卡拉膠降解酶的分離純化

#1.前言卡拉膠是一種具有商業(yè)價值的親水凝膠（屬天然麒麟糖植物膠），主要存在于紅藻綱中的麒麟菜屬、角叉菜屬、杉藻屬和沙菜屬等的細胞壁中?？ɡz是由，1,3-P-D-吡喃半乳糖和1,4-a-D-吡喃半乳糖作為基本骨架，交替連接而成的硫酸線性多糖。與瓊膠相比，卡拉膠所有的卜連接和a（1-4）連接的殘基都是D構型，但瓊膠在a（1-4）連接半乳糖基上在中是L-構型。對卡拉膠來說，它的結構在a（1-4）連接的半乳糖基上還形成了3,6-內(nèi)醚，見圖⑴^-cEjrrflgaenfln^-cEjrrflgaenflnT-卡拉膠，九-T-卡拉膠，九-卡拉膠，Y卡拉膠，U-［膠，於卡拉膠。另一種分類方法是根據(jù)己確定的各種卡拉膠,卡拉膠可分為八種類型?？ɡz類型的理想的卡拉膠重復二糖的結構特征，以及1，3-連接的D-半乳糖上的硫jgfcjt酸基位置，可將各類型的卡拉膠分類為卜族卡拉膠、K-族卡拉膠、九-族卡拉膠?？ɡz是從紅藻如角叉菜、、杉藻、麒麟菜等中提取的一種水溶性多糖。我國早期曾稱其為咖啦膠、角叉萊膠、鹿角菜膠，后統(tǒng)一為卡拉膠。有許多種紅藻類都可以提取卡拉膠，目前世界上生產(chǎn)的卡拉膠有近一半是用麒麟菜作原料，此外還有角叉菜、海蘿、杉藻、沙菜、銀杏藻、叉紅藻、育葉藻等均可提取卡拉膠，我國南方廣東省用麒麟菜、北方遼寧省用角叉菜作原料生產(chǎn)卡拉膠［2］。而卡拉膠酶主要有K-卡拉膠酶，T-卡拉膠酶，九-卡拉膠酶等，其主要是依據(jù)所降解的底物命名的。許多海洋微生物如Pseudoalteromonascarrageenovora,Pseudomonascarrageenovora[3,4]等都能產(chǎn)出卡拉膠酶，其他來源例如在海洋軟體動物(Marinemollusks)體內(nèi)也有⑸。根據(jù)作用機制的不同卡拉膠降解酶可分為保持型和轉換型兩種。1995年，PhilippePotin等人報道了交替單胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所編碼的K-卡拉膠降解酶，預測其相對分子質(zhì)量為44,212Da,遠遠大于經(jīng)SDS測定的從發(fā)酵液純化出的酶蛋白的相對分子質(zhì)量35kDa°cgkA基因所編碼的K-卡拉膠降解酶序列與GH16家族中其他成員的序列具有較高的相似度，GH16家族水解酶的催化區(qū)域多序列分布表明K-卡拉膠降解酶的G1U163殘基在催化過程中起主要作用。免疫印跡實驗表明天然和重組的細菌胞內(nèi)提取物都存在一個分子量為44±2kDa的蛋白質(zhì)分子，結果表明K-卡拉膠降解酶是以前體蛋白形式產(chǎn)生并在分泌過程中經(jīng)歷了兩次蛋白水解切割作用，即先切去信號肽，然后再切去C末端的區(qū)域從302位點到397位點的96個氨基酸。成熟的k-卡拉膠降解酶由275個氨基酸組成。為了評定其作用的分子機制，通過使用凝膠過濾色譜和13C-NMR技術分析K-卡拉膠降解酶水解新卡拉六醇的產(chǎn)物，結果顯示，最先形成的是新卡拉二醇和卩-新卡拉四糖，說明該酶作用的分子機制為保持異構體構型。2001年，GurvanMichel等人⑹在研究P.carrageenovora所產(chǎn)K-卡拉膠降解酶的活性部位時，首次提出隧道模型，并認為酶的隧道狀活性部位與多糖的降解有關。其中谷氨酸殘基E163，E168分別起到親核催化作用和酸堿催化作用，天冬氨酸殘基D165在催化循環(huán)中起促進最終轉變狀態(tài)解體作用。2003年，GurvanMichel等人⑺在研究I-卡拉膠的降解機制中通過使用Alteromonasfortis產(chǎn)的I-卡拉膠降解酶與I-卡拉膠相互作用，結果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白殘基和多糖鏈的硫酸基之間的相互靜電作用在識別I-卡拉膠的過程中起主導作用。C末端的A結構域在天然酶中具有高度的靈活性，采用a/p的折疊形式。在底物與酶的復合體中，多聚陰離子模塊向P螺旋的凹槽移動，形成一個隧道。在降解過程中酶從開放的形式轉變成閉合的形式。I-卡拉膠降解酶的催化腔僅能容納一條I-卡拉膠鏈，因此酶蛋白必須先把I-卡拉膠雙螺旋從I-卡拉膠纖維結構中分離出來，然后再水解其中單一的I-卡拉膠鏈。多聚陰離子的I-卡拉膠鏈與卡拉膠降解酶的多聚陽離子的非催化表面相互作用，很可能取代了雙螺旋之間的鈣離子。非催化的外表面被看做一個楔子，可使雙螺旋鏈與卡拉膠纖維分開，但其機理還未有明確的解釋。I-卡拉膠降解酶的隧道型活性部位在打開I-卡拉膠雙螺旋和阻止已分離的I-卡拉膠鏈重新結合到晶體上的過程中起到重要的作用。2007年，Guibet等人⑻對P.carrageenovor所產(chǎn)的九-卡拉膠降解酶進行了純化、克隆和測序，序列分析結果表明，這一分子量為105kDa的酶蛋白分子具有特征性的區(qū)域，為一連接物連接至少兩個相對獨立的單元，N末端區(qū)域可能折疊成為卜螺旋槳結構。通過1H-NMR和LC-MALLS技術檢測九-卡拉膠的酶解過程表明九-卡拉膠酶為內(nèi)切酶，并通過異構體構型完全轉換的分子機制來酶解九-卡拉膠。PotinP等1991年報道從紅葉藻屬(Delesseriasanguinea)分離了一株能夠降解不同硫酸化半乳糖聚合物(瓊膠或卡拉膠)的細菌，用硫酸銨，凝膠過濾色譜(SephacrylS200HR)，離子色譜(DEAE-Sepharose-CL6B)純化K-卡拉膠酶，用SDS/PAGE電泳檢測為單一蛋白質(zhì)，測定酶分子量為40.000,最適pH7.2，300°C穩(wěn)定，但在40C只維持山。SarwarG等1987年報道用2216E培養(yǎng)基添加商業(yè)0.1%卡拉膠培養(yǎng)噬纖維菌屬的細菌Cytophagasp.lk-C783,分離胞外卡拉膠酶。用硫酸銨沉淀，離子交換色譜，凝膠過濾色譜(G-200)純化得到k-卡拉胞酶，純化的酶分子量用SDS/PAGE電泳測定為100000,K-卡拉膠酶的最適pH為7.6,最適溫度為25C。金屬離子對場Cytophagasp.lk-C783生長的影響，NaCl和MgCl2可被細菌利用，2216E中培養(yǎng)基最小濃度為0.05mol/LNaCl，0.25MgCl2。KCl和CaCl2對產(chǎn)酶沒有作用，當營養(yǎng)物質(zhì)充足的時候，卡拉膠酶在休眠和生長的細胞都可以合成和釋放?？ɡz的降解方法可歸納為三類酸水解法、超聲波降解法和酶解法。研究卡拉膠的熱水或冷水提取物的化學結構，多用酸水解、甲基化、甲醇分解等方法處理。目前，普遍采用的方法是酸水解法。從生物角度來講，卡拉膠是某些紅藻的細胞壁多糖，通常附著在海藻表面的海洋微生物，會利用自身分泌的卡拉膠酶來降解卡拉膠，有效的利用藻類中的物質(zhì)來獲得能量。目前，卡拉膠酶被用作海藻解壁酶，以獲得DNA，單細胞，蛋白質(zhì)和原生質(zhì)體。并且在卡拉膠粘度很大，提取非常困難的時候，添加卡拉膠酶以后可以使卡拉膠很快降解，粘度下降，大大方便了的提取。在卡拉膠的藥理活性實驗中，未降解的卡拉膠由于粘度大、擴散困難、很難吸收，且其毒性大，未達到有效量就能致死實驗動物。為了克服這個困難，就需要使用卡拉膠酶降解卡拉膠，使其既保持藥理活性又易吸收，減小毒性。而且降解的卡拉

