微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

微生物程度檢查原則操作規(guī)程1目的與合用范疇本規(guī)程規(guī)定了微生物程度檢查辦法和操作規(guī)定。本規(guī)程合用公司所需進(jìn)行微生物程度的檢查。2職責(zé)質(zhì)量確保部負(fù)責(zé)本規(guī)程的實(shí)施。3內(nèi)容3.1引用原則：《中國(guó)藥典》二部。3.2藥品微生物程度檢查法總則3.2.1抽樣3.2.1.1供試品普通按批號(hào)隨機(jī)抽樣。3.2.1.2普通抽樣量為檢查用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量。3.2.1.3抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?？梢傻臉悠?，應(yīng)選有疑問(wèn)的樣品，但因機(jī)械損傷明顯破裂的包裝不得作為樣品，凡已能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周邊）外觀看出長(zhǎng)螨、長(zhǎng)霉、蟲(chóng)蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格，無(wú)需要再抽樣檢查。3.2.2供試品保存供試品在檢查之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，以防供試品中的污染菌因保藏條件所引發(fā)致死、損傷或繁殖。3.2.2.2供試品在檢查之前，應(yīng)當(dāng)保持原有包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁啟動(dòng)，包裝已啟動(dòng)的樣品不得作為供試品。3.2.3檢查3.2.3.1供試品檢查項(xiàng)目按《中國(guó)藥典》二部微生物程度標(biāo)精擬定。3.2.3.2檢查的全過(guò)程，均應(yīng)嚴(yán)格恪守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。3.2.3.3除另有規(guī)定外，供試品制備成供試液后，應(yīng)在均勻狀態(tài)取樣。3.2.3.4制成供試液后，應(yīng)當(dāng)在60分鐘內(nèi)注皿操作完畢。3.2.4培養(yǎng)3.2.4.1除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。3.2.5復(fù)檢3.2.5.1菌數(shù)測(cè)定不合格者應(yīng)復(fù)檢，控制菌檢查以一次檢出為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試，但應(yīng)保存檢出菌株一種月備查。3.2.5.2復(fù)試項(xiàng)目以不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，作單項(xiàng)復(fù)試。3.2.5.3復(fù)試需另取同批號(hào)樣品，復(fù)試2次。3.2.5.4復(fù)試報(bào)告，以3次測(cè)定成果的平均值報(bào)告。3.2.6檢查報(bào)告3.2.6.1檢查報(bào)告以1g、1ml或10cm2為單位。3.2.6.2測(cè)定菌數(shù)報(bào)告，依3.10.2.4菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告。3.2.6.3控制菌按檢查成果報(bào)告，如未檢出控制菌時(shí)，報(bào)告為“按規(guī)定抽樣檢查成果未檢出××菌”，如抽樣中任意同樣品檢出控制菌時(shí)，報(bào)告為“按規(guī)定抽樣，檢出××菌，不符合藥品微生物程度原則”。3.3培養(yǎng)基及其制備辦法3.3.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基34g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）。取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基30g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.3膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）取膽鹽乳糖培養(yǎng)基36g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.4麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基54g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.5磷酸鹽葡萄胨水培養(yǎng)基15.8g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.6蛋白胨水培養(yǎng)基取蛋白胨水培養(yǎng)基15g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.7枸櫞酸鹽培養(yǎng)基取枸櫞酸鹽培養(yǎng)基22g，加1000ml水，加熱溶解，分裝，116℃高壓滅菌20分鐘。3.3.84-甲基傘形酮葡萄苷酸培養(yǎng)基（MUG）取4-甲基傘形酮葡萄苷酸培養(yǎng)基35g，加1000ml水，分裝，115℃高壓滅菌20分鐘。注：培養(yǎng)基（生物試劑）中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。3.4試液3.4.10.1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液。3.4.1.1配制：取2，3，5-氯化三苯基四氮唑0.1g溶于100ml水，滅菌，備用。3.4.1.2用途：供制備培養(yǎng)基用。3.4.2無(wú)菌對(duì)氨基苯甲酸試液3.4.2.1配制：取對(duì)氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞試管中，121℃滅菌20分鐘。