革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)課件

實(shí)驗(yàn)二革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)要求堅(jiān)持課前預(yù)習(xí)不遲到，不早退，更不能無故缺課嚴(yán)格按照正確規(guī)范實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作好記錄保持實(shí)驗(yàn)室整潔注意安全實(shí)事求是、獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程導(dǎo)入觀察上次實(shí)驗(yàn)課細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果菌落觀察：37℃孵育18～24h后觀察1.大小2.形狀3.表面（光滑？濕潤？）4.邊緣（整齊？）5.透明？6.顏色（色素？）手指皮膚細(xì)菌菌落形態(tài)教學(xué)目標(biāo)：1.鞏固和掌握顯微鏡油鏡的正確使用2.學(xué)習(xí)細(xì)菌革蘭氏染色的原理和方法3.學(xué)會(huì)顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)3.對(duì)人體微生物染色檢查，初步建立無菌操作的概念顯微鏡的使用油鏡頭的識(shí)別和重要參數(shù)油鏡的工作原理油鏡的使用方法和注意事項(xiàng)油鏡頭的識(shí)別和重要參數(shù)放大倍數(shù)數(shù)值口徑工作距離油鏡的工作原理使用油質(zhì)作為玻片與物鏡之間的介質(zhì)——油浸系可以增加顯微鏡的放大倍數(shù)可以增加事業(yè)的照明度可以增加顯微鏡的分辨率油鏡的使用方法和注意事項(xiàng)1.用低倍鏡對(duì)光。2.低倍鏡觀察（尋找觀察目標(biāo)），適當(dāng)縮小光圈。3.油鏡觀察，低倍鏡找到目標(biāo)后，物鏡轉(zhuǎn)成八字形，在載玻片上滴加一滴香柏油，直接轉(zhuǎn)至油鏡，調(diào)節(jié)細(xì)焦準(zhǔn)螺旋，使物象清晰，觀察記錄。最大光圈4.觀察完畢，上升鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡偏位，用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙滴加2～3滴酒精乙醚擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈擦鏡紙擦去殘留的酒精乙醚。5.將顯微鏡各部分還原，放回。革蘭氏染色——原理1）.細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌保留初染時(shí)的顏色。革蘭氏染色——原理

G-菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色了，再經(jīng)復(fù)染后就倍染成了紅色。對(duì)比圖：革蘭氏染色——原理2）.等電點(diǎn)不同G+菌的等電點(diǎn)低（pI2～3），G-菌等電點(diǎn)較高（pI4～5），在相同pH條件下，G+菌所帶的負(fù)電荷比G-菌多，與帶正電荷的結(jié)晶紫燃料結(jié)合較牢固且不易脫色。3）.形成的復(fù)合物不同G+菌細(xì)胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結(jié)晶紫和碘牢固地結(jié)合成大分子復(fù)合物，不易被乙醇脫色；而G-菌細(xì)胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的復(fù)合物分子也較小，故易被乙醇脫色。實(shí)驗(yàn)材料1.標(biāo)本：培養(yǎng)18～24h的學(xué)生手指皮膚表面細(xì)菌；2.染色液和試劑：結(jié)晶紫，碘液，95%乙醇，稀釋石碳酸復(fù)紅，生理鹽水，香柏油，酒精乙醚；3.器材：載玻片，接種環(huán)，酒精燈，顯微鏡，打火機(jī)，擦鏡紙等。革蘭染色——方法與步驟1.制片：1）.涂片：取一潔凈載玻片，按無菌操作方法，接種環(huán)滅菌后取生理鹽水1～2環(huán)于載玻片中央，接種環(huán)再次滅菌，冷卻后選取平板上單個(gè)菌落涂于生理鹽水，并用接種環(huán)混合均勻，制成薄涂片。2）.干燥：涂片自然干燥或在酒精燈上方烘干，切忌緊靠火焰，以免標(biāo)本烤焦，損壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，影響鏡檢。3）.固定：手持玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次。（以不燙手為宜）。注意：操作過程中始終貫穿無菌操作觀念，要把生物安全放在心里。在新冠疫情的環(huán)境下，作為醫(yī)學(xué)生更應(yīng)該牢記生物安全。方法與步驟2.染色初染1min媒染1min脫色（結(jié)晶紫）水洗（碘液）水洗（95%乙醇）

30s～1min

水洗

自然干燥30s復(fù)染觀察水洗（稀釋石碳酸復(fù)紅）方法與步驟3.觀察

紫色：G+1）看顏色

紅色：G-

圓形：球菌

2)看形態(tài)

桿形：桿菌

弧形：弧菌結(jié)果：G+球菌/G+桿菌/G+弧菌；G-球菌/G-桿菌/G-弧菌。不偽造和編造結(jié)果，做人做事實(shí)事求是，學(xué)術(shù)誠信。革蘭氏陽性球菌革蘭氏陰性球菌霍亂弧菌副溶血性弧菌示教學(xué)生操作問題總結(jié)分析1.涂片過厚，導(dǎo)致結(jié)果不易觀察；2.干燥時(shí)注意標(biāo)本烤枯，不要忘記標(biāo)本固定；3.脫色時(shí)間是關(guān)鍵；4.菌齡不易太老，以18~24h為宜；5.學(xué)生提問，解答。實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名、班級(jí)和學(xué)號(hào)實(shí)驗(yàn)題目實(shí)驗(yàn)原理（略寫）實(shí)驗(yàn)操作（略寫）實(shí)驗(yàn)結(jié)果——畫圖——文字描述分析和討論