膠是一種有效的體內(nèi)致炎劑，已有幾種酸降解的卡拉膠制劑被應用于臨床上。降解的卡拉膠像肝素一樣與血纖維蛋白原形成可溶絡合物且毒性小，因此對卡拉膠酶的研究成為了迫切的需要。由于九-卡拉膠低聚糖可誘導植物胚胎發(fā)育過程中小孢子的形成，效果較熱休克方法高兩倍，有望成為植物培養(yǎng)中從小飽子獲得雙單倍體的新型的促進劑，所以在九-卡拉膠低聚糖的制備中，卡拉膠酶必將扮演重要的角色。到目前為止，雖然以低分子量形式出現(xiàn)的卡拉寡糖以其獨特的活性成為近年來的研究熱點，并且酶法水解卡拉膠與光譜和化學方法相比，它是一種簡單、靈敏測定卡拉膠結構的方法，但卡拉膠酶的相關研究及應用還有待于進一步的發(fā)展，所以卡拉膠酶的應用還不是很廣泛［9］。2材料2.1菌種Cellulophagalytisctrain:N5-22.2試劑K-卡拉膠：購自鄭州世紀安華食品商貿(mào)有限公司；海水(大連開發(fā)區(qū)麗嬌灣)PAGE(PolyacrylamideGelElectro-phoresis)電泳試劑：分離膠緩沖液：1.5mol/LTris-HCl緩沖液pH8.8電極緩沖液：3.0gTris和14.4g甘氨酸溶于H2O中，定容于1L,終pH為8.3DNS試劑：將6.3g3,5-二硝基水楊酸(3，5-Dinitrosalicylicacid，DNS)和2mol/LNaOH加到500mL含185g酒石酸鉀鈉的熱水中，攪拌溶解后再加入5g結晶酚和5g無水亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000mL，貯存在棕色瓶中放置一周后使用。pH7.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液:0.2mol/LNa2HPO416.47mL與0.1mol/L檸檬酸3.53mL充分混合，終pH為7.0。3儀器DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱SHZ-D(III)循環(huán)水真空泵BS223S電子天平司；PHS-2C精密級數(shù)字式酸度計鞏義市予華儀器有限公司；塞多利斯科學儀器(北京)有限公上海虹益儀器儀表有限公司；

MLS-3750高壓滅菌機HDL1360-W潔凈工作臺MLS-3750高壓滅菌機HDL1360-W潔凈工作臺HZQ-C空氣浴震蕩器TDL-5000B低速冷凍離心機SHZ-82S水浴恒溫振蕩器LG16-W臺式高速離心機UV-2000分光光度計DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱透析袋（截留分子量8000到14000）DYY-4C型電泳儀BCD-205TACS冷藏冷凍箱北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；哈爾濱市儀器制造有限公司；上海安亭科學儀器廠；常州國華電器有限公司；北京京立離心機有限公司；尤尼柯（上海）儀器有限公司上海精宏實驗設備有限公司；USA；北京六一儀器廠；青島海爾股份有限公司；4方法4.1培養(yǎng)基的制備4.1.1種子液培養(yǎng)基K-卡拉膠0.1%，蛋白胨0.5%，酵母提取物0.1%,FeSO4?7H2O0.002%,陳海水，pH自然4.1.2固體平板培養(yǎng)基K-卡拉膠1%,蛋白胨0.5%，NaCl2%，無機鹽母液110ml，蒸餾水890ml,瓊脂1%，pH7.2粗酶液的制備將菌株Cellulophagalytisctrain:N5-2接到斜面培養(yǎng)基上活化72h后，再接種到裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，150rpm振蕩培養(yǎng)20h后,再按4%的接種量接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，35°C,150r/min振蕩培養(yǎng)20h，得到發(fā)酵液。在4°C條件下，由于此酶為胞外酶，所以通過5000r/min離心30min,得上清液為粗酶液。（除非特殊之處，所有純化步驟均在4°C條件下進行，以免酶失活）（NH4）2SO4進行鹽析沉淀及K-卡拉膠酶粗酶的制備向粗酶液中逐漸加入（NH4）2SO4至40%飽和度，4°C靜置沉淀過夜后，5000r/min冷凍離心去除雜蛋白后，再向上清液中逐漸加入（NH4）2SO4至80%飽和度，4°C靜置過夜后，5000r/min冷凍離心收集沉淀并用少量冷卻的蒸餾水溶解，置透析袋（MWCO：8000-14000Da）中用蒸餾水4°C透析脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥即得粉狀的k卡拉膠酶粗品，-20C保存。酶的分離純化裝柱取8g干膠（型號：SephadexG-200）加入300mlTris-HC緩沖液（pH7.5）,在室溫溶脹72h，使其充分溶脹。煮沸10min去除氣泡，準備裝柱。裝柱時，當凝膠顆粒連續(xù)緩慢沉降到沉積面到離柱頂端約3-5cm處，停止裝柱，在頂端加入2-3cm高的緩沖液。平衡過夜。（用恒流泵在恒定壓力下走柱子）加樣與洗脫吸取多余緩沖液，觀察床表面平整后，打開出口，待洗脫液流至與凝膠面相切時關閉出口，加少量樣品（0.2g干燥樣品，加入8ml洗脫液），根據(jù)凝膠量樣品加入約5ml（通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于5%的床體積），再打開出口，是樣品滲入凝膠。當樣品將近完全滲入凝膠時，用滴管加入約4cm的洗脫液，然后接上恒流泵，進行洗脫純化樣品收集采用部分收集器來收集分離純化的樣品。每管收集約2-3ml。收集約130管，進行蛋白濃度和酶活力的測定。將得到的產(chǎn)品一般采用透析除鹽，超濾或減壓，薄膜濃縮，再冷凍干燥得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩５鞍诐舛燃懊富盍Φ臏y定蛋白含量的測定將約130管收集的樣品，以緩沖液調(diào)零，分別測量A280nm,做出曲線圖。酶活力的測定將約130管收集的樣品，分別取適量與適量底物（0.5%卡拉膠）反應，再加入適量DNS煮沸10min顯色反應，后迅速用冷水冷卻，冷卻后再離心取上清液測540nm處OD值，根據(jù)標準曲線求出反應液中的還原糖含量，以煮沸滅活的酶液同法處理作為對照。與蛋白含量曲線進行比較。樣品蛋白濃度的測定取適當稀釋的未知樣品蛋白質(zhì)溶液1mL，加入考馬斯亮藍試劑5mL，搖勻后，室溫放置5min，測定其OD595nm值，然后根據(jù)標準曲線求出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。4.6降解產(chǎn)物的鑒定4.6.1薄層層析進行鑒定將樣品在薄層板上進行點樣，將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中（浸入展開劑的深度為距原點5mm為宜），密閉，待展開至規(guī)定距離（一般為8?15cm）,取出薄層板，晾干。將除去展開劑的層析板碘缸，顯色30min,即出現(xiàn)斑點，進行分析，鑒定。4.7電泳（樣品酶的鑒定）將所得的K-卡拉膠酶粗品溶于少量的H2O中，與樣品緩沖液按4：1相混