3.4.2.2用途：供磺胺類藥品檢查用。3.4.3氫氧化鉀試液3.4.3.1配制：取氫氧化鉀40g，加水溶解使成100ml。3.4.3.2用途：供作V-P反映試劑。3.4.4-萘酚乙醇溶液3.4.4.1用途：供作V-P反映試劑。3.4.5靛基質(zhì)試液3.4.5.1取對(duì)二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或正丁醇)75ml，充足振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml漸漸滴入，邊加邊振搖，以免驟熱造成溶液色澤變深，或取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml漸漸滴入。3.5稀釋劑3.5.10.9%無(wú)菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃滅菌20分鐘。3.5.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PH7.2）取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121℃滅菌20分鐘。3.6批示液3.6.1甲基紅批示液取甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。3.6.2溴麝香草酚藍(lán)批示液取溴麝香草酚藍(lán)0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml，變色范疇6.0～7.6（黃—藍(lán)）3.7供試品的檢查量：3.7.1每批供試品檢查量普通為10g或10ml，化學(xué)膜劑為100cm2，貴重的或微量包裝的供試品檢查量可酌減，但口服藥品不得少于3g，外用藥品不得少于5g。3.7.2供試品須取自2個(gè)以上的包裝單位。3.8供試液的制備3.8.1液體供試品：取供試品10ml，加入稀釋劑90ml，混勻，作為供試液。3.8.2固體供試品：取供試品10g，置0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其它適宜辦法混勻后，作為供試液。3.8.3腸溶膠囊（片）供試品：取供試品10g，置含有無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PH6.8）100ml的錐形瓶?jī)?nèi)，于45℃水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。3.8.4含抑菌成分供試品的供試液制備辦法：3.8.4.1離心沉淀法：可溶性供試液：取供試液10ml，置入刻度離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分以上離心沉淀30分鐘，用毛細(xì)管吸取上清液棄掉，留下管底約2ml殘存液，將其全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢查?；鞈夜┰囈海喝」┰囈?0ml，置刻度離心管中，先以500轉(zhuǎn)/分離心沉淀5分鐘，取其上清液移入另一離心管中，再經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分以上離心沉淀30分鐘，棄去上清液，保存約2ml殘存液，全部洗入增菌培養(yǎng)基中，作控制菌檢查。3.8.4.2鈍化劑中和法：磺胺類藥品中和法：取規(guī)定量的供試液，加入含有無(wú)菌1%對(duì)氨基苯甲酸試液0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培養(yǎng)即可。3.8.4.3沉降法：取規(guī)定量的供試液，自然沉降5分鐘，吸取上層液于含1%的對(duì)氨基苯甲酸1ml的增菌液，作增菌培養(yǎng)即得。3.8.4.4稀釋法將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不含有抑菌作用的濃度。3.9對(duì)照實(shí)驗(yàn)：3.9.1.1陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：測(cè)試檢查全過(guò)程中無(wú)菌技術(shù)的可靠性。3.9.1.2控制菌檢查陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：供實(shí)驗(yàn)用稀釋劑10ml于增菌液中，按控制菌檢查辦法檢查，無(wú)菌生長(zhǎng)。3.9.2陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：檢查供試品與否對(duì)控制菌生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾作用及檢查培養(yǎng)條件與否適宜。3.9.2.1陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：辦法同供試品檢查，于供試液中加入一定量（50～100）的對(duì)應(yīng)對(duì)照菌，作為陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。3.9.2.2對(duì)照用菌株：大腸桿菌[CMCC（B）44102]、沙門菌[CMCC(B)50094]3.9.2.3對(duì)照用菌液的制備：取陽(yáng)性菌株的營(yíng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20小時(shí)后，稀釋至10-6～10-7。對(duì)照菌的加入量為50～100個(gè)。（取稀釋液1ml注皿測(cè)定菌落數(shù)）3.9.2.4當(dāng)供試品未檢出控制菌時(shí)，而陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)也未能檢出，不能做出供試品未檢出控制菌的結(jié)論。3.9.2.5陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)操作必須與供試品檢查操作嚴(yán)格分開(kāi)，避免交叉污染。