海馬注射對(duì)c57bl6顳葉癲癇小鼠模型的影響

海馬注射對(duì)c57bl6顳葉癲癇小鼠模型的影響

癲癇（epiepsy）是一種由大腦晶體突然出現(xiàn)異常的同步輻射，導(dǎo)致大腦短暫功能障礙的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙綜合征。顳葉癲癇(temporallobeepilepsy,TLE)是最常見的局灶性癲癇綜合征,異常的癲癇放電起源于大腦顳葉,其中,內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(medialtemporallobeepilepsy,MTLE)是主要發(fā)病類型,約占全部顳葉癲癇患者的70%。在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇臨床表現(xiàn)中,腦電圖顯示異常放電多來源于大腦顳葉海馬內(nèi)側(cè),且具有局灶性;尸檢和手術(shù)標(biāo)本的病理學(xué)結(jié)果顯示,患者具有明顯異常的海馬形態(tài),并且常發(fā)生一些特異性的病理改變,包括選擇性神經(jīng)元丟失或神經(jīng)元退行性病變,星形膠質(zhì)細(xì)胞增生;另外,磁共振(magneticresonanceimaging,MRI)結(jié)果表明發(fā)生癲癇持續(xù)狀態(tài)的患者大腦海馬形態(tài)異常。在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇中,有一半患者即使通過多種抗癲癇藥物進(jìn)行聯(lián)合治療,仍不能有效地控制發(fā)作,在臨床治療上比較棘手,通常需要通過外科手術(shù)切除致癇灶,才有可能取得較為理想的治療效果。并且,這類患者常伴有學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能的障礙。于是,推測(cè)海馬很可能是參與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病的關(guān)鍵部位,海馬硬化可能在內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制中起重要作用。當(dāng)前研究內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制的常用方法是建立動(dòng)物模型,模擬內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的臨床表現(xiàn)。本研究中通過建立內(nèi)側(cè)顳葉癲癇C57BL/6小鼠模型,檢測(cè)其在行為學(xué)、病理學(xué)上的表現(xiàn),初步探討內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí),健康成年雄性C57BL/6小鼠(北京維通利華有限公司),8～10周齡(合格證號(hào):0190894)。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于通風(fēng)處飼養(yǎng),24h明暗各半,自由進(jìn)食和飲水,生活狀態(tài)正常的小鼠入選實(shí)驗(yàn)。單臂腦立體定位儀、微型手持式顱鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司);0.5μL微量進(jìn)樣器Microlitersyringes(上海高鴿工貿(mào)有限公司);采用10%水合氯醛作為麻醉劑;海人酸(Sigma公司)使用濃度為4mg/mL;采用4%的甲醛固定腦組織;兔抗鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗鼠P-S6多克隆抗體(CST公司);辣根過氧化物酶HRP、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Promega公司)。1.2海人酸對(duì)海馬的定位注射將小鼠分為空白對(duì)照組(3只)、0.9%氯化鈉注射組(10只左右)和海人酸(40只左右)注射組。將注射組小鼠(生理鹽水組和海人酸組小鼠)置于立體定位儀上,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索并優(yōu)化麻醉劑用量、海人酸注射量和注射部位的各參數(shù),得到以大腦Bregma為原點(diǎn)的海馬定位注射坐標(biāo):-2.0、-1.8、-2.3mm(右側(cè)海馬),進(jìn)行單側(cè)注射海人酸12mg/kg后,觀察其行為表現(xiàn)。