合后，10000r/min離心5min，不連續(xù)變性電泳（DiscontinuousNative）[9]。1）分離膠為7.5%，濃縮膠為2.5%，2）每孔的上樣量為20yL,4°C條件下，20mA恒流下電泳至溴酚藍指示劑跑到前沿0.5cm處（大約4h），使目的蛋白充分分開（大約10h）。結果5.1蛋白濃度及酶活力曲線圖注：其中紫色上線為酶活力曲線，藍色下線為蛋白濃度曲線根據(jù)此曲線圖，可以看出藍色的蛋白濃度曲線出現(xiàn)了3個大峰，分別是第7管，第20管和第33管，而且從第3管到第36管都有蛋白存在。而通過紫色的

酶活力曲線可以看出兩個高峰，分別是第8管和第20管，說明第7管雖然蛋白濃度較高，但是酶活力并沒有很高，而真正分離出來的酶主要在第8管中，第20管中蛋白濃度和酶活力都出現(xiàn)峰值，所以第20管中分離出了產(chǎn)品酶。而從第3管到第36管都斷斷續(xù)續(xù)的表現(xiàn)出有部分酶活力和蛋白濃度，分析為雜蛋白的干擾。5.2電泳結果（凝膠過濾收集樣品的鑒定）注：混合樣1：第3,5,6,7,9管混合；混合樣2：第11，13,14,15,16,17,18,19管混合；混合樣3：第25,28,30,32,34,37管混合；Marker:4.1KD-66KD根據(jù)電泳結果，可以看出第8管中蛋白質(zhì)的分子量小于20KD，并大于14.4KD，并且?guī)缀鯖]有雜蛋白。而第20管的跑出的第二條帶基本與第8管的帶相同，而在此帶上、下各一條蛋白帶；根據(jù)后面的薄層層析的結果可以看出，其中除了與8管相同的酶蛋白外還應有另外一種酶蛋白?；旌蠘?和混合樣3基本上沒有成分跑出，而混合樣2跑出四條帶，有三種成分的分子量大于20KD。根據(jù)前期的酶譜實驗，推測分子量大于20KD的樣品中一定有酶蛋白存在。

5.3薄層層析D半乳糖8管20管混合樣圖3薄層層析鑒定降解產(chǎn)物注：混合樣1：第3,5,6,7,9管混合；混合樣2：第11，13,14,15,16,17,18,19管混合；混合樣3：第25,28,30,32,34,37管混合本層析對酶活力最大的兩管第8管和第20管進行降解產(chǎn)物分析，并與部分管中的混合樣和D半乳糖的降解產(chǎn)物進行對比說明。通過本圖可以看出第8管與第20管所降解的產(chǎn)物有所不同。第8管出現(xiàn)了4種降解產(chǎn)物，而第20管降解出3種降解產(chǎn)物。三種混合樣的降解產(chǎn)物基本相同，進一步說明了混合樣中也有酶蛋白存在，并且可能為同一種酶。討論在(NH4)2SO4沉淀時，一般采取少加，慢攪拌的方法，以免(NH4)2SO4產(chǎn)生凝塊難以溶解，或者破壞酶活。同時，溫度對本實驗影響較大，操作一般在-4￡以下進行，包括離心，否則會影響實驗結果或者是酶完全失活。在初步分離過程中要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡。若新裝成的柱凝膠不均因或者出現(xiàn)氣泡，需將凝膠倒出重新裝填。另外，所用的凝膠處理要提前進行加熱溶脹，即在沸水浴中，將懸浮的凝膠漿逐漸升溫至近沸進行溶脹l-2h內(nèi)即可完成，此法還可以消毒，殺死凝膠中污染的細菌，同時也排除凝膠中的氣泡。在溶脹和處理過程中，不能進行劇烈攪拌，嚴禁使用電磁攪拌器，防止產(chǎn)生凝膠碎片，影響層析流速。樣品上柱時，加樣量的多少直接影響分離的效果。一般，加樣量盡量少一些，分離效果會比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于5%的床體積。在實驗中，根據(jù)蛋白濃度的曲線、電泳和薄層層析的結果來看，菌株N5-2產(chǎn)生至少3種卡拉膠降解酶，并且每種酶的降解產(chǎn)物不一樣。這次利用SephadexG-200凝膠過濾層析的方法只將一種酶達到了分離純化的目的。結論利用凝膠柱層析只能將一種酶分離純化出來，而另兩種酶沒有得到很好的

