蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術研究進展

蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術研究進展

蝴蝶蘭屬植物，屬于蘭科。該屬約有40余個原種,分布于亞洲與大洋州熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國云南南部、西藏南部、廣東南部、海南及臺灣為該屬植物的最北分界線。其多生于陰濕多霧的熱帶森林中離地3～5m的樹干上,也有長于溪澗旁的濕石上,具有極高的觀賞價值和經濟價值。蝴蝶蘭為典型的單莖性熱帶附生蘭,植株很少發(fā)生側枝,分株繁殖系數(shù)極低;其種子內不含胚乳,自然條件下很難萌發(fā),發(fā)芽率極低,故自身的營養(yǎng)繁殖和種子繁殖均難以滿足大量繁殖的需要。種子無菌播種萌發(fā)產生實生苗變異性大,不能良好的保持母本植株的品種特性,也會出現(xiàn)品種退化的現(xiàn)象,導致種苗質量差。應用植物組織培養(yǎng)技術進行蝴蝶蘭快速繁殖可以縮短繁育周期,獲得大量成株,并且可以保持優(yōu)良性狀,維護種質資源,從大量的繁殖后代中得到一定數(shù)量的突變體,隨之對其特殊性狀進行較為深入的分子水平上的研究,獲得更為有價值的成果。目前,蝴蝶蘭快繁途徑主要有:利用各種外植體誘導類原球莖,進而誘導分生苗實現(xiàn)快繁,不經愈傷組織直接誘導叢生芽,近年來,也出現(xiàn)通過誘導愈傷組織途徑進行植株再生的研究以及花葶培養(yǎng)、試管分株等方法。1利用其它器官培養(yǎng)自從1949年Rotor利用無菌培養(yǎng)技術成功地在試管中將蝴蝶蘭花梗上的休眠芽培養(yǎng)出完整植株后,國內外學者紛紛對蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)技術進行相應研究。Intuwong等利用蝴蝶蘭的莖尖進行研究,成功地得到完整植株。隨著科學技術的進一步發(fā)展,國內外以蝴蝶蘭莖尖為外植體的研究逐漸增多。盡管莖尖及其周圍組織較為幼嫩,容易脫分化并再分化成完整植株,但蝴蝶蘭為單莖性植物,摘取其莖尖就有可能損失母株,造成浪費。因此,在實際應用中,蝴蝶蘭的莖尖培養(yǎng)可以用其它器官培養(yǎng)代替。利用花梗及花梗芽作為外植體進行培養(yǎng)就是代替蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的一種研究方法。許多研究結果表明,在誘導花梗苗的過程中,蝴蝶蘭不同發(fā)育階段的花梗芽及側芽均可以進行試管內的營養(yǎng)繁殖,但還是有少量的花梗芽仍保持休眠狀態(tài)。同時,培養(yǎng)溫度及植物生長調節(jié)劑濃度都是影響休眠芽萌發(fā)的關鍵因素,并且外植體褐化嚴重。因此,花梗芽的誘導受到一定的限制,而以花梗為外植體的研究中同樣出現(xiàn)了極為嚴重的褐化現(xiàn)象,并且難以誘導形成類原球莖。然而,以花梗芽為外植體時,無論從不定芽分化繁殖還是誘導形成類原球莖繁殖,都具有繁殖周期短,不傷害母株并保持母體優(yōu)良性狀,形成的新植株健壯易于移栽等優(yōu)點,因此,是較為理想的外植體。在蝴蝶蘭的快繁研究中,還有利用根尖、根段和葉片分別作為外植體進行培養(yǎng)的。以上3種器官為外植體,對母株基本上不會有太大的影響,而且可以保持母株的優(yōu)良性狀,同時也不會受取材時間的限制,可隨時進行研究,是比較好的外植體。目前,已經建立起來的無性系繁殖體系,增殖系數(shù)還不是很理想,并且繁殖周期一般比較長。因此,仍然需要進一步的研究。目前,利用胚培養(yǎng)(即無菌播種)對蝴蝶蘭進行組織培養(yǎng)研究也比較普遍,并取得了一定的成果。但是,由于商業(yè)上所使用的觀賞性蝴蝶蘭多為雜交種,胚培養(yǎng)會產生性狀分離,難以獲得整齊均一的試管苗,有些后代甚至會失去觀賞價值。因此,在繁殖優(yōu)良品種時,應以根、花梗等器官作為外植體;而胚培養(yǎng)技術多應用于雜交育種中,來克服雜交的不親和性,縮短育種時間。