植物精油對煙草黑脛病的抗治作用

植物精油對煙草黑脛病的抗治作用

草場上的黑脛骨疾病是由雜草桿菌（dat.）引起的。這是世界上最嚴重的卷煙植物栽培疾病之一，也是中國煙草種植區(qū)的主要疾病。據不完全統(tǒng)計,平均每年因該病給煙草種植造成的損失達1億元以上。目前煙草黑脛病防治藥劑主要是甲霜靈,但由于其作用位點單一、藥劑選擇壓力及天然抗性群體的存在,使煙草疫霉抗藥性逐年增強,對煙草黑脛病的大范圍發(fā)生難以起到控制作用。因此,新型煙草黑脛病防治藥劑的開發(fā)與應用勢在必行。植物源農藥作為生物農藥的一類,其開發(fā)利用對有害生物防治的前景十分廣闊。植物源農藥與化學農藥相比具有低毒、無殘留、選擇性高及不易使害蟲、病菌產生耐藥性的特點,是一種與環(huán)境有良好相容性的新型環(huán)保農藥。精油源于植物的果實、葉片、莖稈、種子、花和根等,是植物次生代謝的香氣成分和揮發(fā)性產物,是一種重要的植物源農藥。目前已有文獻報道植物精油對疫霉屬病害抑制作用的研究。對煙草疫霉的防治,僅Bowers等通過丁香油和胡椒芥子油混合液、肉桂提取物以及合成肉桂油對土壤中煙草疫霉菌絲、孢子囊及厚垣孢子的抑制作用進行了相關報道,但未在煙草體內進行相關評價。檸檬草、羅勒、椒樣薄荷、茶樹和桉葉在中國普遍種植,材料來源廣泛,精油的化學成分和抗細菌、抗真菌活性已有大量報道,但其體外和體內的抗煙草疫霉活性尚未見評價。本研究通過體外菌絲生長抑制試驗篩選抑制煙草疫霉菌絲生長的有效精油及濃度,并結合溫室體內預防和治療試驗確定煙苗病情指數,計算相對防效,以期為新型農藥的開發(fā)與應用奠定理論基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗中的蘑菇煙草黑脛病菌株由云南省農業(yè)科學研究院環(huán)境資源研究所植物病理室提供。采用燕麥培養(yǎng)基(OA),培養(yǎng)溫度26℃。1.1.2給草藥的連接主栽品種K326為黑脛病接種材料。采用漂浮盤育苗,于玻璃溫室內進行。期間剪葉2次,待苗齡60～70d時進行接種試驗。1.1.3提取的提取材料檸檬草、羅勒、椒樣薄荷、茶樹和桉葉鮮葉均采自上海交通大學農業(yè)與生物學院植物園,采摘后平鋪于攤晾室,待陰干后作為精油提取材料。1.1.4給藥處方的比較以市售藥劑烯酰氟嗎·甲霜靈錳鋅58%可濕性粉劑2000倍(推薦濃度190μg/mL,JSL2000)藥液為陽性對照。1.2方法1.2.1精油的提取分別準確稱取5種植物材料500g,注入蒸餾水3L,采用水蒸氣蒸餾法提取精油,3h后收集精油并用無水Na2SO4干燥,置于棕色瓶內4℃低溫保存。1.2.2油乳液以吐溫-80為乳化劑,無菌雙蒸水為溶劑配制成濃度為48mg/mL的精油藥劑母液,吐溫-80終含量為0.5%。1.2.3真菌生長率試驗(1)精油的穩(wěn)定性測定取培養(yǎng)3周的煙草疫霉平板,用打孔器沿其外圍取5mm菌絲塊,將其均勻擺放于精油濃度為240μg/mL的OA培養(yǎng)基內,每平板接種3個菌絲塊,設置3個重復,以0.5%吐溫-80為對照。培養(yǎng)3d后采用十字交叉法測定菌落直徑,計算菌落生長抑制率,計算公式如下:(2)培養(yǎng)基平板選取檸檬草、羅勒和椒樣薄荷精油,分別配制含精油濃度為400、320、240、160、80、40、20、10μg/mLOA培養(yǎng)基平板。具體接種及計算方法參照(1)。1.2.4溫室預防和治療(1)棉田淺排液對棉花保濕的作用參考Keller等方法并稍加改進,具體步驟如下。預防試驗:取苗齡60～70d煙苗,使用刀片輕輕劃傷莖基部表皮,立即進行基部藥劑噴施處理,覆棉花保濕,24h后將直徑0.5cm菌絲塊置于基部劃傷處。治療試驗:取苗齡一致的煙苗并使用刀片輕輕劃傷莖基部表皮,將直徑為0.5cm的菌絲塊置于基部劃傷處,并覆棉花進行保濕,24h后去除棉花并對基部噴藥處理,并再次覆蓋棉花保濕。精油藥液濃度分別為160、320、480和640μg/mL,以JSL2000為藥劑陽性對照,0.5%吐溫-80水溶液為空白對照。每處理6株煙苗,設置3個重復,于7d后記錄病情。(2)病情調查及評價標準以株為單位進行調查,病害嚴重程度依據莖基部病斑擴展程度分級。病害分級標準、調查方法及病情指數、相對誘導效果計算按照中華人民共和國國家標準(GB/T23222-2008)的規(guī)定進行。