分離，菌株N5-2產(chǎn)生至少3種卡拉膠降解酶，并且每種酶的降解產(chǎn)物不一樣。

參考文獻紀明侯，海藻化學，北京科學出版社[M],2007,177-187華漢峰，一種用途廣泛的海藻膠一^拉膠[J]，水產(chǎn)科學，1990,9(1-10)MiehelG,BarbeyrionT.ActaCrystallogrD[J],BiolCrystallogr,1999,55(Pt4):918-920OestgaardK,wangenB.ENZYMEMICROB[J],TECHNOL,1994,15(4)326-355⑸劉巖，江曉路，管華詩，卡拉膠酶的研究進展[J]，微生物通報，2001，28(2)89-93MichelGChantalatL,DueeE,etal.TheK-carrageenaseofPcarrageenovorafeaturesatunnel-shapedactivesite:anovelinsightintheevolutionofclan-Bglycosidehydrolases.Structure[J],2001,9:513-525MichelG,HelbertW,KahnR,etal,Thestructuralbasesoftheprocessivedegradationofiota-carrageenan,Maincellwallpolysaccharideofredalgae.J.Mol.Biol[J],2003,334:421-433GuibetM,ColinS,BarbeyronT,etal.Degradationoflambda-carrageenanbyPseudoalteromonascarrageenovoralambda-carrageenase:anewfamilyofglycosidehydrolasesunrelatedtokappa-andiota-carrageenases.Biochem[J],2007,404(1):105-114于文公，拜晶晶，海洋細菌CellulophagaspQY201的卡拉膠酶研究[C],中國海洋大學，2006Chin-AnHsu,Roch-ChuiYi,Cheng-ChunChou.Purificationandcharacterizationofasodium-stimulated-galactosidasefromBifidobacteriumlongumCCRC15708.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology[J],2006,22(4):335-361致謝本次試驗的順利完成以及論文的完稿，首先要感謝我的畢業(yè)論文指導老師吳海歌老師以及姚子昂老師的無私幫助與指導，他們以敏銳的學術思想、嚴謹?shù)闹螌W作風在論文從立題、實驗到成文的整個過程中時刻給予正確的引導，整篇論文都浸透著老師的心血。感謝研究生王飛飛學姐和本課題組其他學姐學長的細心指導與幫助。感謝我的導師劉慶平老師在大學四年中，無論是學習或是生活上給予我的幫助以及引導，使我得以順利走過大學本科四年至完成本篇論文。特別感謝我的親人和朋友們在生活上，學習上給我的支持和幫助。這次的畢業(yè)設計實驗和這篇論文沒有他們的幫助，是不可能完成的。附錄：外文譯文水溶液中K-卡拉膠的酶降解標準K-卡拉膠的酶降解和經(jīng)假交替單胞，沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶重組體處理過的K-/p-卡拉膠低凝膠混合物。酶的最初速度被決定作為改變Tris或者Nal的濃度和持續(xù)的200mM共存溶質(zhì)濃度的功能，因而調(diào)節(jié)Tris和Nal的濃度。在這兩種情形下，通過加大碘化物我們觀測到強烈的酶的抑制作用。K-卡拉膠和K-加-卡拉膠的光學螺旋排列的描述和通過INMR可見的碘化物捆綁在卡拉膠上揭示了抑制作用不是被在NaI中卡拉膠的混亂排序轉變所引起的，而是由于碘化物的捆綁。這些結論通過用凝膠色譜法對降解產(chǎn)物的分析加以證實。在混亂狀態(tài)下的卡拉膠的降解導致急速的分子量和所有可能的新的角叉藻二糖低聚體的降低。在這宗排列構造下，降解動力學，平均分子重量的減少和降解產(chǎn)物的一系列數(shù)量分配隨著碘化物濃度的變化而變化。這些觀察被解釋被束縛在卡拉膠螺旋上碘化物的數(shù)量增多的結果，依次地，阻止酶的催化作用?；谶@些結果，我們提出K-卡拉膠為一個單螺旋排列結構狀態(tài)來否決先前的雙螺旋模型的提倡者。緒論卡拉膠是從許多種類的紅海藻中萃取出來的被線性硫酸鹽處理的半乳糖，以交互的分享一個a（1—3）和卩（1—4）聯(lián)接共同的D-半乳糖骨干?？ɡz根據(jù)硫酸鹽酯團的數(shù)量和位置和在1,4-連接單元上的一個3,6-酐橋的存在與否來分類。例如，K-卡拉膠的理想結構是一個1,3-鏈接P-D-吡喃（型）半乳糖-4-硫酸鹽和1,4-鏈接3,6-酐-R-D-半乳糖的二糖。I-卡拉膠有一個非常類似的結構，除了在酐-半乳糖二分之一的位置2上一個額外的酯硫酸鹽團的存在。這兩種卡拉膠有眾所周知的構建iono-凝體膠的能力而被廣泛的應用于食品工業(yè)。K-卡拉膠的凝體膠形成已經(jīng)成為許多研究的主題，現(xiàn)在一個巨大分子構造的混亂排序轉換是凝膠化的先決條件以備廣泛接受。然而，準確的凝膠化機制仍然是一個值得討論的問題。從半晶質(zhì)K-卡拉膠光纖的第一個X-射線衍射學暗示了卡拉膠單螺旋被并排的塞滿到后來的研究假設一個纏繞的雙螺旋模型，在光纖中的K-卡拉膠的線，包括基本的螺旋結構的數(shù)量是一個長期存在的論題。K-卡拉膠是一個經(jīng)歷了在三個基本構造轉換的聚電解多聚糖：混亂的（dis）,基本排列（hel,或者一個單螺旋鏈或者一個同軸交互的雙螺旋，依靠以選擇的模型），和一個并排的二聚物（dim）的基本螺旋。二聚物表明了凝膠體接合的最初的構象元素，但它也呈現(xiàn)了多聚糖鏈結交的最初步驟。K-卡拉膠作為一種多聚電解質(zhì)，這三種構型有不同的線性電荷密度的價值和對它們相關的熱動力學穩(wěn)定的不同的靜電學的貢獻。在所謂的“構象的相位圖表”中后者可以被形象化，作為一個重要的物理變量的功能，也就是，溫度（T）和離子濃度（I）。K-卡拉膠的構象相位圖表的檢查揭示了helanddim構象的（I,T）區(qū)域的存在非常密集而且大量的交迭。此外，因為他們的結構差異只是由于螺旋支鏈的聯(lián)合，所以兩種構造都具有相同的光學活動性價值。K-卡拉膠鏈的構象和聯(lián)合的特性強烈的依靠著媒介的鹽和離子濃度的種類。一些陽離子例如K+,Cs+,NH4+,和Rb+都促成螺旋構型和聯(lián)合。利用核磁共振分析法已經(jīng)用于研究陽離子的特殊綁定。一些陰離子，如I-和SCN-，也通過在K-卡拉膠上的特殊綁定促成和穩(wěn)定螺旋構型，已用127I和14N核磁共振方法分別證明。和上述的陽離子形成對照地，-和SCN-可以在一定程度上阻止大量依靠離子濃度的螺旋聯(lián)合。例如，K-卡拉膠的摩爾質(zhì)量越過從0到0.15MNaI構象轉變不會改變，然而，摩爾質(zhì)量在大約0.2MNaI或者更大時明顯的增大了。被穩(wěn)定化處理了（次級）螺旋結構的僵化的卡拉膠鏈的這些陽離子，使在濃縮的卡拉膠溶液中獲得向列相位成為可能。有趣的是，Chronakis和Ramzi也能運用單螺旋的結構參量模擬卡拉膠的向列相位的實驗行為。已經(jīng)嘗試運用直接測量已準備在I-和SCN-溶液中排列的卡拉膠分子質(zhì)量的方法決定在卡拉膠螺旋中是單鏈還是雙鏈。另外，在一個卓越的模式或者用套色版連結，運用滲透壓計或者光散射這樣非常詭辯的方法來分析分餾和未分餾的卡拉膠，在光散射實驗中，摩爾質(zhì)量的增加經(jīng)常歸結于明確的多鏈排列構象的采用。然而，隨后顯示出這只是鏈的聯(lián)合的結果。Bongaerts和同事們發(fā)表了一個關于這個問題的徹底研究。一系列的調(diào)查，提出了一個有趣的方法采用酸K-卡拉膠降解保持在無序并下令構象變化和突出卡拉膠在兩種情況下的反應。K-卡拉膠降解率在有序的狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)是10倍的無序狀態(tài)較慢，在糖苷鍵的反應差別也與降解產(chǎn)物的差異。這些產(chǎn)品已在無序構象多極模型分布，作為一個隨機卵裂預期的鍵，而雙峰分布在螺旋構象的情況下觀察。雖然離子條件對應為K和I-卡拉膠大規(guī)模聯(lián)合，結果被解釋為支持一個K-卡拉膠雙鏈有序構象模型?？ɡz酶是藻類生物量在回收涉及海洋細菌發(fā)現(xiàn)苷水解酶。在K-,I-，九-卡拉膠酶特別催化各自基板糖苷鍵水解。假交替單胞，沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶已被純化，并顯示產(chǎn)生新型。這種酶屬于糖苷水解酶家族16生長激素，并根據(jù)所得的機制，保留糖的配置。這個卡拉膠酶基因被克隆和連續(xù)過度表達，和卡拉膠酶晶體結構已被解決。假交替單胞，沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶也有助于調(diào)查卡拉膠的化學結構，更特別是，在描述的組成和卡拉膠混合分布。在酸水解的速度和糖苷鍵斷裂機制由沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶范圍應該直接與反應性和可訪問糖苷聯(lián)系數(shù)呈正相關。然而，相對于酸性降解的實驗中，K-卡拉膠酶可以硫酸硫酸酯基的水解，因此分析沒有復雜化的降解產(chǎn)物。因此，我們已進行了卡拉膠在各種鹽條件下酶降解研究。我們的目的是比較了K-卡拉膠對酶的活性構象不同性能的影響。樣本包含的片卡拉膠（圖1）,K-卡拉膠合成前體的一小部分，還考察進行比較。此示例為“低凝膠卡拉膠”確定，今后將被稱為K-/片卡拉膠。表現(xiàn)在同等條件卡拉膠和鹽為酸水解酶降解，我們同樣發(fā)現(xiàn)，以同樣的速度線圈和螺旋構象沒有消化，此外，我們觀察了不同多極模型和雙峰分布。不過，調(diào)查通過調(diào)整碘含量的一種中間狀態(tài)，我們觀察到的降解率和降解，并不能簡單地歸因于不同的產(chǎn)品形態(tài)分布范圍。因此，我們建議碘結合是主要的參數(shù)，調(diào)節(jié)酶降解卡拉膠（也可能和酸）。如果沒有完全否定了雙螺旋模型，有利于我們的動力學結果為有序卡拉膠單螺旋構象。然而，對于單個螺旋構象有確鑿的證據(jù)，就是光散射實驗。材料與方法制備的K-卡拉膠。K-卡拉膠（Cottonii的X6913）和低膠凝K-/y-k-卡拉膠（Cottonii的X6042）由斯比凱可提供。使用前，卡拉膠是由異丙醇沉淀凈化如下?？ɡz粉（5克）在500毫升超純冷水（濾膜凈水器）。停止加熱在70°C下緩慢攪拌，直至完全溶解卡拉膠。在溶液中的多糖分別由1滴加異丙醇除了大力促成下攪拌。后離心，沉淀收集和溶解在500毫升純水再次。兩次重復。卡拉膠然后溶解在500毫升時增加29.22克氯化鈉。這種鹽的數(shù)量相當于50倍，在卡拉膠硫酸酯鹽的濃度較大的群體。隔夜攪拌后，溶液透析（6-8000截留分子量大譜/波）對超純水，以消除在5mM的氫氧化鈉存在過多的鹽和單極材料，以防止樣品酸化。最后，Nacarrageenan解決辦法是通過一個過濾0.45微米過濾器（頗爾生命科學，Acrodisc注射器過濾器，高溫濾膜）和20mM的碳酸銨保存在冷凍狀態(tài)下。酶消化。為0.4%（重量/體積原液）K-卡拉膠和0.5%,k/片10mM的Tris緩沖液（2-氨基-2-（羥甲基）-1,3-丙二醇，鹽酸;）pH值8.0卡拉膠準備在室溫下輕輕攪拌過夜。為了確保完全溶解，溶液加熱至少1小時70°C和在4°C保存。鹽溶液濃度含兩次最后需要準備后才能使用。碘化鈉原液的制備與2mM的硫代硫酸鈉，以防止氧化?？ɡz和鹽溶液等體積混合后加熱10分鐘分別在70C。K-卡拉膠和低膠凝K"-卡拉膠最終濃度分別為0.2和0.25%（瓦特/5）,分別在所需鹽的濃度。該混合物維持在70C,30分鐘前被冷卻到室溫（22C）。解決辦法是在室溫下保持至少12小時，并之前用酶培養(yǎng)。在k-卡拉膠（60微克毫升-1）在適當稀釋鹽溶液的50倍。接著，40微升稀釋的酶（0.048微克毫升-1）增加了角叉菜膠溶液和孵化毫升為25°C時進行。由于K-卡拉膠酶是在堿性溶液未經(jīng)滅活的多糖化學結構，12N型氫氧化鈉（占10mL樣品微升）被添加到中期停止酶反應中。減少生產(chǎn)過程中的消化酶糖量測定中希德比和戴維森呈報，改編的方法。

