snp對(duì)豬腔前卵體外培養(yǎng)的影響

snp對(duì)豬腔前卵體外培養(yǎng)的影響

腔前胚胎是胚胎發(fā)育的早期階段。大量的腔前卵泡在發(fā)育到有腔卵泡前發(fā)生閉鎖、退化,沒有得到充分利用,這無疑是動(dòng)物遺傳與繁育資源的極大損失。哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外培養(yǎng)的研究有助于揭示卵泡發(fā)育的過程及其機(jī)制,可以最大限度利用卵巢資源,促進(jìn)動(dòng)物繁殖,保護(hù)瀕臨滅絕物種以及人類生殖健康。一氧化氮(NO)是目前在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最小、最輕、最簡(jiǎn)單的生物信息分子。大量研究發(fā)現(xiàn),NO在心血管、神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、免疫等系統(tǒng)中都具有重要作用,也參與了卵泡的發(fā)育、排卵、黃體功能、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟、胚胎著床、妊娠維持、調(diào)節(jié)分娩以及精子的發(fā)生、受精等。硝普鈉(sodiumnitroprusside,SNP)作為常用的NO供體之一,已被許多學(xué)者用于NO的研究。有關(guān)SNP在豬腔前卵泡生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究還不夠成熟。筆者研究不同濃度SNP對(duì)體外培養(yǎng)豬腔前卵泡生長(zhǎng)發(fā)育的影響,旨在建立一套適合豬腔前卵泡體外生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)體系。1材料和方法1.1材料表面豬卵巢從合肥市四河屠宰場(chǎng)采集,用保溫瓶(裝有37℃添加抗生素的滅菌生理鹽水)3h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。1.2皮質(zhì)組織的分離挑選表面無黃體且無大卵泡的中等卵巢,用生理鹽水沖洗后,去除卵巢周圍的組織,用生理鹽水沖洗1次,75%酒精浸潤(rùn)2次,每次10～15s,再用生理鹽水沖洗,然后轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境。分離時(shí),用眼科剪將皮質(zhì)部分剪成1～3mm的碎片,用DPBS清洗皮質(zhì)碎片,再將碎片置于一次性塑料培養(yǎng)皿的卵泡分離液中,用裝有針頭的1mL注射器在顯微鏡下分離卵泡。分離的卵泡收集于卵泡收集液中,用培養(yǎng)液洗4次后,挑選直徑230～270μm的健康卵泡(卵泡卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞完全被基底膜、膜細(xì)胞和基質(zhì)組織包圍)進(jìn)行培養(yǎng)。1.3轉(zhuǎn)鐵蛋白和礦物油的覆蓋基礎(chǔ)培養(yǎng)液為NCSU23,添加7.5%的FBS,2.5μg/mL的FSH,3.5μg/mL的胰島素,10μg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白和100μg/mL的抗壞血酸,培養(yǎng)液用前在38.5℃5%CO2培養(yǎng)箱中至少平衡4h。采用96孔培養(yǎng)板,每孔200μL培養(yǎng)液,每孔表面覆蓋50μL礦物油。將挑選好的腔前卵泡隨機(jī)分到不同的試驗(yàn)組(SNP濃度分別為0.001、0.010、0.100、1.000mmol/L)中,每孔1個(gè)卵泡,共培養(yǎng)4d,每48h半量換液1次。1.4顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的觀察1)卵泡直徑。測(cè)量培養(yǎng)前(第0天)卵泡直徑,以后每隔1天(即第2天、第4天)測(cè)量1次直徑。由于腔前卵泡的形態(tài)并非總是呈標(biāo)準(zhǔn)的圓形,所以,以基底膜外緣為準(zhǔn),選擇測(cè)量最長(zhǎng)距離(長(zhǎng)徑)和最短距離(短徑),取平均值。2)卵泡存活率。培養(yǎng)的第2天、第4天觀察卵泡存活情況,凡卵泡生長(zhǎng)停滯,卵母細(xì)胞不再被顆粒細(xì)胞層包圍或顆粒細(xì)胞變黑、具有致密體以及嚴(yán)重皺縮,卵母細(xì)胞從卵泡中逸出以及形態(tài)嚴(yán)重變形的均視為卵泡死亡;卵泡具有圓形的卵母細(xì)胞,以及卵泡細(xì)胞沒有明顯退化的視為存活卵泡。