吡非尼酮對(duì)大鼠肝微粒體總酶及其同工酶活性的影響

吡非尼酮對(duì)大鼠肝微粒體總酶及其同工酶活性的影響

氨基丙烯酸酯是一種新型的抗肺藥物，其結(jié)構(gòu)為5-甲基甲基二羥吡啶（1羥基）-二氟吡啶（5-meth-1-phenyl-2（1h）-吡啶）。它可以防止或逆轉(zhuǎn)纖維和疤痕形成，抑制類固醇的合成，減少各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制纖維細(xì)胞的形成及其相應(yīng)的細(xì)胞因子的作用。本品系首個(gè)批準(zhǔn)用于治療特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)的藥物,我國(guó)已作為一類新藥批準(zhǔn)生產(chǎn)。筆者擬對(duì)吡非尼酮進(jìn)行臨床前藥動(dòng)學(xué)研究及對(duì)肝細(xì)胞色素P450酶(CYP)的影響,對(duì)該藥臨床應(yīng)用的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量200~240g,雌雄兼有,購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(鄂)2004-0004。1.2不安裝約束緩沖器2.吡非尼酮為上海睿星基因技術(shù)有限公司提供,含量>99%,酮康唑(西安楊森制藥有限公司,批號(hào):010803649);醋酸地塞米松注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):030308),紅霉素、二甲基亞硝胺、6-磷酸葡萄糖二鈉、6磷酸葡萄糖脫氫酶、氧化型輔酶Ⅱ(NADP)均為Sigma公司產(chǎn)品,甲醛、乙酰丙酮、連二亞硫酸鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?BCA試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。1.3酶標(biāo)儀和超低溫冰箱elx低溫高速離心機(jī)(3-18K,Sigma公司);酶標(biāo)儀(Elx800);超低溫冰箱(-86℃)(NCLAIR);721紫外-可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。1.4地塞米松、地康唑、吡非尼酮的藥酶使用SD大鼠共56只,分為7組,每組大鼠8只,雌雄各半。溶媒對(duì)照組[給予1%羧甲基纖維素鈉(sodiumcarboxylmethylcellulose,CMC-Na)10mL·kg-1];地塞米松藥酶誘導(dǎo)組(給予0.5%地塞米松100mg·kg-1);酮康唑藥酶抑制組(給予1%酮康唑40mg·kg-1);乙醇誘導(dǎo)組(給予50%乙醇5mL·kg-1);吡非尼酮低、中、高劑量組(給予吡非尼酮25,50,100mg·kg-1)。分別灌胃給藥6,12d后處死動(dòng)物,取肝臟制備微粒體。1.5l-1氯化鈣溶液制備方法采用鈣沉淀法制備肝臟微粒體。肝臟組織勻漿后于2℃,10000×g離心15min,再取上清液與88mmol·L-1氯化鈣溶液混勻,冰浴5min。2℃,27000×g離心15min,棄上清液,微粒體沉淀以0.25mol·L-1蔗糖溶液重懸,-70℃保存?zhèn)溆谩?.7dasper1.0數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,采用DASver1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差分析和Q值檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠cyp含量比較結(jié)果見表1。CYP總酶方差分析見表2。組間兩兩比較見表3。從表1可見,給藥6d時(shí),與溶媒對(duì)照組比較,地塞米松藥酶誘導(dǎo)組可使大鼠CYP含量增加(P<0.01),酮康唑藥酶抑制組可CYP含量減少(P<0.01)。吡非尼酮低劑量組CYP含量雖有增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),當(dāng)吡非尼酮?jiǎng)┝吭黾又?0mg·kg-1時(shí)則可明顯增加CYP含量,表現(xiàn)為劑量依賴性。2.2大鼠肝微粒體nda酶活性結(jié)果見表4。從表2可見,給藥6d時(shí),中和高劑量吡非尼酮對(duì)大鼠肝微粒體NDMA酶活性無影響(P>0.05),乙醇誘導(dǎo)組NDMA酶活性有誘導(dǎo)作用(P<0.01)。給藥12d時(shí),中和高劑量吡非尼酮對(duì)大鼠肝微粒體NDMA酶活性仍無影響。2.3吡非尼酮對(duì)大鼠肝微粒體erd酶活性的影響結(jié)果見表5。