核磁共振。核磁共振樣品進行了氘水加入50卩1的450卡拉膠過濾水中含有不同濃度的鹽溶液微升準備。核磁共振光譜記錄在布魯克的DRX400光譜儀在80.05MHz經(jīng)營和使用寬帶5BBO的探討。持續(xù)時間調(diào)整為0.3s和采集時間為82毫秒（32k的時間為200kHz的頻譜窗口域）。2048掃描組成的實驗都是在溫度設定為297進行光。所有數(shù)據(jù)（譜K和32赫茲的5磅大小的處理）上執(zhí)行了與布魯克Topspin的2.0版軟件的電腦，最重要的是，在半高寬為每個使用“樣本決定”布魯克命令。碘化鈉溶液的平均試驗線的寬度從10毫米到100mm范圍內(nèi)，為1762.4±9.3Hz。結果卡拉膠的降解和次序：酶促動力學和光學活性。不斷電解質(zhì)濃度進行試驗。通過分析培養(yǎng)基的還原力監(jiān)測在Tris濃度增加的情況下K-卡拉膠降解時間的變化。我們選擇0.2%（w/v）濃度的卡拉膠，因為此時旋光以及光散射實驗均能進行，另外，該試驗條件與文獻所述的酸水解條件相似。降解曲線的線性部分相當于初速度，最多有15-20%的降解。如圖2A顯示,Figure2.EffectofNalandTrisconcentrationontherateofdegradationof(A)thestandardk-and(B)low-gellingcarrageenanincubatedFigure2.EffectofNalandTrisconcentrationontherateofdegradationof(A)thestandardk-and(B)low-gellingcarrageenanincubatedwithP.carrageenovoracarrageenase.Theorderingof(C)k?and(D)low?gellingcarrageenaninNalandTriswasanalyzedbyopticalrotation.當離子濃度逐漸增加到150mMTris的過程中，初速度一直增加。對于高濃度的Tris（200-450mM）,降解速率不再變化。這與用含有15%“-卡拉膠糖的低凝膠度的k-片卡拉膠得到的曲線相似（圖2B）。隨著Tris濃度的增加，K和K-/》-卡拉膠的旋光度沒有任何變化（圖2C,D）,溶劑加熱后也沒有發(fā)生構象變化?？ɡz在Tris中的情況與其化學性質(zhì)相關的四甲基鹽的報道非常相似。200mM濃度以下的Tris中初速度增加可被解釋為K-卡拉膠酶的“鹽析”效應。低離子強度下，由于靜電作用蛋白質(zhì)分子相互聚集，結果導致活性較弱。排阻色譜法檢測低鹽濃度下酶的聚合。氯化鈉為100mM時，K-卡拉膠酶只有一個洗脫峰，然而氯化鈉濃度為10mM時，卻有三個峰（未顯示）。這種“鹽析”效應與所用的鹽類無關：在低濃度的碘化鈉及其它鹽類中有相同的結果。K-卡拉膠在碘化鈉水溶液的降解率有不同的模式。對于碘化鈉，降解率隨著碘化鈉濃度的增加而增大，碘化鈉濃度達到50mM時，速度達到最大。而對于Tris，濃度達到200mM時獲得最大速率（如圖2A）。碘化鈉濃度超過50mM時，酶活性顯著降低。這種快速增加與隨后的降低導致曲線有有一個最高點。與先前的報道一致，我們的旋光度試驗證實100mM的碘化鈉能誘導完全的螺旋形成（圖2C）。這與鏈聚合不相連（表1和參考文獻9）。對于K-/p-卡拉膠，隨著碘濃度的增加，我們看到有非常類似的酶抑制效應,雖然看上去并不明顯因為曲線在最大速率處沒有大幅度的下降。正如其名所示，K-/片卡拉膠含有片卡拉糖集團，且膠度低。如圖2D所示，這種卡拉膠形成膠與其形成螺旋能力降低相關。利用K-卡拉膠的最大變化范圍以及旋光度的變化范圍我們得出混合大分子中只有大約60%在150mM碘化鈉中是螺旋構象。很明顯混合物中片成分與K-成分比較有雙重不同：它們無法達到相同的構象次序，但同時，碘濃度增加的過程中，酶促降解時它們不能也會相互轉化。大家應該注意到，碘化鈉濃度從150增加到600mM的過程中，螺旋構象最多可增加15%，但是酶活性降低一半還多。共溶質(zhì)為常數(shù)時進行試驗。如圖3,增加碘化鈉的量同時添加Tris使得共溶質(zhì)保持常數(shù)為200mM，因為此時酶有最佳的活性（這種濃度下，pH為8,Tris的離子強度為94mM）。從0mM到200mM不斷增加碘化鈉的濃度，同時Tris的濃度從200mM到0mM，這樣能夠發(fā)現(xiàn)所有的情況——次序轉變，從纏繞到00%螺旋線圈，如圖3顯示的旋光度結果。碘化鈉濃度達到60mM過程中，卡拉膠的降解速率與其濃度成函數(shù)關系。碘化鈉濃度太高時，初始速率大大降低，