生理鹽水組以35μL/g生理鹽水取代海人酸,其余步驟和注射方式同海人酸組。1.3肌肉物理分級(jí)iii、v級(jí)海人酸注射小鼠發(fā)生的癇性發(fā)作按Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定:I級(jí),咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉抽搐;II級(jí),以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉抽搐;III級(jí),單側(cè)前肢陣攣、抽搐;IV級(jí),雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;V級(jí),雙側(cè)后肢強(qiáng)直,身體背曲強(qiáng)直,跌倒伴全身陣攣。以在急性期出現(xiàn)持續(xù)1h以上的III級(jí)以上發(fā)作,經(jīng)過4～5周的靜止期后,在慢性期出現(xiàn)自發(fā)發(fā)作且狀態(tài)良好的小鼠為內(nèi)側(cè)顳葉癲癇成功模型鼠。1.4免腦電泳和海馬法分別取海人酸注射后5d和5周作為內(nèi)側(cè)顳葉癲癇急性期和慢性期模型,開顱取腦后固定,并逐級(jí)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋,切片后進(jìn)行蘇木精和伊紅染色,光鏡下觀察海馬病理改變。1.5蛋白質(zhì)濃度測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用高濃度的SDS提取海馬組織蛋白,以保持蛋白質(zhì)在提取過程中的完整性。分別取海人酸注射后3h和5d的模型鼠大腦的海馬組織置于研缽中,倒入液氮使其瞬間冷卻,待液氮揮發(fā)后,研缽海馬至粉末狀,待組織初步研碎后,加入250μLSDS裂解液,并倒入液氮,直至組織充分研碎至細(xì)沙狀,將其轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中,室溫放置10min,待融化成液體,沸水浴5min后,冷卻至室溫,13000r/min常溫離心10min,取上清至新的1.5mL離心管中,利用BSA試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度結(jié)果,計(jì)算蛋白質(zhì)上樣量,按每個(gè)上樣孔150μg蛋白質(zhì)等量上樣,用Westernblot檢測(cè)海馬組織中P-S6蛋白質(zhì)表達(dá)量的改變。2結(jié)果2.1小鼠癲癇狀的反應(yīng)與空白對(duì)照組相比,0.9%氯化鈉注射組小鼠在單側(cè)海馬注射0.9%氯化鈉后生命活動(dòng)正常,未發(fā)生明顯的行為學(xué)異常。在海人酸注射組中,小鼠死亡率低于15%。海人酸注射組小鼠的行為表現(xiàn)出明顯的3個(gè)階段:急性期、靜止期及慢性期。急性期:注射海人酸幾分鐘后,小鼠立即出現(xiàn)動(dòng)須、面部肌肉抽動(dòng)和排便。麻醉消退后,出現(xiàn)RacineⅠ、Ⅱ級(jí)癇性發(fā)作,持續(xù)約5min后,開始出現(xiàn)III級(jí)前肢發(fā)作,之后逐漸發(fā)展為IV雙側(cè)前肢發(fā)作,持續(xù)約30～40min。在這個(gè)過程中,小鼠表現(xiàn)出以持續(xù)性的Ⅲ、Ⅳ級(jí)發(fā)作行為為特征的癲癇持續(xù)狀態(tài)。之后,小鼠發(fā)作程度逐漸減緩,2～3h后逐漸停止抽搐,癲癇持續(xù)狀態(tài)緩解,進(jìn)入潛伏期。靜止期:小鼠癲癇癥狀基本消失,表現(xiàn)為精神萎靡,活動(dòng)少,反應(yīng)遲鈍。隔夜之后,小鼠活動(dòng)恢復(fù)正常,進(jìn)食、行動(dòng)與正常小鼠無異。慢性期:海人酸注射3周后,小鼠開始出現(xiàn)自發(fā)癇性發(fā)作,以Ⅱ級(jí)發(fā)作開始,短時(shí)間內(nèi)發(fā)展為Ⅲ、Ⅳ級(jí)全身性強(qiáng)直抽搐,持續(xù)約1min后自行緩解,且發(fā)作具有反復(fù)性。2.2海人酸對(duì)側(cè)與注射側(cè)錐體神經(jīng)元丟失程度的比較急性期:注射海人酸后,取急性期模型小鼠進(jìn)行腦切片染色觀察發(fā)現(xiàn)注射側(cè)CA3區(qū)病變出現(xiàn)得最早且較明顯,錐體神經(jīng)元發(fā)生明顯丟失,隨著急性期的發(fā)展,CA3區(qū)錐體神經(jīng)元丟失程度加深。