目分樣篩在水中篩除較大顆粒殘渣,濾液再用100目分樣篩過篩,用自來水沖洗和收集分樣篩中截留物于培養(yǎng)皿中,置于解剖鏡下,挑取和收集雌蟲50條,用于下面的會陰花紋制備和觀察。(1)侵入根系組織內(nèi)初期的J2幼蟲染色與顯微觀察。碘液染色法:根組織內(nèi)的線蟲,參照文獻,將根系放在魯戈氏碘液中染色10~15min;染色后用水洗,待鏡檢。酸性品紅乳甘合劑染色法:參照文獻,將洗凈的植物根系放入預(yù)先加熱到沸騰的、含有0.05%~0.1%酸性品紅的乳甘合劑中,染色3min,取出后使其溫度自然降至室溫,用水沖洗干凈,待鏡檢。溴酚藍染色法:取清洗干凈的根系組織,參照文獻,在0.5%~1%的次氯酸鈉溶液中,浸泡4~8h;水洗后,在50%酒精溶液中浸泡5min;在溴酚藍染液中染色4h,顯出細微結(jié)構(gòu)后,用0.1%稀染液復(fù)染12~16h,依次用50%、70%酒精和70%異丁醇處理20min,用水沖洗干凈,待鏡檢。經(jīng)不同染色液染色和水洗后的根系樣品,在解剖鏡下逐株檢查根系。從根尖開始觀察直至根基部,在發(fā)現(xiàn)有J2幼蟲侵入根系組織的部位,用解剖刀切下根段置于載玻片上,再用OlympusBX51光學(xué)顯微鏡觀察,調(diào)節(jié)清晰度,利用OlympusDP-70成像系統(tǒng)采集圖像(一般為4倍或10倍鏡下采集)。(2)侵染后期在根系上產(chǎn)生的卵殼和卵塊團的染色。接種J2幼蟲后已經(jīng)培養(yǎng)60d的番茄、油蘿卜和油菜、以及在田間移栽后約90d的煙草植株根系,用自來水洗去根系上的土壤,用吸水紙將根系吸干,浸泡于0.1g/L的PB或CA染色液(根據(jù)根系數(shù)量確定染色液用量,以根系完全地浸沒于染色液為宜)中1h,其間,通過提起根系離開染色液的液面2~3次,促使根系染色徹底。染色完畢,取出根系,依次在裝有500mL自來水的3個燒杯中清洗根系,洗去根系上的染色液,一般可憑眼睛觀察到被染成紅色、已經(jīng)撐破根毛表皮的卵塊團,可直接采用照相機采集圖片。同時,用ZEISSStemiSV11解剖鏡進一步觀察在根系組織表面產(chǎn)生的卵殼及其卵塊團,并利用AxioVisionRel.4.6成像系統(tǒng)采集所觀察到的圖像。(3)鑒別J2幼蟲的死蟲與活蟲的染色與顯微觀察。甲基藍染色法:取上述分離和收集的、裝有J2幼蟲20條/支的1.5mL離心管,死幼蟲和活幼蟲各1支。在2支離心管中分別加入濃度1%、與管中線蟲液等體積的甲基藍溶液進行染色(終濃度為0.5%),染色時間為2h。染色結(jié)束后,將離心管中的染液和幼蟲用800目篩子過篩清洗,用自來水收集染過色的線蟲。分別挑取死蟲和活蟲的染色樣品,置于載玻片上水滴中,蓋上蓋玻片,制成水浸片,置于OlympusBX51光學(xué)顯微鏡下觀察,利用OlympusDP-70成像系統(tǒng)采集圖像。吖啶橙染色法:取裝有J2幼蟲1.5mL的離心管,死幼蟲5支、活幼蟲10支;取其中1組裝有活幼蟲的5支離心管,置于沸水中加熱5min,將活幼蟲殺死,取出后待其降至室溫;將裝有20條/支的1.5mL離心管分為死蟲、高溫殺死和活幼蟲3組,5支/組,按染色時間,依次標記為5,10,20,40和60min;每支離心管中加入濃度為1%、與管中線蟲液等體積的吖啶橙溶液進行染色(終濃度為0.5%),根據(jù)設(shè)置的不同時間進行染色處理,然后將有染液的線蟲用800目篩子漂洗過篩,用自來水收集染過色的線蟲,吖啶橙染色的樣品,置于Opton3RS光學(xué)顯微鏡下,利用熒光和可見光分別作為光源,依次進行觀察,并使用顯微鏡的膠卷自動拍攝功能,采集所觀察到的圖像。