3.10檢查法：3.10.1檢查前的準(zhǔn)備：3.10.1.1用品的洗滌與滅菌。(a)試管：使用過(guò)的試管經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立，晾干備用。滅菌前，用棉塞塞上管口，牛皮紙包緊，扎緊。(b)吸管：使用過(guò)的吸管用清潔液浸泡數(shù)分鐘后，用水沖洗4-5次，晾干，備用。滅菌前，在吸管上端距0.5cm處塞入約2cm左右的適宜疏松棉花，用牛皮紙裹緊。(c)研缽：使用過(guò)的研缽用清潔液洗刷后，用水沖洗多次，晾干備用。滅菌前，用牛皮紙將缽體和錘包裹。(d)培養(yǎng)皿：使用過(guò)的培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用水沖洗4-5次，倒立、晾干備用。滅菌前，根據(jù)消毒器內(nèi)經(jīng)大小用牛皮紙包數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿，扎緊。(e)將上述包好的用品，放在121的高壓蒸汽消毒器中，滅菌30min后，放入微生物程度檢查室定點(diǎn)位置，備用。3.10.1.2將全部已滅菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑及供試品等移至無(wú)菌室內(nèi)。每次實(shí)驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入操作間。將全部包裝（牛皮紙）去掉，編號(hào)。3.10.1.3啟動(dòng)無(wú)菌室紫外線殺菌燈和空氣過(guò)濾裝置并使用其工作30min。3.10.1.4操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋，再用0.1%新潔爾滅或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴無(wú)菌衣、帽、口罩。3.10.1.5操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口周邊，待干后將供試品瓶、盒、袋啟封，啟封后先檢查瓶蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周邊有無(wú)生霉、長(zhǎng)螨的跡象，對(duì)肉眼可見(jiàn)疑似者，若經(jīng)證明為生霉、長(zhǎng)螨即可鑒定為不合格，不必繼續(xù)檢查。3.10.2細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)。3.10.2.1檢查程序：供試品供試品1:10供試液1:100供試液1:1000供試液1:10供試液1:100供試液1:1000供試液注皿培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)報(bào)告干燥3.10.2.2操作環(huán)節(jié)：(a)供試液制備：經(jīng)陰性對(duì)照取樣后，按各類制劑制備供試液的辦法制備。(b)稀釋及取樣稀釋：取1ml吸管1支，吸取混勻的1:10供試液（或原液，1:20供試液）1ml，在離稀釋劑液面上約1cm處，測(cè)管壁注入裝有9ml的稀釋劑的的試管中，混勻成1:100(或1:10，1:200)的稀釋液。吸樣：用上述吸管分別取1:10供試液（或原液，1:20供試液）1ml，注入2～3個(gè)平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一級(jí)的稀釋與吸取。(c)注皿與干燥事先將培養(yǎng)基融化，置45℃水浴中，備用，當(dāng)供試液及各稀釋液均注入平皿后，以上述培養(yǎng)基傾注入平皿，每平皿約15ml，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣液與培養(yǎng)基混勻后，置水平臺(tái)上待凝。培養(yǎng)基凝固后，在凈化條件下開(kāi)蓋倒置或換滅菌的陶瓦蓋，使平板干燥，減少平板表面的水分，避免菌落蔓延生長(zhǎng)，干燥時(shí)間普通在3h左右，干燥時(shí)間計(jì)入培養(yǎng)時(shí)限。(d)培養(yǎng)：將上述平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。細(xì)菌于30~35℃培養(yǎng)48±2小時(shí)，霉菌于25~28℃培養(yǎng)72±2小時(shí)。3.10.2.3菌落計(jì)數(shù)：(a)用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5-10倍放大鏡檢查，與否遺漏。(b)若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，肉眼可分辨時(shí)，仍以1個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。(c)平板上有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長(zhǎng)以及平板受到污染的狀況，該平板計(jì)數(shù)無(wú)效。(d)當(dāng)同一稀釋級(jí)使用2個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用2個(gè)平板菌落數(shù)的均值為平均平板菌落數(shù)，若2個(gè)平板菌落數(shù)相差在1倍以上時(shí)，該稀釋級(jí)不適宜采用，但不涉及2個(gè)平板菌數(shù)均在15個(gè)下列的狀況（15個(gè)下列兩平板菌落數(shù)允許幅度0-4，1-7，2-9，4-12，5-14，6-15，7-17，8-18，9-19，10-20）。(e)當(dāng)同一稀釋級(jí)使用3個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用3個(gè)平板菌落數(shù)的均值為平均平板菌落數(shù)，若其中1個(gè)平板菌落數(shù)不能參加平均，但不涉及平板菌落數(shù)均在10個(gè)下列的狀況（10個(gè)下列平板最大與最小菌落數(shù)的允許幅度0-3，1-5，2-7，3-9，4-10，6-13，7-14）。