此外,海人酸對(duì)側(cè)與注射側(cè)相比,未觀察到明顯的病理改變,與對(duì)照組無異(圖1)。靜止期:海馬注射側(cè)CA3區(qū)錐體神經(jīng)元丟失程度加深,CA1區(qū)錐體神經(jīng)元缺失逐漸明顯,較急性期有明顯增多,受累程度逐漸加深。慢性期:齒狀回區(qū)域擴(kuò)大,顆粒細(xì)胞明顯分散并部分占據(jù)CA3和CA1區(qū),觀察到明顯的齒狀回顆粒細(xì)胞散布現(xiàn)象。同時(shí),CA3區(qū)錐體神經(jīng)元已基本上完全丟失,CA3細(xì)胞層基本消失,區(qū)域界限也已經(jīng)模糊,CA1區(qū)錐體神經(jīng)元基本丟失(圖2)。2.3海馬中p-s1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的測(cè)定Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小鼠在海人酸分別注射3h和5d后,海馬中P-S6蛋白質(zhì)表達(dá)水平較空白組均上調(diào),并利用ImageJ軟件計(jì)算電泳條帶灰度值(圖3)。3模型病理改變的促進(jìn)C57BL/6小鼠癲癇模型與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇臨床表現(xiàn)具有相似性。在癲癇發(fā)作過程中,出現(xiàn)以部分或全身抽搐為表現(xiàn)形式的繼發(fā)性全身大發(fā)作時(shí),可在動(dòng)物模型中顯著的表現(xiàn)出來。本實(shí)驗(yàn)觀察到C57BL/6小鼠在急性期的全身抽搐發(fā)作和慢性期的自發(fā)發(fā)作均與內(nèi)存顳葉癲癇的臨床發(fā)病特點(diǎn)一致,也就是說本實(shí)驗(yàn)通過單側(cè)海馬注射海人酸的方式建立的小鼠模型能在行為學(xué)上較好的模擬內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病。然而,動(dòng)物模型的行為表現(xiàn)只是檢測(cè)模型的一方面指標(biāo),另一方面更重要的是動(dòng)物模型海馬的病理改變。眾多研究表明海馬硬化是內(nèi)側(cè)顳葉癲癇患者特征性的病理改變,表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失、顆粒細(xì)胞散布和神經(jīng)元可塑性改變,從而產(chǎn)生異常的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和神經(jīng)興奮傳導(dǎo)通路,使海馬神經(jīng)元興奮性持續(xù)處于較高水平,易引發(fā)大腦同步異常放電,從而導(dǎo)致癲癇發(fā)生。但是癲癇發(fā)生過程較復(fù)雜,海馬硬化與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病的具體因果關(guān)系及其參與的機(jī)制尚不完全明確。mTOR通路與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病具有相關(guān)性。內(nèi)側(cè)顳葉癲癇形成過程中,大腦發(fā)生一系列細(xì)胞分子水平的改變,研究者推測(cè),在如此復(fù)雜多層次的生命活動(dòng)過程中,必然有多種信號(hào)通路參與其中。近年來,mTOR通路與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)病的相關(guān)性受到越來越多的關(guān)注。早期研究發(fā)現(xiàn),mTOR通路與結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberoussclerosiscomplex,TSC)中的癲癇發(fā)作、膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)元異常凋亡等類似于內(nèi)側(cè)顳葉癲癇的行為學(xué)和病理學(xué)的表現(xiàn)有關(guān)。本研究檢測(cè)到mTOR通路活性在癲癇急性期和慢性期中皆被激活,首次報(bào)道了用單側(cè)海馬注射海人酸的方式建立的C57BL/6小鼠癲癇模型中,mTOR通路活性改變可能與內(nèi)側(cè)顳葉癲