(4)雌蟲會陰花紋染色觀察。參照文獻(略有改動),挑取上述采集的雌蟲,置于載玻片上水滴中,在體視鏡下,用解剖刀按圖1中數(shù)字順序切3刀中數(shù)字順序切3刀;將切下的雌蟲尾部角質(zhì)膜移至載玻片另一側(cè)的45%乳酸中,用細毛筆輕輕去除卵和其他黏附物;在乳酸浮載劑中,用解剖刀修整后部角質(zhì)膜成小長方塊,整理好的小長方塊包括會陰部分;將洗凈的角質(zhì)膜挑到載玻片上CA染色液滴中,染色30min;取出切片,在水滴中稍作漂洗,然后將其切面向下放在載玻片上純甘油滴中,整理好會陰花紋,蓋上蓋玻片。為便于比較,取10份線蟲樣品,不經(jīng)CA染液染色,置于純甘油滴中,制片。將切片樣品置于OlympusBX51光學(xué)顯微鏡下觀察,先用10×物鏡尋找,進一步在40×物鏡下觀察,并利用O-lympusDP-70成像系統(tǒng)采集所觀察到的圖像。2結(jié)果與分析2.1根系組織內(nèi)的j2幼蟲本研究利用碘、酸性品紅和溴酚藍3種染料的染液分別對根系組織內(nèi)病原根結(jié)線蟲侵染初期的J2幼蟲染色和顯微觀察。實驗結(jié)果顯示,碘液染色法的根組織被染成黑色,較難觀察到根系組織內(nèi)J2幼蟲;酸性品紅乳甘合劑染色之后,根系組織尚透明,但清晰度稍差;利用溴酚藍染液對侵入根系組織內(nèi)的J2幼蟲染色和清洗后,根毛組織呈現(xiàn)無色或淡藍色,較透明,根毛組織內(nèi)的J2幼蟲為藍色或深藍色,比較清晰(圖2),是侵染初期對根系組織內(nèi)J2幼蟲染色的較理想方法。此外,對煙田中移栽30~90d的煙株根系進行染色和觀察,但未觀察到組織內(nèi)的J2幼蟲。推測與取樣和多數(shù)根系老化有關(guān)。2.2染色后根系上的利益利用CochenilleRedA和PhloxineB染料配制的染液對根系和根系表面的卵塊團染色,經(jīng)染色和用自來水清洗后,均可將根系表面上包裹著蟲卵的卵殼染成紅色(圖3A),根系及破裂的根毛表皮組織的淡紅色易被清洗,根系不著色。染色時間1h以上,也不影響效果。在本實驗中利用人工氣候培養(yǎng)箱(每天22℃光照16hr/16℃暗培養(yǎng)8hr),培養(yǎng)50d,染色后根系上極難觀察到紅色的卵殼,但可看到突破根結(jié)表皮的乳白色卵殼,表明卵殼突破根結(jié)表皮的初期,卵殼不易著色。在此條件下培養(yǎng)至60d后,絕大多數(shù)根系表面的卵殼可被染成鮮艷的紅色(圖3C)、暗紅色、淡紅色等,極少數(shù)卵殼不著色,可能與卵殼和卵塊團的成熟度有關(guān)。卵殼中破裂部位的表層卵粒,被映襯成淡紅色(圖3B),但不著色。經(jīng)染色的根系樣品,浸泡于自來水中,CA染料也會逐漸溶于水中致使水逐漸變紅,因而,染色后的樣品要及時觀察。煙田中移栽70d后的煙株根系上,與圖3C所顯示的相似,根系上具有大量的由紅色卵殼包裹著的卵塊團。