海馬注射對c57bl6顳葉癲癇小鼠模型的影響

海馬注射對c57bl6顳葉癲癇小鼠模型的影響

癲癇（epiepsy）是一種由大腦晶體突然出現(xiàn)異常的同步輻射，導致大腦短暫功能障礙的慢性中樞神經系統(tǒng)障礙綜合征。顳葉癲癇(temporallobeepilepsy,TLE)是最常見的局灶性癲癇綜合征,異常的癲癇放電起源于大腦顳葉,其中,內側顳葉癲癇(medialtemporallobeepilepsy,MTLE)是主要發(fā)病類型,約占全部顳葉癲癇患者的70%。在內側顳葉癲癇臨床表現(xiàn)中,腦電圖顯示異常放電多來源于大腦顳葉海馬內側,且具有局灶性;尸檢和手術標本的病理學結果顯示,患者具有明顯異常的海馬形態(tài),并且常發(fā)生一些特異性的病理改變,包括選擇性神經元丟失或神經元退行性病變,星形膠質細胞增生;另外,磁共振(magneticresonanceimaging,MRI)結果表明發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的患者大腦海馬形態(tài)異常。在內側顳葉癲癇中,有一半患者即使通過多種抗癲癇藥物進行聯(lián)合治療,仍不能有效地控制發(fā)作,在臨床治療上比較棘手,通常需要通過外科手術切除致癇灶,才有可能取得較為理想的治療效果。并且,這類患者常伴有學習、記憶和認知功能的障礙。于是,推測海馬很可能是參與內側顳葉癲癇發(fā)病的關鍵部位,海馬硬化可能在內側顳葉癲癇發(fā)病機制中起重要作用。當前研究內側顳葉癲癇發(fā)病機制的常用方法是建立動物模型,模擬內側顳葉癲癇的臨床表現(xiàn)。本研究中通過建立內側顳葉癲癇C57BL/6小鼠模型,檢測其在行為學、病理學上的表現(xiàn),初步探討內側顳葉癲癇的發(fā)病機制。1材料和方法1.1實驗動物及儀器實驗動物為SPF級,健康成年雄性C57BL/6小鼠(北京維通利華有限公司),8～10周齡(合格證號:0190894)。實驗前將動物置于通風處飼養(yǎng),24h明暗各半,自由進食和飲水,生活狀態(tài)正常的小鼠入選實驗。單臂腦立體定位儀、微型手持式顱鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司);0.5μL微量進樣器Microlitersyringes(上海高鴿工貿有限公司);采用10%水合氯醛作為麻醉劑;海人酸(Sigma公司)使用濃度為4mg/mL;采用4%的甲醛固定腦組織;兔抗鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗鼠P-S6多克隆抗體(CST公司);辣根過氧化物酶HRP、ECL化學發(fā)光試劑盒(Promega公司)。1.2海人酸對海馬的定位注射將小鼠分為空白對照組(3只)、0.9%氯化鈉注射組(10只左右)和海人酸(40只左右)注射組。將注射組小鼠(生理鹽水組和海人酸組小鼠)置于立體定位儀上,根據(jù)預實驗摸索并優(yōu)化麻醉劑用量、海人酸注射量和注射部位的各參數(shù),得到以大腦Bregma為原點的海馬定位注射坐標:-2.0、-1.8、-2.3mm(右側海馬),進行單側注射海人酸12mg/kg后,觀察其行為表現(xiàn)。生理鹽水組以35μL/g生理鹽水取代海人酸,其余步驟和注射方式同海人酸組。1.3肌肉物理分級iii、v級海人酸注射小鼠發(fā)生的癇性發(fā)作按Racine分級標準進行判定:I級,咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐;II級,以點頭運動為主的頸部肌肉抽搐;III級,單側前肢陣攣、抽搐;IV級,雙側前肢陣攣、抽搐伴身體立起;V級,雙側后肢強直,身體背曲強直,跌倒伴全身陣攣。以在急性期出現(xiàn)持續(xù)1h以上的III級以上發(fā)作,經過4～5周的靜止期后,在慢性期出現(xiàn)自發(fā)發(fā)作且狀態(tài)良好的小鼠為內側顳葉癲癇成功模型鼠。1.4免腦電泳和海馬法分別取海人酸注射后5d和5周作為內側顳葉癲癇急性期和慢性期模型,開顱取腦后固定,并逐級脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋,切片后進行蘇木精和伊紅染色,光鏡下觀察海馬病理改變。1.5蛋白質濃度測定本實驗采用高濃度的SDS提取海馬組織蛋白,以保持蛋白質在提取過程中的完整性。分別取海人酸注射后3h和5d的模型鼠大腦的海馬組織置于研缽中,倒入液氮使其瞬間冷卻,待液氮揮發(fā)后,研缽海馬至粉末狀,待組織初步研碎后,加入250μLSDS裂解液,并倒入液氮,直至組織充分研碎至細沙狀,將其轉入1.5mL離心管中,室溫放置10min,待融化成液體,沸水浴5min后,冷卻至室溫,13000r/min常溫離心10min,取上清至新的1.5mL離心管中,利用BSA試劑盒測蛋白質濃度。