濃度為200mM時，速率最低。共溶質(zhì)常數(shù)為200mM結果顯示，碘化鈉濃度為25mM時螺旋開始形成，當濃度達到60mM時，螺旋構象達到峰值（圖3A）。有趣的是，共溶質(zhì)常數(shù)為200mM實驗中，誘導形成螺旋構象所需的碘化鈉濃度比溶液中單純?yōu)榈饣c時低（與圖2c比較）。iodideconcentration(mM)〔iodideconcentration(mM)〔clu^o-bep匚egjonpajsm卻uclljA-e_lEl:Q:(匚(匚-E/Oebepuomuonpajwrl)AUOO-eA亙一一匚-;x￥:iodideconcentration(mM)Figure3.Theorderingandthe『白t巳ofenzymaticdegrad白tionof(A)「匚白n■白geenan白nil(呂)K-/tt-carr白白nweredeterminedwithncreasingNalconcentrations,at白constant200mMcosolutesconcentration(十Tris).

Nalconcentration(mM)Figure4.Linewidthathalfheightofthe127lNMRsignalsrecordedona-andit/tf-carrageenan.TheexperimentswereconductedwithincreasingconcentrationsofNal(A)insolutionand(呂)Nalconcentration(mM)Figure4.Linewidthathalfheightofthe127lNMRsignalsrecordedona-andit/tf-carrageenan.TheexperimentswereconductedwithincreasingconcentrationsofNal(A)insolutionand(呂)atconstant200mMcosolutesconcentration(+Ths).NH)NalConcentration(mM)在k-/片卡拉膠情況下，初始速度與碘濃度曲線顯示高達200mM,最高50至70毫米，一個溫柔的下降。全國最大，曲線顯示在0mM和120mM左右，并以同樣的速度鏈達到最高值后在此訂購。對應的最大訂貨在相同條件下，以約60k-卡拉膠的％，如以不同的離子強度上述實驗。這意味著這種酶的強烈抑制觀察K-卡拉膠作為基質(zhì)不是由對K-卡拉膠酶活性碘離子的行動造成不利，也不由一對聚合物有序構象的形成。因此，必須酶抑制由于一些對卡拉膠分子，其中盡管有鏈構象與碘濃度呈正相關，影響連鎖無障礙的屬性修改。對K-卡拉膠生化指標。米氏常數(shù)（公里）沃拉卡拉膠，卡拉膠酶這項工作估計約為0.22mM，相當于約0.007%（重量/體積卡拉膠濃度）K-卡拉膠。該Km值的沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶確定約為0.28（1-4）聯(lián)系或0.009%（瓦特/V）的卡拉膠濃度。盡管決心用高分子材料，應謹慎解釋，因為每個鍵斷裂后的基板的變化，它使一對酶的飽和情況的估計。因此，在0.2%（重量/體積濃度）卡拉膠，這種酶是在飽和的條件，這表明最初的速率在0mM的碘化鈉觀察到接近最高速度（Vmax）。此外，這種酶的抑制作用觀察，例如，在60mM可能是低估了，因為可用的基板量接近飽和的條件。卡拉膠核磁共振：碘解。據(jù)報道早些時候Grasdalen和Smidsrod，卡拉膠的構象轉變是與對多糖，這是直接由寬度在半高度127I核磁共振信號（Av）增加監(jiān)測碘離子結合有關。在聚合物，當發(fā)生不具約束力的情況下，信號寬度狹窄，測量Av約1800赫茲為（見材料與方法）。在100mM的碘化鈉在水中，當螺旋形成，Av達到了5400赫茲，而當時與碘越來越多（圖4a），最大值下降。討論卡拉膠與碘結合構象。這項工作的新穎性實驗在于,由核磁共振和降解率的研究碘陰離子效應關系。核磁共振結果的127I在圖4A介紹，乙完全同意這些報告由Grasdalen和Smidsrod，隨后由諾頓等人確認。雖然在與K-卡拉膠（盡管數(shù)量非常不同）鹵素陰離子相互作用的一般性提示諾頓和合作workers52來解決它作為一個互動，融合所有其他作者在使用“網(wǎng)”具有約束力的，它不排除陰離子特異性。下面這行，我們解釋，作為對平均線寬典型127I配置兩個群體感知兩個原子核，非常不同，物理化學的情況下，深深地影響他們放松。在這種情況下接受的解釋是由所謂的“兩國論-全或無的”綁定模型，它假定為配體，一個“自由”和“約束”一個國家兩種類型的使用。對于低于100毫米，曲線增加碘含量是乙狀，并在這兩種情況下，它緊跟作為光學活性數(shù)據(jù)表明訂貨乙狀相應的發(fā)展。改變后后達到100%，這兩個曲線的形狀符合“經(jīng)典”的束縛分子分數(shù)的增加上線列陣的網(wǎng)，最簡單的一個符合Langmuir等溫線描述約束力。在低碘濃度，在恒定的離子強度的情況下，碘約束金額比在同等情況下較大的碘水，完全平行排列的構象更高的分數(shù)。作者：圖3B和4B條表明，在相同條件下，無論訂貨量的構象和約束碘是在比標準K-卡拉膠案件K-/片卡拉膠，既減少在數(shù)據(jù)綜合分析不斷共溶質(zhì)濃度和不同碘化鈉解決方案的情況下，指著一對片組件無法提供良好的碘結合位點的同時，與已經(jīng)提到的構象無法接合。