2.3不同時間的感染有關(guān)死蟲與活蟲的鑒別,據(jù)文獻描述,可用甲基藍、甲烯藍或新藍R等染料和吖啶橙熒光染料染色,然后分別在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察。利用甲基藍對來自病圃土壤中J2幼蟲染色后,制成水浸片在光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示,較活躍的活蟲一般不著色,蟲體內(nèi)少量物質(zhì)被染成藍色(圖4A和4B);有些J2幼蟲的蟲體尚有輕微移動,表明未死亡,其部分蟲體被染成藍色、另一端則不著色(圖4C和4D);選取僵死的蟲體(室溫放置3d以上)染色,結(jié)果死蟲被染成藍色或深藍色(圖4E和4F)。該染色結(jié)果說明,利用甲基藍染液對J2幼蟲染色,可判別已經(jīng)死亡一定時間的蟲體。利用0.5%的吖啶橙溶液(終濃度)對J2幼蟲分別進行自然死亡、高溫殺死和活蟲以及不同時間染色處理結(jié)果顯示,染色時間為10~60min,自然死亡的J2幼蟲在可見光下顯微觀察,蟲體內(nèi)不同程度顯現(xiàn)出赤銅色,并隨染色時間延長,赤銅色加深(圖5A、5C和5E);在熒光顯微鏡下,死亡時間長的蟲體顯現(xiàn)出較強的赤銅色熒光(圖5B和5F)。J2活幼蟲在沸水中煮5min致死后,在10~60min的染色時間,隨染色時間延長,熒光顯微鏡下蟲體顯現(xiàn)出逐漸增強的綠色熒光(圖5D)。J2活幼蟲染色時間5min,不顯現(xiàn)熒光(圖5A與5B);染色10~60min,蟲體顯現(xiàn)出逐漸增強的綠色熒光(圖5C和5D)。上述結(jié)果表明,呈現(xiàn)赤銅色的蟲體,幼蟲已死亡較長時間;呈現(xiàn)綠色熒光的蟲體,幼蟲死亡時間較短或為活蟲。2.4成蟲的染色時間和織物的處理制備的雌蟲尾部切片不經(jīng)染色,在顯微鏡下觀察到的雌蟲會陰花紋如圖6A所示,可以觀察到雌蟲的會陰花紋,但制備與觀察到清晰的樣品,較費時且需嫻熟的顯微操作技能。利用CA染液對制備的雌蟲尾部切片染色,制片觀察。在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖6B~6D所示,雌蟲尾部樣品的切片會不同程度地著色,顏色的變化與染色時間和漂洗有關(guān)。所觀察的會陰花紋較清晰。同時,由于切取的樣品被染成紅色,制作水浸片的操作簡易,在顯微鏡下易于尋找,節(jié)省制作和觀察時間。此外,在煙田中采烤煙葉結(jié)束后約30d(移栽150d以上)采集雌蟲取樣,制作樣品過程中發(fā)現(xiàn)雌蟲尾部易破碎,不易獲得較好的觀察樣品,因而,宜在植株生長旺盛時期采集雌蟲樣品。3陰織物及根結(jié)線蟲的染色研究作者利用CochenilleRedA與PhloxineB分別對根系上產(chǎn)生的卵塊團和雌蟲的會陰花紋染色和觀察,2種染料的染色方法均顯示良好的染色效果。但是,PhloxineB具有毒副作用(誘導(dǎo)人體突變)。因而,后來的實驗中未再使用。CochenilleRedA染料多年前在歐洲一直用于食品染色,后來,報道其對身體有一定的副作用,近年來已未見其在食品中使用,但其副作用比之于PhloxineB,較為安全。此外,研究過程中,著色的卵殼和會陰花紋,浸泡于水中,色素也