3.10.2.4菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌普通宜選用平均平板菌落數(shù)在30～300間的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)計(jì)算的根據(jù)，霉菌宜選用平均菌數(shù)在30～100之間的稀釋級(jí)作為菌數(shù)計(jì)算的根據(jù)。(a)若有1個(gè)稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)處在30～300（30～100）之間時(shí)，將該稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，為報(bào)告菌數(shù)。(b)若有2個(gè)稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)處在30～300（30～100）之間時(shí)，按下式計(jì)算兩級(jí)比值。 高稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)比值=——————————————————— 低稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)當(dāng)比值<2時(shí)，以兩級(jí)的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(c)若有3個(gè)稀釋級(jí)的平均平板菌數(shù)處在30~300（30~100）之間時(shí)，采用后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值。當(dāng)比值<2時(shí)，以兩級(jí)的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值>2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(d)若各稀釋級(jí)平均平板菌數(shù)均在300以上，按最高的稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)，或適宜增加稀釋數(shù)，重作測(cè)定后報(bào)告成果。(e)若各稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)均不在30～300之間，其中稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)不不大于300，相鄰稀釋的平均平板菌落數(shù)又不大于30時(shí)，以最靠近30或300的稀釋級(jí)平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。(f)若各稀釋平均平板菌落數(shù)均不大于30時(shí)，按最低稀釋級(jí)的平均板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)，但若應(yīng)用原液為供試液，當(dāng)1：10稀釋級(jí)與原液的平均平板菌落數(shù)相等或不不大于時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。3.10.2.5培養(yǎng)基稀釋法：取供試液（原液或1:10，1：100供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)平皿內(nèi)（每皿積壓0.2ml），每個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)，以3份供試液菌數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。若各稀釋級(jí)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)不大于1時(shí)，則報(bào)告菌數(shù)為不大于10個(gè)。3.10.2.6報(bào)告數(shù)書寫（細(xì)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則舉例）規(guī)則原液供試品稀釋倍數(shù)級(jí)間比值菌落數(shù)報(bào)告數(shù)書寫10-110-210-34.1——136516420—1640016×103或160004.2——2760295461.63775038×103或38000——2890271602.22710027×103或270004.3——239202351.72760028×103或28000——23619642—1960020×103或04.4——不可計(jì)4650513—5130051×104或510004.5——不可計(jì)30512—3050030×103或300004.6——241912—24024×103或24022.3277——27027×103或27050600—6<10(a)菌落數(shù)在100個(gè)以內(nèi)時(shí)，按實(shí)測(cè)數(shù)書寫報(bào)告。(b)菌落數(shù)不不大于100時(shí)，取二位有效數(shù)字，第三位數(shù)按有關(guān)數(shù)字解決規(guī)格解決，為簡(jiǎn)便計(jì)，也可用10的指數(shù)報(bào)告。3.10.2.7不得按計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告的狀況(a)空白對(duì)照平板有菌生長(zhǎng)，表明培養(yǎng)基已被污染；(b)各稀釋級(jí)平板上生產(chǎn)的菌落數(shù)不符合10倍遞增稀釋規(guī)律，菌數(shù)顯示混亂；(c)同一稀釋級(jí)的兩個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在15個(gè)以上，但菌數(shù)相差一倍以上；(d)菌落蔓延生長(zhǎng)覆蓋整個(gè)平板無(wú)法計(jì)數(shù)；出現(xiàn)以上狀況，該次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不得計(jì)數(shù)報(bào)告。