結論我們已經(jīng)表明，K-卡拉膠由P.沃拉卡拉膠，K-卡拉膠酶（以及酸水解酶降解）的不利影響的鎖鏈有序卡拉膠碘量，而不是由命令等多糖的構象。這些動力學的觀察，我們（和其他前）分子質(zhì)量測定相結合，幫助區(qū)分幾種構象及碘結合的情況。起初，作為示意圖如圖8，Table1.MolecularMassof^-CarrageenanDeterminedforVariousIodideConcentrations9iodide,mMionicstrength,mMordering,%A4Wgmol-1note(A)ThisWork0200026500060200100294400avg:279700±11500(rel.std.=4.1%)120200100354000=(avg)+27%(B)Slootmaekersetal.22020—1500335125土1456540—15040—1504—100326375土30390avg:330750土23460(rel.std.=7.1%)200200100391000=(avg)+19%(C)Bongaertsetal.8,900—1500154000土13000150150100162000avg:157000±10000(rel.std.=6.4%)200200100206350土1060=(avg)+31%(D)GrasdalenandSmidsr^d2101500720000150150100610000avg:665900土55000(rel.std.=8.3%)200300100notdetermined(E)Hjerdeetal.2701100110000110110100notdeterminedavg:110000200300&100260000=(avg)+140%aTocompareourdatawithpreviousinvestigations,averagemolecularweightandstandarddeviation(STD)werecalculated.bDegradationconditionsGPC-LALLSin200mM(afterdialysis)butwithoutthermalpretreatment.8IIIIIIIVdisdis+helhelhel+dimIonicstrength(iodide)Figure8.SchematicrepresentationofthedifferentconformationalandiodidebindingsituationsencounteredwithincreasingNalconcentrations.Withoutiodide,^-carrageenanisinadisordered(d/s)conformation.Theincreasingamountofiodideinduceshelicalconformationofthepolysaccharide,associatedwithiodidebinding.Theamountofboundiodideincreaseswithanionconcentrationinthemediumandimpedestheenzymaticdegr白actionof^-carrageenan.Forhighiodideconcentrations,carrageenandimerization(dim)startstooccurandthecarrageenanincreasesinmolecularmass.目前表現(xiàn)在溶液中很少或根本沒有碘，卡拉膠采用了障礙（DIS）的構象（圖8）,它可以很容易退化。碘濃度增加誘導螺旋構象（hel;圖811）,其中不抑制酶的活性，（二）結合碘陰離子，（三）具有與無序構象分子質(zhì)量相同。這些屬性是只兼容單螺旋構象。碘的濃度隨碘化鈉（圖8III）和單螺旋上升約束力的比例阻礙了酶的高效結合。盡管如此，仍然保持在這個階段，卡拉膠分子質(zhì)量。最后，高濃度的碘進行頑抗，更因為卡拉膠以兩個融合酶對自由多糖重復單元排列的負面影響降低。也就是說，更多的hel段被占領的，約束碘陰離子，而其他部分hel開始被解鏈成二聚體（圖8IV）。附錄：外文原文附錄：外文原文1757Biomacromolecules2009,10,1757-17671757EnzymaticDegradationof/c-CarrageenaninAqueousSolutionPiNyvallCollen,1MaudLemoine,十RichardDaniellou,Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed.Tel.:+33298292324.Fax:+33298292324.E-mail:helben@sb-roscoff.ff.'UniversityPierreetMarieCurie.EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes.Jean-PaulGuegan,*

Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed.Tel.:+33298292324.Fax:+33298292324.E-mail:helben@sb-roscoff.ff.'UniversityPierreetMarieCurie.EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes.sUniversityofTrieste.UniversitePierreetMarieCurie,ParisVI,CNRS,MarinePlantsandBiomolecules,UMR7139,Station

Biologique,BP74,F29680RoscoffCedex,France,EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes,