從表3可見,給藥6d時(shí),地塞米松誘導(dǎo)組可使大鼠肝微粒體ERD酶活性增加(P<0.01),吡非尼酮中和高劑量組對(duì)大鼠肝微粒體ERD酶活性均有誘導(dǎo)作用(P<0.01),同時(shí)吡非尼酮高劑量組誘導(dǎo)作用高于吡非尼酮中劑量組。給藥12d時(shí),各用藥組肝微粒體ERD酶活性進(jìn)一步增加,吡非尼酮高劑量組誘導(dǎo)作用仍高于吡非尼酮中劑量組,表現(xiàn)出明顯的劑量和時(shí)間依賴性。3cyp活性的變化肝微粒體CYP的含量測(cè)定一般采用經(jīng)連二亞硫酸鈉還原的肝微粒體懸浮液的一氧化碳(CO)差光譜計(jì)算。但是由于在標(biāo)本收集時(shí),很難用門靜脈灌洗,所以在制備微粒體時(shí)混有較多的血紅蛋白,在測(cè)定CYP的濃度時(shí)血紅蛋白-CO復(fù)合物可干擾還原型P450-CO復(fù)合物的吸收光譜。為此,本實(shí)驗(yàn)用通CO微粒體懸浮液的連二亞硫酸鈉差光譜計(jì)算,可消除血紅蛋白對(duì)測(cè)定的干擾。CYP是藥物代謝酶系統(tǒng)中重要組成部分,參與藥物或毒物的代謝,有200多種化合物可誘導(dǎo)CYP的產(chǎn)生,在肝微粒體中使CYP含量增加,另一些藥物可抑制其活力,使肝微粒體中CYP產(chǎn)生減少。本實(shí)驗(yàn)采用典型的CYP誘導(dǎo)劑地塞米松及抑制劑酮康唑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別出現(xiàn)明顯的CYP增加及減少效應(yīng),說明本實(shí)驗(yàn)的方法是可行的,其結(jié)果有可比性。CYP3型酶與體內(nèi)一些內(nèi)源性和外源性化合物的代謝有關(guān),并可被類固醇、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、抗真菌藥物及苯巴比妥誘導(dǎo)。此亞型酶在體內(nèi)占CYP總量70%,占肝內(nèi)CYP30%。在人體內(nèi),目前已發(fā)現(xiàn)4種CYP3A基因,即CYP3A3,CYP3A4,CYP3A5和CYP3A7,其中CYP3A4是在肝內(nèi)含量較高,是人體內(nèi)鎮(zhèn)痛藥芬太尼氧化代謝的主要酶。紅霉素N-脫甲基酶是一種CYP同工酶,測(cè)定此酶主要反映CYP3A的活性。CYP2E1最早在兔肝微粒體中分離純化出來,其特征為能被乙醇誘導(dǎo),并被命名為P450LM3a,迄今發(fā)現(xiàn)所有CYP2E1的底物在人和動(dòng)物中都是相同的,因此研究動(dòng)物的CYP2E1對(duì)人具有重要參考意義。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定NDMA酶活性來反映CYP2E1的活性。值得一提的是,大量的研究已證明,乙醇是一種典型的CYP2E1誘導(dǎo)劑。許多易揮發(fā)性麻醉劑的體內(nèi)代謝都與CYP2E1有關(guān)(如氟甲氧氟烷、異丙氧氟烷、甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、三氧甲烷等);芳香族類化合物(如苯、對(duì)乙酰氨基酚、二甲基亞硝胺)的代謝也與CYP2E1有關(guān)。KHARASCH等研究發(fā)現(xiàn)此酶可被異煙肼等誘導(dǎo)。慢性乙醇中毒者可增強(qiáng)體內(nèi)苯巴比妥、利福平等的代謝率,加快這些藥物的排泄速度,認(rèn)為此作用可能與CYP2E1被誘導(dǎo)有關(guān);相反,急性乙醇中毒者又可能因乙醇競(jìng)爭(zhēng)與CYP2E1結(jié)合,從而減慢上述同類藥物的代謝速度。由于CYP2E1的活性存在個(gè)體和種族的差異,其底物主要是人們經(jīng)常接觸的前致癌物和前毒物,因此鑒定更多由CYP2E1催化代謝的藥物和化學(xué)物質(zhì)對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥是必不可少的。從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可以看出,吡非尼酮中劑量組、高劑量組和溶媒對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),并且隨著劑量的增加,CYP的含量也在增加;地塞米松和乙醇分別使藥酶的活性大大增強(qiáng)(P<0.01),吡非尼酮中、高劑量對(duì)CYP3A有顯著的誘導(dǎo)性(P<0.05),隨著時(shí)間的增加誘導(dǎo)作用也會(huì)增強(qiáng),而對(duì)CYP2E1則無影響(P>0.05)。1.6amwelln-demethylae,ndames活性和甲基兩種酶活性CYP含量的測(cè)定采用差示分光光度法。二甲基亞硝胺N-脫