病情指數和相對誘導效果計算公式如下:1.2.5數據分析主要由Excel、SPSS統(tǒng)計軟件完成。2結果2.1真菌生長率試驗2.1.1植物精油的抑制作用將直徑5mm菌落置于精油濃度為240μg/mL的OA培養(yǎng)基平板上,采用菌絲生長速率法,3d后進行統(tǒng)計。結果圖1所示:5種植物精油對煙草疫霉均有一定程度的抑制作用。其中,檸檬草和椒樣薄荷效果明顯,菌落生長百分抑制率分別為90.06%和89.86%,兩者之間無顯著性差異,但與另外3種精油有極顯著差異;羅勒精油次之,抑制率為84.42%,與其他4種植物精油有極顯著差異;茶樹和桉葉油效果最差,菌絲生長抑制率分別為32.1%和27.3%。由此可見,檸檬草、椒樣薄荷和羅勒精油在240μg/mL濃度下抑菌效果較好,均在80%以上。2.1.2種含精油藥劑平板對煙草疫霉生長的影響為進一步確定檸檬草、羅勒和椒樣薄荷精油最低抑菌濃度,將其分別配制成濃度為400、320、240、160、80、40、20和10μg/mL的OA培養(yǎng)基平板上,3d后進行統(tǒng)計。結果如圖2所示:3種含精油藥液平板隨其濃度的降低,對煙草疫霉的菌絲生長抑制率均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。檸檬草、椒樣薄荷和羅勒精油分別在320、400、400μg/mL時可以完成抑制菌絲生長。由此可見,檸檬草精油抗煙草疫霉效果最好,最低抑菌濃度為320μg/mL。2.3溫室內草流行草的繁殖2.2.1檸不同草精油的病情指數表1預先對煙苗莖基部刀片劃傷處噴施精油藥劑處理,24h后進行菌絲接種,7d后統(tǒng)計結果。結果如表1所示:病情指數隨檸檬草精油濃度的升高而呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,相對誘導效果呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。檸檬草精油640μg/mL時病情指數為16.67,與160、320μg/mL存在顯著性差異,與480μg/mL和JSL2000(190μg/mL)無顯著性差異;檸檬草精油640μg/mL時相對誘導效果為81.93%,與160、320μg/mL存在顯著性差異,但與480μg/mL和JSL2000無顯著性差異。2.2.2檸不同品種草的病情指數分布預先對煙苗莖基部傷口處進行菌絲接種,24h后進行藥劑噴施處理,7d后進行結果統(tǒng)計。結果如表1所示:病情指數隨精油濃度升高呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,相對誘導效果呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。檸檬草精油640μg/mL病情指數最低,為56.79,與檸檬草480μg/mL和JSL2000無顯著性差異,與檸檬草160、320μg/mL存在顯著性差異,與160μg/mL存在極顯著差異;檸檬草640μg/mL相對誘導效果最高,為38.44%,與檸檬草480μg/mL、JSL2000無顯著性差異,與檸檬草160、320μg/mL存在極顯著性差異。3檸檸檬草精油的抑菌活性研究檸檬草、椒樣薄荷、羅勒、茶樹和桉葉精油抑制植物致病真菌活性已有大量研究,它們對不同致病菌的抑制活性具有較大差異。本研究發(fā)現(xiàn),檸檬草精油對煙草疫霉菌絲生長具有顯著的抑制活性。有研究證實植物精油的抑菌活性主要取決于它的主要成分。本研究中檸檬草精油主成分的定性定量分析及其抑菌活性有待進一步研究。精油體外抗植物致病菌試驗已有很多報道,但很少研究應用于活體植株中。本研究通過溫室預防和治療試驗發(fā)現(xiàn)檸檬草精油對煙草疫霉有一定的控制作用。這或許歸因于的檸檬草精油對煙草疫霉菌絲生長的直接抑制作用,另外植物精油對真菌的孢子囊、厚垣孢子和孢子發(fā)芽抑制活性也有大量報道。另外本研究發(fā)現(xiàn)檸檬草精油對煙草黑脛病的預防效果明顯優(yōu)于治療效果,主要是由于噴施精油藥劑后其吸附于傷口、莖稈表面及土壤中,從而直接阻止致病菌的感染;另外植物精油藥劑噴施煙草葉片后可提高煙草抗性,間接抑制病原菌的侵染。4