CNRS,UMR6226,CS50837,AvenueduGeneralLeclerc,F-35708RennesCedex7tFrance,and

DepartmentofLifeSciences,UniversityofTrieste,ViaGiorgieri1,1-34127Trieste,ItalyReceivedFebruary9,2009;RevisedManuscriptReceivedApril27,2009Enzymaticdegradationofstandard^-carrageenanandthelow-gellinghybridk-//<-carrageenanwereconductedusingrecombinantPseudoalteromonascarrageensvora/c-carrageenase.TheinitialvelocityoftheenzymewasdeterminedasafunctionofvaryingTrisorNalconcentrationsandatconstant200mMcosolutesconcentration,adjustingNalandTrisconcentrationsaccordingly?Inbothcases,weobservedstronginhibitionoftheenzymewithincreasingamountsofiodide.Thecharacterizationofthek?andcarrageenanorderingbyopticalrotationandthevisualizationofiodidebindingoncarrageenanby,27INMRrevealedthatinhibitionwasnotcausedbythedisordered—orderedtransitionofcarrageenaninNal,butbyiodidebinding.Theseresultswereconfirmedbyanalysisofthedegradationproductsbygelpermeationchromatography?Degradationofcarrageenaninthedisorderedstateledtoarapiddecreaseinmolecularmassandtheproductionofallpossibleneo?/c-carrabioseoligomers.Intheorderedconformation,thedegradationkinetics,thedecreaseofaveragemolecularweight,andthechainpopulationdistributionofdegradationproductsvariedwithiodideconcentration.Theseobservationswereinterpretedtobetheresultofincreasingamountsofboundiodideoncarrageenanhelicesthat,inturn,impedeenzymecatalysis.Basedontheseresults,weproposeasingle-helixorderedconformationstatefor^-carrageenanandrejectthepreviouslyadvocateddouble-helixmodel.IntroductionCarrageenansarelinearsulfatedgalactansextractedfrommanyspeciesofredseaweeds(Rhodophyta)andshareacommonbackboneofo-galactosewithalternatinga(1一3)and“(1—4)linkages.1,2Carrageenansareclassifiedaccordingtothenumberandthepositionofsulfateestergroupsandbythepresenceorabsenceofa3,6-anhydrobridgeonthe1,4-1inkedunit.34Forexample,theidealizedstructureofac-carrageenanisadisaccharideof1,3-linkedfi-D?galac(opyranose?4?sulfateand1,4-linked3,6-anhydro?a?D?galactose.(-Carrageenanhasaverysimilarstructure,exceptforthepresenceofanadditionalestersulfategrouponposition2oftheanhydro?galactosemoiety(Figure1).Thesetwocarrageenansarewell-knownfortheirabilitytoformiono?andthermoreversiblegelsandareextensivelyusedinthefoodindustry.57Gelformationof^-carrageenanhasbeenthesubjectofmanyinvestigationsanditisnowfullyacceptedthatadisorder—ordertransitionofthemacromolecularconformationisaprerequisiteforgelation.However,theprecisemechanismofgelationisstillamatterofdebate(see,forexample,refs8—10).FromthefirstX-raydiffractionstudyofsemicrystalline/c-carrageenanfibersthatsuggestedthatcarrageenansingleheliceswerepackedside-by-side11tosubsequentinvestigationsthatassumedanintertwineddouble-helixmodel,12,3thenumberofstrandsinvolvedthefundamentalhelicalconformationof^-carrageenaninthefiberisalong-standingissue.CarrageenanisapolyelectrolyticpolysaccharidethatundergoestransitionsbetweenthreebasicOSO3-OSO3-OH字UXoOH*1OHR1=H:p-carrageenanR1=SO3■:v-carrageenanR2=H:K-carrageenanR2=SO3-:i-carrageensnFigure1?Structureoftherepetitionmoietyofstandard^-carrageenan.Thelow-gelling/c-^-carrageenanisahybridstructuremadeofk-and//-carrabiosemoieties.Carrageenanisusuallyconvertedinto/i-carrageenanbyhotalkalinetreatment.conformations:disordered(dis),fundamentalordered(hel;eitherasinglehelixoracoaxialdoublehelix,dependingonthechosenmodel),andaside?by?sidedimer(dim)offundamentalhelices.Thedimerrepresentstheelementaryconformationalelementofthegeljunction,butitisalsopresentintheinitialstepsofassocialionofpolysaccharidechains.Ask?carrageenanisapolyelectrolyte,thethreeconformationswillhavedifferentvaluesoflinearchargedensityanddifferentelectrostaticcontributionstotheirrelativethermodynamicstabilities.Thelattercanbevisualizedintheso-called"conformationalphasediagram",asafunctionofimportantphysicalvariables,namely,temperature(T)andionicstrength(7).1415Inspectionoftheconformationalphasediagramofk-carrageenanrevealsthatthe(/,T)domainsofexistenceofthehelanddimconformationsareverycloseandlargelyoverlap.Moreover,bothconformationshavethesamevalueofopticalactivitybecausetheirstructuraldifferencesareonlyduetothelateralassociationofthehelices.Conformationalandassociationpropertiesofic-carrageenanchainsarestronglydependentonthenatureofthesaltsandtheionicstrengthofthemedium.16-20CationssuchasK+,Cs+,10.1021/bm9001766CCC:$40.75?2009AmericanChemicalSocietyPublishedonWeb05/21/20091758Biomacromolecules,Vol.10,No.7,2009NH4+,andRb+promotebothhelixformationandassociation.SpecificbindingofcationshasbeeninvestigatedusingNMRanalyses.2123Anions,suchasI~andSCN：alsofavorandstabilizehelicesthroughspecificbindingonK-carrageenan,asdemonstratedusingl27Iand,4NNMR,respectively.19,21Incontrasttotheabove-mentionedcations,I"andSCN"mayimpede,tosomeextent,massivehelixassociation,dependingontheirionicstrength.Forinstance,themolarmassofit-carrageenandoesnotchangeacrossconformationaltransitionsfrom0toabout0」5MNal;however,molarmassclearlyincreasesatabout0.2MNalandgreater.8,24Theseanions,whichrigidifycarrageenanchainsbystabilizingthe(secondary)helicalstructure,madeitpossibletoobtainanematicphaseinconcentratedcarrageenansolutions.2526Interestingly,ChronakisandRamzi25werealsoabletomodeltheexperimentalbehaviorofthenematicphaseofcarrageenanusingthestructuralparametersofthesingle-helix.Thedeterminationofwhetheroneortwostrandsareinvolvedincarrageenanheliceshasbeenattemptedbydirectmeasure?mentsofthemolecularweightoforderedcarrageenanpreparedin「orSCN-solutions.Inaddition,unfractionatedandfractionatedcarrageenanshavebeenanalyzedbyosmometryorbyhighlysophisticatedmethodsoflightscattering,inastandalonemodeorcoupledwithchromatography.8,9,1620,21,24,27-32Inlight-scatteringexperiments,anincreaseinmolarmasswasoftenattributedtotheadoptionofwell-definedmultichainorderedconformation(s).However,ithasbeensubsequentlyshownthatthisisjusttheresultofchainassociation.Bongaertsandco-workers8publishedathoroughstudyonthisissue?Forthisreason,additionalexperimentalevidenceisneededtounambiguouslydeterminethetopologyofthefundamentalorderedcarrageenanconformationandtocompletetheevidenceprovidedbymolecularweightdeterminationmethods.LJnfor?tunately,techniquesbasedoncalorimetry1433oropticalrotationproperties34,35areintrinsicallyinconclusive,becausetheyrelyonaprioriassumptionsofconformationandtheoreticalmodelsforinterpretation.Similarinconclusivestudieswerebasedonmolecularmodeling,30evenifcoupledwithsophisticatedNMRtechniques36(e.g.,NOESY,nuclearOverhausereffectspec?troscopy).Aseriesofinvestigationspresentedaninterestingapproachusingaciddegradationofk?carrageenanmaintainedindisorderedandorderedconformationsandhighlightvariationincarrageenanreactivityinbothconditions.2937*38Therateofdegradationof/c-carrageenanintheorderedstatewasfoundtobe10-foldslowerthaninthedisorderedstate.37Differencesinglycosidicbondreactivityarealsoassociatedwithdifferencesindegradationproducts.Theseproductshaveapolymodaldistributioninthedisorderedconformation,asexpectedforarandomcleavageofbonds,whileabimodaldistributionisobservedinthecaseofthehelicalconformation.AlthoughtheionicconditionscorrespondtomassivechainassociationforbothK--8*9'24andi-carrageenan,3940theresultwasinterpretedassupportingadouble-strandedorderedconformationmodelfor?carrageenan.3Carrageenasesareglycosidehydrolasesfoundinmarinebacteriainvolvedinrecyclingalgalbiomass.41Thek?,卜,andA-carragee-nasesspecificallycatalyzethehydrolysisof0(1—4)glycosidicbondsoftheirrespectivesubstrates.Pseudocilteromonascarrag-eenovoraK-carrageenasehasbeenpurified(32kDa)andshowntoyieldneo-Ac-carrabioseandneo-/c-carratetraoseasendproducts.42ThisenzymebelongstotheglycosidehydrolasefamilyGH16,likesomeagarases,andproceedsaccordingtoamechanismthatretainstheanomericconfiguration.4344ThegeneCollenetal.ofthiscarrageenasehasbeenclonedandrecombinantlyoverexpressed,andcarrageenasestructurehasbeensolvedbycrystallography.45P.carrageenovora/c-carrageenasehasalsobeeninstrumentalininvestigatingthechemicalstructureofcarrageenanand,moreespecially,indescribingthecompositionanddistributionofcarrageenanhybrids.46Intermsofacidhydrolysis,therateandmechanismofglycosidicbondcleavagebyP.carrageenovora/c-carrageenaseshouldbedirectlycorrelatedwiththereactivityandthenumberofaccessibleglycosidiclinkages?However,incontrasttoaciddegradationexperiments,the^-carrageenaseemployedisdevoidofanysulfataseactivitythatcanhydrolyzethesulfateestergroupandthuscomplicatetheanalysisofthedegradationproducts.Wehavethereforeundertakenthestudyoftheenzymaticdegradationofcarrageenaninvarioussaltconditions.Weaimedtocomparetheinfluenceofthedifferentconformationalpropertiesofk?carrageenanonenzymeactivity.A