根據(jù)蛋白質濃度結果,計算蛋白質上樣量,按每個上樣孔150μg蛋白質等量上樣,用Westernblot檢測海馬組織中P-S6蛋白質表達量的改變。2結果2.1小鼠癲癇狀的反應與空白對照組相比,0.9%氯化鈉注射組小鼠在單側海馬注射0.9%氯化鈉后生命活動正常,未發(fā)生明顯的行為學異常。在海人酸注射組中,小鼠死亡率低于15%。海人酸注射組小鼠的行為表現(xiàn)出明顯的3個階段:急性期、靜止期及慢性期。急性期:注射海人酸幾分鐘后,小鼠立即出現(xiàn)動須、面部肌肉抽動和排便。麻醉消退后,出現(xiàn)RacineⅠ、Ⅱ級癇性發(fā)作,持續(xù)約5min后,開始出現(xiàn)III級前肢發(fā)作,之后逐漸發(fā)展為IV雙側前肢發(fā)作,持續(xù)約30～40min。在這個過程中,小鼠表現(xiàn)出以持續(xù)性的Ⅲ、Ⅳ級發(fā)作行為為特征的癲癇持續(xù)狀態(tài)。之后,小鼠發(fā)作程度逐漸減緩,2～3h后逐漸停止抽搐,癲癇持續(xù)狀態(tài)緩解,進入潛伏期。靜止期:小鼠癲癇癥狀基本消失,表現(xiàn)為精神萎靡,活動少,反應遲鈍。隔夜之后,小鼠活動恢復正常,進食、行動與正常小鼠無異。慢性期:海人酸注射3周后,小鼠開始出現(xiàn)自發(fā)癇性發(fā)作,以Ⅱ級發(fā)作開始,短時間內發(fā)展為Ⅲ、Ⅳ級全身性強直抽搐,持續(xù)約1min后自行緩解,且發(fā)作具有反復性。2.2海人酸對側與注射側錐體神經元丟失程度的比較急性期:注射海人酸后,取急性期模型小鼠進行腦切片染色觀察發(fā)現(xiàn)注射側CA3區(qū)病變出現(xiàn)得最早且較明顯,錐體神經元發(fā)生明顯丟失,隨著急性期的發(fā)展,CA3區(qū)錐體神經元丟失程度加深。此外,海人酸對側與注射側相比,未觀察到明顯的病理改變,與對照組無異(圖1)。靜止期:海馬注射側CA3區(qū)錐體神經元丟失程度加深,CA1區(qū)錐體神經元缺失逐漸明顯,較急性期有明顯增多,受累程度逐漸加深。慢性期:齒狀回區(qū)域擴大,顆粒細胞明顯分散并部分占據(jù)CA3和CA1區(qū),觀察到明顯的齒狀回顆粒細胞散布現(xiàn)象。同時,CA3區(qū)錐體神經元已基本上完全丟失,CA3細胞層基本消失,區(qū)域界限也已經模糊,CA1區(qū)錐體神經元基本丟失(圖2)。2.3海馬中p-s1蛋白質表達水平的測定Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)小鼠在海人酸分別注射3h和5d后,海馬中P-S6蛋白質表達水平較空白組均上調,并利用ImageJ軟件計算電泳條帶灰度值(圖3)。3模型病理改變的促進C57BL/6小鼠癲癇模型與內側顳葉癲癇臨床表現(xiàn)具有相似性。在癲癇發(fā)作過程中,出現(xiàn)以部分或全身抽搐為表現(xiàn)形式的繼發(fā)性全身大發(fā)作時,可在動物模型中顯著的表現(xiàn)出來。本實驗觀察到C57BL/6小鼠在急性期的全身抽搐發(fā)作和慢性期的自發(fā)發(fā)作均與內存顳葉癲癇的臨床發(fā)病特點一致,也就是說本實驗通過單側海馬注射海人酸的方式建立的小鼠模型能在行為學上較好的模擬內側顳葉癲癇發(fā)病。然而,動物模型的行為表現(xiàn)只是檢測模型的一方面指標,另一方面更重要的是動物模型海馬的病理改變。眾多研究表明海馬硬化是內側顳葉癲癇患者特征性的病理改變,表現(xiàn)為神經元丟失、顆粒細胞散布和神經元可塑性改變,從而產生異常的神經元結構和神經興奮傳導通路,使海馬神經元興奮性持續(xù)處于較高水平,易引發(fā)大腦同步異常放電,從而導致癲癇發(fā)生。但是癲癇發(fā)生過程較復雜,海馬硬化與內側顳葉癲癇發(fā)病的具體因果關系及其參與的機制尚不完全明確。mTOR通路與內側顳葉癲癇發(fā)病具有相關性。內側顳葉癲癇形成過程中,大腦發(fā)生一系列細胞分子水平的改變,研究者推測,在如此復雜多層次的生命活動過程中,必然有多種信號通路參與其中。近年來,mTOR通路與內側顳葉癲癇發(fā)病的相關性受到越來越多的關注。早期研究發(fā)現(xiàn),mTOR通路與結節(jié)性硬化癥(Tuberoussclerosiscomplex,TSC)中的癲癇發(fā)作、膠質細胞增生和神經元異常凋亡等類似于內側顳葉癲癇的行為學和病理學的表現(xiàn)有關。本研究檢測到mTOR通路活性在癲癇急性期和慢性期中皆被激活,首次報道了用單側海馬注射海人酸的方式建立的C57BL/6小鼠癲癇模型中,mTOR通路活性改變可能與內側顳葉癲