卵泡存活率表示為存活卵泡占入培卵泡的百分比。3)卵泡成腔率。培養(yǎng)第2天、第4天觀察卵泡成腔情況,以顆粒細(xì)胞層內(nèi)出現(xiàn)明顯的空隙視為卵泡成腔。成腔率表示為成腔的卵泡數(shù)占存活卵泡的百分比。4)卵母細(xì)胞正常率和COC回收率。培養(yǎng)結(jié)束后,刺破卵泡,如卵泡刺破后未見卵母細(xì)胞,則認(rèn)為卵母細(xì)胞已退化降解。COC表示卵泡刺破后,卵母細(xì)胞透明帶表面50%以上區(qū)域被顆粒細(xì)胞包圍的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體;卵母細(xì)胞輪廓不規(guī)則以及胞質(zhì)固縮化均視為卵母細(xì)胞不正常。卵母細(xì)胞正常率表示為獲取的正常的卵母細(xì)胞數(shù)占入培卵泡的百分比;COC回收率表示為每組獲得的COC數(shù)占該組入培卵泡數(shù)的百分比。5)顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)。取出培養(yǎng)第4天的卵泡,刺破收集顆粒細(xì)胞,用Hoechst33258進(jìn)行熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞的凋亡情況。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)出碎塊狀致密濃染。1.5數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS3.0軟件進(jìn)行方差分析,用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)分析。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)饅頭直徑的影響由表1可知,開始培養(yǎng)前,卵泡直徑各處理組間差異不顯著;在培養(yǎng)4d的過程中,卵泡持續(xù)生長(zhǎng),卵泡直徑隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增大。在培養(yǎng)第2天、第4天的卵泡平均直徑各組間差異不顯著,說明各處理組對(duì)卵泡體外培養(yǎng)直徑增長(zhǎng)的影響不大。2.2sdp的比較由表1可知,培養(yǎng)的第4天,卵泡存活率0.001mmol/LSNP處理組顯著高于1.000mmol/L處理組,與其他各處理組間差異不顯著。此外,與對(duì)照組相比,0.001mmol/LSNP組要高于對(duì)照組,但差異不顯著,1.000mmol/LSNP組要低于對(duì)照組,差異不顯著。成腔率在第4天開始表現(xiàn)顯著差異,但以0.001mmol/LSNP處理組成腔率最高,約達(dá)到80%。以上結(jié)果說明,卵泡培養(yǎng)液中添加一定濃度(如0.001mmol/L)的SNP有利于促進(jìn)卵泡成腔,而此后隨著SNP濃度的提高,則具有抑制成腔的作用。2.3不同濃度ssnp處理對(duì)卵母細(xì)胞正常率的影響由表1可知,從卵母細(xì)胞正常率看,0.001mmol/LSNP處理組顯著高于1.000mmol/LSNP處理組外,其余各組差異不顯著,但0.001mmol/LSNP處理組卵母細(xì)胞正常率最高。從COC回收率方面看,0.001mmol/LSNP處理組COC回收率顯著高于其余各組,其余各處理組差異不顯著。2.4兩組凋亡率比較在熒光顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞核形態(tài)呈濃染、碎裂、固縮。表1結(jié)果表明,1.000mmol/LSNP處理組凋亡率顯著高于其他各組,而0.001mmol/LSNP處理組凋亡率顯著低于其他各組,其余各組間差異不顯著。3snp對(duì)角色機(jī)理的影響a.SNP對(duì)腔前卵泡生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明,各處理組對(duì)卵泡體外培養(yǎng)直徑增長(zhǎng)的影響差異不顯著。腔前卵泡發(fā)育受多種因子調(diào)控,如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和局部產(chǎn)生的物質(zhì),其中NO是作為生長(zhǎng)促進(jìn)因子而起作用的。