3.10.3大腸桿菌檢查法；3.10.3.1檢查程序（見(jiàn)附頁(yè)）3.10.3.2操作環(huán)節(jié)(a)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量（10ml）的供試液，其中1份加入對(duì)照菌50～100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18～24小時(shí)（必要可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)與24小時(shí)時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性；無(wú)熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。 當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無(wú)菌生產(chǎn)，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。(b)如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng)取從試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18～24小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3可疑菌落作靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)（1）、甲基紅實(shí)驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇生成試（V-P）、枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按表（3.10.3.3）規(guī)定判斷成果。(c)靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)（1），取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。(d)甲基紅實(shí)驗(yàn)（M），取可疑菌數(shù)或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄胨水培基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅批示液數(shù)滴，立刻觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。(e)乙酰甲基甲醇生成實(shí)驗(yàn)（V-P），取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖礴水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時(shí)±2小時(shí)，于每2ml培養(yǎng)液中加入-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充足振搖，在4小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，無(wú)紅色反映為陰性。(f)枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)（C），取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上，普通培養(yǎng)48～72小時(shí)，培養(yǎng)基斜面有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)變化為陰性。(g)革蘭氏染色法、鏡檢試劑:結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g溶于95%乙醇20ml，與1%草酸銨溶液80ml混勻，靜置48h備用。革蘭氏碘液:先用3～5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入磺片1.0g，待全溶后，加蒸餾水稀釋至300ml，備用。沙黃（蕃紅）染液：將沙黃0.25g溶于95%乙醇10ml中，待全溶解后再加蒸餾水至100ml，即可。染色法：用接種環(huán)沾取無(wú)菌水，置于干凈載玻片上，再挑取少量菌苔，輕輕研開(kāi)，使均勻。涂片自然風(fēng)干或微熱烤干，而后通過(guò)火焰2～3次以固定涂片。滴加結(jié)晶紫梁液，染色1分鐘，水洗，滴加磺液媒染1分鐘，水洗，甩干余水，滴加95%乙醇脫色，約20～30秒，水洗，吸干，滴加沙黃復(fù)染液，染1分鐘，水洗，待干，鏡檢。染色成果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，陰性菌呈紅色。3.10.3.3成果判斷見(jiàn)下表：MUG-1革蘭氏鏡檢麥康凱瓊脂或EM瓊脂IMVic成果++檢出大腸桿菌--未檢出大腸桿菌+-無(wú)菌生長(zhǎng)未檢出大腸桿菌+-G桿菌有菌生長(zhǎng)-+--（1）檢出大腸桿菌-+G桿菌有菌生長(zhǎng)++--（2）檢出大腸桿菌(a)對(duì)與MUG-1反映不符合可疑菌株。如表中（1）出現(xiàn)++--或（2）出現(xiàn)-+--，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-1和IMVic實(shí)驗(yàn)。附圖：（見(jiàn)下頁(yè)）MUG管紫外觀察，顯熒光為陽(yáng)性，MUG+；無(wú)熒光為陰性，MUG-。MUG管靛基質(zhì)顯色，MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅為陽(yáng)性，I+；液面呈試劑本色為陰性，I-。