2物組織培養(yǎng)方面的應用類原球莖(Protocorm-likebody,PLB)是蘭科植物組織培養(yǎng)中所產生的特有現(xiàn)象,也是蘭花快繁技術中的一個重要形式。Ishii等對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中產生的類原球莖進行組織學研究時觀察發(fā)現(xiàn),該類原球莖的解剖結構與體細胞胚的結構相似,即類原球莖為體細胞胚。2.1植物生長調節(jié)劑在蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究中,類原球莖的誘導是在基礎培養(yǎng)基內添加一定種類及濃度的植物生長調節(jié)劑,由幼葉、根、莖尖等外植體脫分化而產生胚性愈傷組織,進而形成原球莖體。研究中常用的基礎培養(yǎng)基有MS、改良VW、G3、B5、KnudsonC等,植物生長調節(jié)劑有6-BA、NAA、KT、2,4-D等。同時,不同外植體部位對類原球莖的誘導也有一定的影響,見表1。除上述幾種影響因素外,研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH值以及外植體的擺放也是蝴蝶蘭類原球莖誘導的重要影響因素。在蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中,需根據不同的培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基探索合適的pH值,其范圍一般在5.1～5.4之間。同時,外植體在培養(yǎng)中出現(xiàn)了極性現(xiàn)象,因此,在接種時應注意擺放的方向以適應外植體自身的極性特點,利于誘導產生類原球莖,如正放在培養(yǎng)基內的葉片類原球莖的誘導明顯高于反放和斜放在培養(yǎng)基上的葉片,反放和斜放的葉片在培養(yǎng)中幾乎不能誘導出類原球莖。2.2植物生長調節(jié)劑的使用在蝴蝶蘭的快速繁殖研究中,影響類原球莖增殖和分化的因素較為復雜,導致其增殖系數(shù)一直未得到較大的提高。主要因素有增殖培養(yǎng)基的選擇、類原球莖切割體積、培養(yǎng)的環(huán)境條件、外植體的選擇以及試驗中所使用的蝴蝶蘭品種等。研究結果表明,類原球莖增殖的最適培養(yǎng)基會因蝴蝶蘭品種的不同而異。對于蝴蝶蘭類原球莖增殖培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑的配比及添加量,一些研究者認為,PLB增殖需要低濃度的植物生長調節(jié)劑組合,以免在長期培養(yǎng)時出現(xiàn)變異苗。還有研究者在進行PLB增殖培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)PLB可以在原誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖,但適當降低外源細胞分裂素的濃度會使PLB增殖效果更佳,其增殖系數(shù)在2個月內能達到4倍以上,并且當PLB增殖后轉接在新鮮培養(yǎng)基上,就會陸續(xù)發(fā)芽,從而誘導出完整植株。在培養(yǎng)基內添加一定濃度的無機和有機物質,如活性炭和椰子汁等,會在一定程度上促進類原球莖的增殖與分化。這些物質可以有效防止組織褐化,從而促進類原球莖的增殖。在PLB增殖培養(yǎng)中,還應該注意PLB切塊的大小,以及其表現(xiàn)出的一定的群體效應。蝴蝶蘭類原球莖的分化相對容易,在誘導培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基甚至是無植物生長調節(jié)劑的基礎培養(yǎng)基上均可以分化,將產生的芽轉入生根壯苗培養(yǎng)基內,即可形成完整的植株。生根壯苗培養(yǎng)基中使用效果較好的基礎培養(yǎng)基是Kyoto和G3,植物生長調節(jié)劑的配比是6-BA0.1mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。