研究表明,卵巢NO/NOS系統(tǒng)在調(diào)控卵泡生長(zhǎng)方面起重要作用。eNOS和NOS在豬卵巢中有特異性表達(dá),在不同階段的卵泡有不同的表達(dá)模式。Rosselli等通過測(cè)定卵泡培養(yǎng)過程中NO水平的變化,發(fā)現(xiàn)在卵泡的不同生長(zhǎng)階段,NO的水平也是變化的,從而揭示了NO在卵泡發(fā)育過程中可能具有一定的作用。NO供體濃度的高低對(duì)體外培養(yǎng)卵泡生長(zhǎng)有一定的影響。本試驗(yàn)結(jié)果與NO具有減緩體外培養(yǎng)小鼠卵泡生長(zhǎng)的結(jié)果不一致,這可能是物種之間的差異致的,或是腔前卵泡處于卵泡發(fā)育的早期,對(duì)SNP的敏感性反應(yīng)比較滯后所導(dǎo)致的。b.SNP對(duì)腔前卵泡存活的影響。本研究結(jié)果表明,0.001mmol/LSNP有利于卵泡存活,而1.000mmol/LSNP對(duì)卵泡具有毒性作用,不利于卵泡存活。局部低濃度的NO有助于卵泡生長(zhǎng),并可能抑制細(xì)胞凋亡;高濃度的NO則有可能以過氧化亞硝酸鹽的形式促進(jìn)細(xì)胞凋亡,不利于卵泡的存活。Matsumi等認(rèn)為,NO是大鼠卵泡中的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子,能抑制卵泡的閉瑣和卵泡細(xì)胞的凋亡。NO還能誘導(dǎo)包括人類的許多物種卵泡細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)卵泡的閉瑣。c.SNP對(duì)腔前卵泡成腔的影響。卵泡培養(yǎng)液中添加0.001mmol/LSNP有利于卵泡成腔,但高濃度SNP對(duì)卵泡成腔具有抑制作用。卵泡腔的形成是卵泡生長(zhǎng)加速、有絲分裂活動(dòng)增加及卵泡液積累作用的結(jié)果。大部分卵泡液是由有腔卵泡在排卵前不久產(chǎn)生的,主要是血漿滲出液和顆粒細(xì)胞分泌液。由腔前卵泡階段轉(zhuǎn)化為有腔階段是卵泡發(fā)育過程中的重要一步,需要卵泡內(nèi)復(fù)雜信號(hào)的精確調(diào)控。只有發(fā)育到有腔卵泡后,許多的GC尤其是與卵母細(xì)胞聯(lián)系密切的GC才能分化成卵丘細(xì)胞,而卵丘細(xì)胞可接受排卵前的LH峰刺激而導(dǎo)致卵泡發(fā)生排卵。采用多卵泡培養(yǎng)體系,腔前卵泡能發(fā)育成熟并排卵。NO不是豬腔前卵泡成腔過程中的關(guān)鍵因子,但高濃度外源性的NO能抑制卵泡成腔。d.SNP對(duì)腔前卵泡卵母細(xì)胞正常率以及COC回收率的影響。培養(yǎng)腔前卵泡的目的是獲取正常的卵母細(xì)胞和COC。本試驗(yàn)中除1.000mmol/LSNP外,其他各組卵母細(xì)胞正常率差異不顯著,這可能是由于腔前卵泡對(duì)SNP的敏感性較低,也可能是由于卵泡是一個(gè)完整的結(jié)構(gòu),直接受到SNP的毒性刺激要少。一定濃度的NO能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟,iNOS來源的NO調(diào)節(jié)鼠生發(fā)泡的破裂和第一極體的排出,誘導(dǎo)型和內(nèi)皮型NOS來源的NO對(duì)豬卵母細(xì)胞的成熟起促進(jìn)作用。此外,NO供體SNP還具有降低外源PGF2α對(duì)小卵泡和中等卵泡卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的抑制作用。0.001mmol/LSNP組COC回收率顯著高于其他各處理組,說明培養(yǎng)液中低濃度SNP的存在有利于卵泡GC和卵母細(xì)胞之間正常的信息交流。e.SNP對(duì)腔前卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響。0.001mmol/LSNP能抑制豬顆粒細(xì)胞的凋亡,而1.000mmol/LSNP促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。除1.000mmol/LSNP外,其他各組卵母細(xì)胞正常率差異不顯著。在卵泡發(fā)育過程中,顆粒細(xì)胞的增殖、分化起著重要的作用,顆粒細(xì)胞大量凋亡將會(huì)影響卵泡的正常發(fā)育成熟過程。NO對(duì)體外培養(yǎng)的卵泡顆粒細(xì)胞的