附頁(yè)：大腸桿菌的檢查程序：供試品供試品供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基5mlMUG培養(yǎng)基管MUG+I+MUG+I-MUG-I+MUG-I-判檢出大腸桿菌EMB或麥康凱瓊脂判未檢出大腸桿菌報(bào)告報(bào)告無(wú)菌落生長(zhǎng)有菌落生長(zhǎng)普通肉湯瓊脂斜面判未檢出大腸桿菌報(bào)告革蘭氏染色鏡檢靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)甲基紅實(shí)驗(yàn)V-P實(shí)驗(yàn)枸櫞酸鹽報(bào)告36±1℃48h0.2ml5hMUG管紫外觀察（MUG）(24h)MUG管靛基質(zhì)顯色（1）36±1℃18~24h36±1℃18~24h18~24h36±1℃3.10.4活螨檢查法3.10.4.1設(shè)備和材料 顯微鏡、雙筒實(shí)體顯微鏡 放大鏡 解剖針、發(fā)絲針、小毛筆 載玻片、蓋玻片 酒精燈 培養(yǎng)皿或小搪瓷盤（內(nèi)襯黑色） 30%甘油水3.10.4.2螨的形態(tài)特性螨的體形微小，多在1mm下列，普通呈卵形或橢圓形、無(wú)頭胸、腹界限。幼螨足三對(duì)，若螨足四對(duì)，成螨足多數(shù)為四對(duì)。足普通由六節(jié)構(gòu)成?？谄飨蚯巴怀觯３黍Q狀，由2-3節(jié)構(gòu)成。須肢節(jié)數(shù)因種類而異，由1-2節(jié)到5節(jié)構(gòu)成，普通呈爪或鉗狀，偶然為長(zhǎng)形。有些種類在軀體前端或兩側(cè)有1-2對(duì)眼。軀體兩側(cè)對(duì)稱，表面被有堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)的板，保護(hù)其內(nèi)部器官和支持肌肉固定。體表有剛毛，它的形狀、數(shù)目及彼此長(zhǎng)短比例和排列位置因種類而異。螨類與蜘蛛、昆蟲(chóng)（書虱），外形比較的近似，因此，必須注意它們之間的重要區(qū)別，見(jiàn)下表：螨與蜘蝗、昆蟲(chóng)重要形態(tài)鑒別特性成螨（如腐食醋螨）蜘蛛昆蟲(chóng)（如書虱）分類蛛形綱，蜱螨目蛛形綱，蜘蛛目昆蟲(chóng)綱，嚙蟲(chóng)目足4對(duì)4對(duì)3對(duì)觸角無(wú)無(wú)1對(duì)體段頭、胸、腹無(wú)界限分頭、胸部和腹部分頭、胸、腹三部3.10.4.3檢查辦法：(a)直檢法：取供試品先用肉眼觀察，有無(wú)疑似活螨的白點(diǎn)或其它顏色的點(diǎn)狀物，再用5-10倍放大鏡或雙筒實(shí)體顯微鏡檢視，有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨放在滴一滴甘油水的載玻片上，置顯微鏡下觀察。(b)漂浮法：將供試品放在隆重有飽和食鹽水的扁形稱量瓶或適宜的容器內(nèi)，加飽和食鹽水至容器的三分之二處，攪拌均勻，置10倍放大鏡或雙筒實(shí)體顯微鏡下檢查，或繼續(xù)加飽和食鹽水至瓶口處（為避免鹽水和樣品溢出污染桌面，宜將上述容器放在裝有適量甘油溶液的培養(yǎng)皿中），用干凈的載玻片蓋在瓶口上，使玻片與液面接觸，沾取液面上的漂浮物，置顯微鏡下檢查。(c)分離法：也稱烤螨法。將供試品放在特制的分離器或附有孔徑大小適宜的篩網(wǎng)的普法玻璃漏斗里，運(yùn)用活螨避光、怕熱的習(xí)性，在漏斗的廣口上面放一種60~100W的燈泡，距離藥品約6cm處，照射1-2小時(shí)。活螨可沿著漏斗內(nèi)的底部細(xì)頸內(nèi)壁向下爬，用小燒杯裝半杯甘油水，放在漏斗的下口處，收集爬出來(lái)的活螨。3.10.4.4活螨卵的檢查辦法：螨卵極小，普通在0.1mm以正是，呈乳白色，橢圓形或卵圓形。須用10-20倍放大鏡或顯微鏡方可查見(jiàn)。螨卵常見(jiàn)于活螨的周邊，但在未檢出活螨的樣品中，亦有檢出螨卵者。普通在供試品中已經(jīng)檢出活螨的，不再進(jìn)行螨卵的檢查。對(duì)可疑供試品，未檢出活螨時(shí)，可注意檢查活螨卵。檢查辦法：可采用檢查活螨項(xiàng)下的直檢法或漂浮法檢查。凡用上述兩種辦法檢查，如發(fā)現(xiàn)可疑螨卵時(shí)，用發(fā)絲針小心挑取。取一塊凹形載玻片，在凹窩中央滴入2滴甘油水，將挑取物放入甘油水中，置顯微鏡下檢查，為確證挑取物與否為活螨卵，可將上述載玻片置培養(yǎng)皿中，加蓋，于22~30℃培養(yǎng)3-8天，每天上、下午定時(shí)用低倍顯微鏡觀察，如在甘油水液中孵出幼螨，則判斷為檢出活螨卵。3.10.4.5供試品檢查報(bào)告(a)凡供試品按上述有關(guān)劑型項(xiàng)規(guī)定檢查，發(fā)現(xiàn)活螨者，應(yīng)作檢出活螨報(bào)告。(b)在供試品中未檢出活螨，但檢出活螨卵時(shí)，可按檢出活螨解決。(c)為保存陽(yáng)性成果備查，可將檢出的螨按下法解決保存；將活螨挑放在載玻片上，預(yù)先滴有1滴75%乳酸溶液中，加上蓋玻片。手持載玻片，在酒精燈小火焰上來(lái)回移動(dòng)，緩緩加熱半晌，使其適宜透化、即可鏡檢。鑒定后的螨體，可取下放入70%酒精中保存，或適宜解決。(d)發(fā)線針的制作：取長(zhǎng)約1.5cm的頭發(fā)絲一根和長(zhǎng)約10cm的小金屬棒一根，以頭發(fā)絲長(zhǎng)度的二分之一緊貼在金屬棒的一端，用細(xì)棉線將其纏緊，然后粘上加拿大樹(shù)脂或油漆，晾干，即得。3.10.5沙門菌的檢查辦法(a)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份100ml，2份分別加入規(guī)定量的供試液,其中1份加入對(duì)照菌液作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18～24小時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取其它2份培養(yǎng)物各1ml，分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基10ml中，培養(yǎng)18～24小時(shí)。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)或延至40～48小時(shí)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈現(xiàn)陽(yáng)性菌落時(shí)，供試品的平板