在此條件下,Kyoto培養(yǎng)基有利于生根,G3有利于壯苗。在培養(yǎng)基內加入一定濃度的活性炭有助于根系的形成;加入果蔬汁能明顯的促進試管苗的生長和根系的形成。3不同濃度的溫度對乳狀變化的抑制率及相關因素的影響不經過愈傷組織直接誘導叢生芽或通過誘導花梗芽使之產生叢生芽的方法是蝴蝶蘭的又一種快速經濟有效的快繁方法。叢生芽誘導是關鍵環(huán)節(jié),花梗芽以及植物生長調節(jié)劑濃度都是影響叢生芽產生的主要因素?；üＱ侩x體培養(yǎng)時,腋芽受到溫度、節(jié)位和6-BA濃度的影響。在離體培養(yǎng)條件下,低溫有利于成花基因的啟動,易于獲得花枝;而保持20～28℃的較高溫度,易于獲得營養(yǎng)枝,腋芽節(jié)位以下第3、4節(jié)相對容易誘導,而向上越接近頂芽的腋芽誘導萌發(fā)越困難,且容易褐化死亡。一定濃度的6-BA有助于打破腋芽的休眠,隨其濃度的升高,叢生芽的增長率也隨之上升,但褐化率也顯著增加,因此,篩選適宜的6-BA濃度對蝴蝶蘭叢生芽的誘導有很大的影響。誘導叢生芽進行蝴蝶蘭的快速繁殖具有技術難度低、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點。筆者通過一年半的比較發(fā)現(xiàn),以蝴蝶蘭的葉片、根和花梗節(jié)間切片作為外植體快速繁殖蝴蝶蘭,誘導時間長,外植體容易褐化死亡,效果不好。而利用花梗芽誘導叢生芽快繁蝴蝶蘭,繁殖周期短,效果最好,但產生的叢生芽都是無根小苗,需要進一步生根壯苗才能移栽。4基因型附生蘭種子萌發(fā)和接種蘭花種子萌發(fā)有共生萌發(fā)和非共生萌發(fā)(無菌播種)兩種。共生萌發(fā)是把真菌和蘭花種子共同接種在培養(yǎng)基上,由真菌侵染種子,種子在真菌作用下萌發(fā)成苗的方法,該方法對于地生蘭是非常有效的。無菌播種(即胚培養(yǎng))是將蘭花種子接種到適宜培養(yǎng)基上,結合一定的培養(yǎng)條件誘導萌發(fā)的方法,該方法適于大多數(shù)熱帶附生蘭的種子萌發(fā)。蝴蝶蘭具有種子小、數(shù)量多、容易獲得等優(yōu)點,比較適合無菌播種,可得到大量的實生苗,但所獲得的植株可能與母株基因型不同,一般不宜進行再繁殖。蝴蝶蘭進行種子無菌播種時,最重要的影響因素是培養(yǎng)基。種子的采摘在授粉后110d到種子成熟期間,一般在授粉后120d時較為適宜。這一時期,蝴蝶蘭種子已經基本達到了生理上的成熟,且有外部果皮包被,因此可以直接進行果實消毒。蝴蝶蘭種子在MS、1/4MS、Vacin&Went和KnudsonC幾種基礎培養(yǎng)基中,均發(fā)芽良好。且在基礎培養(yǎng)基中添加活性炭、香蕉泥和Tryptone有利于發(fā)育和生長。許多研究還發(fā)現(xiàn),低氮濃度較有利于種子發(fā)芽和類原球莖發(fā)育。5繼續(xù)發(fā)展中的類原球莖增殖體系蝴蝶蘭組織培養(yǎng)是20世紀60年代末才發(fā)展起來的技術,在40多年的時間里得到了長足的發(fā)展,世界各國紛紛進行研究與生產,目前已經形成一定的規(guī)模,建立了較為完善的技術體系。同時,對于蝴蝶蘭繁殖系數(shù)的提高也取得了很大的進步,但對于某些外植體的增殖系數(shù)仍然不是特別理想,需要進一步研究和完善。眾多研究結果表明,蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)中仍然存在一些問題,如蝴蝶蘭類原球莖誘導培養(yǎng)中所加入的添加物及其濃度對類原球莖的影響,雖然蝴蝶蘭的繁殖系數(shù)有很大的提高,但組織培養(yǎng)中類原球莖增殖的穩(wěn)定性不強,試驗結果重復性不十分理想等。因此,對蝴蝶蘭快速繁殖技術中一些影響因素應該進行更加細致的研究,建立更加完善和科學的體系,用以更好地、快速地、大量地繁殖蝴蝶蘭的稀有優(yōu)良品種,進而保護和維持蝴蝶蘭的原生種及豐富的品種資源。與此同時,在快速繁殖蝴蝶蘭的過程中,還應注意蝴蝶蘭母本植株的病毒鑒定,防止病毒通過分生苗的大量繁殖迅速傳播擴散。目前,蝴蝶蘭的數(shù)量急劇上升,但規(guī)模