3個牙家系的雌核發(fā)育系的構(gòu)建及倍性分析

3個牙家系的雌核發(fā)育系的構(gòu)建及倍性分析

1利用近交方法誘導(dǎo)的牙種質(zhì)的選育和純化雅拉奇奧爾加斯是寒冷的下層海水魚類。它生長迅速，體積大，肉細(xì)膩，口感好，營養(yǎng)價值高，深受消費(fèi)者喜愛。這是中國重要的海生魚育種品種。山東省沿海地區(qū)的年產(chǎn)量為1萬噸，產(chǎn)值為1億元。國內(nèi)國際市場需求逐年增長。但是,目前牙鲆苗種繁殖親本或是直接捕獲的野生魚,或是從養(yǎng)殖的成魚中篩選而出,沒有經(jīng)過系統(tǒng)的選育。為了提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、培育高質(zhì)量的苗種,迫切需要進(jìn)行牙鲆種質(zhì)的篩選和純系的培育。傳統(tǒng)育種中常利用近交方法來獲得純合度較高的子代,而人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育技術(shù)也能加快育種目標(biāo)性狀的純合速度,有利于純系的建立。在牙鲆、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、漠斑牙鲆(Paralichthyslethostigma)、真鯛(Pagrosomusmajor)、歐鱸(Dicentrarchuslabrax)等魚類上利用雌核發(fā)育技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生了雌核發(fā)育后代,并對大菱鲆、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)、大黃魚(Larimichthyscrocea)等雌核發(fā)育后代的遺傳特征進(jìn)行了微衛(wèi)星分析。吳清江等利用人工雌核發(fā)育與性別控制相結(jié)合建立了紅鯉(Cyprinuscarpio)純系;張建森等采用家系選育、多系雜交和雌核發(fā)育技術(shù)相結(jié)合的育種方法人工育成了魚類新品種-建鯉(Cyprinuscarpiovar.Jian)。在牙鲆育種方面,近年來以不同地理種群和構(gòu)建的抗鰻弧菌牙鲆群體為基礎(chǔ),建立了大量牙鲆家系,并從中篩選出生長快成活率高的牙鲆家系和親本。本文利用篩選獲得的優(yōu)良牙鲆家系,培育成熟后,通過家系內(nèi)近交和雌核發(fā)育方式,構(gòu)建了近交系和雌核發(fā)育系,對其生長性狀進(jìn)行測定,并利用倍性檢測、微衛(wèi)星標(biāo)記等生物技術(shù)手段對其遺傳特性進(jìn)行了比較分析,以期為進(jìn)一步開展牙鲆新品種的培育提供科學(xué)依據(jù)。2材料和方法2.1tfd各體的生長情況2007年利用牙鲆抗鰻弧菌群體、日本群體、黃海群體為基礎(chǔ)繁殖群體,建立了牙鲆全同胞和半同胞家系63個,培育并篩選獲得了F1代生長快、成活率高牙鲆家系3個,分別為0719,0750和0751。2.2利用組配系統(tǒng)以上牙鲆F1代家系經(jīng)過人工培育、生殖調(diào)控,于2009年春達(dá)到性成熟;在繁殖季節(jié)利用人工擠壓魚體腹部法分別采集未受精卵和精液。利用采集到的以上牙鲆家系成熟個體未受精卵100mL及對應(yīng)的同一家系雄魚精液1mL,采用兄妹近交方式干法受精,受精卵放入事先準(zhǔn)備好的3m3水缸中進(jìn)行孵化和魚苗培育,從而建立了0750近交系2個,0751近交系1個。在采集精卵的同時剪取親本鰭條1cm2左右,分別保存在加入酒精的EP管中,用于微衛(wèi)星標(biāo)記檢測。2.3利用牙成蟲培養(yǎng)考察實(shí)驗(yàn)用精子取自黃海水產(chǎn)研究所魚類精子和胚胎冷凍實(shí)驗(yàn)室精子庫,挑選解凍后活力達(dá)到70%以上的鱸魚精子。該鱸魚精液是2007年11月于海陽黃海水產(chǎn)公司采集的,并利用MPRS+20%DMSO冷凍保存在-196℃液氮中。用MPRS稀釋液將解凍后精子稀釋10倍,均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中,利用4×104μJ/cm2強(qiáng)度紫外線照射處理使其遺傳物質(zhì)失活,與以上牙鲆家系中成熟個體的卵子授精,取出一小部分受精卵放入15～17℃正常海水中培育,做為單倍體對照;其他經(jīng)遺傳物質(zhì)失活鱸魚精子剌激過的卵子,授精3min后放入2～4℃海水中冷休克處理45min,然后放入15～17℃海水中孵化和魚苗飼養(yǎng),即建立了牙鲆雌核發(fā)育家系。共建立0719雌核發(fā)育系2個、0750雌核發(fā)育系2個、0751雌核發(fā)育3個。在采集未受精卵的同時剪取母本鰭條保存在EP管中,并加入酒精保存。牙鲆雌核發(fā)育家系及自交家系的建立實(shí)驗(yàn)于2009年4月在山東省海陽市黃海水產(chǎn)有限公司進(jìn)行,家系魚苗統(tǒng)一在3m3水缸中培育,水流量0.5m3/h,培育水溫20～24℃,各水缸水流和水溫一致,定時定量的投喂飼料,由專業(yè)人員進(jìn)行牙鲆魚苗培育的日常管理工作,盡量保持培育環(huán)境一致。2.4多重比較試驗(yàn)近交系和雌核發(fā)育系魚苗生長到127d和190d時,分別取40～70尾樣本測量其全體長和體重,利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析,用Student-Newman-Keuls(SNK)法進(jìn)行多重比較,P值達(dá)到0.05水平為差異顯著(P<0.05),達(dá)到0.01水平為差異極顯著(P<0.01)。利用AGRW=(W2-W1)/(t2-t1)(g/d)(W2指末重,W1指始重,t2-t1指試驗(yàn)日數(shù)),計算每個家系生長期內(nèi)絕對增重率;利用AGRL=(L2-L1)/(t2-t1)(cm/d)計算體長絕對增長率(L2指末長,L1指始長,t2-t1指試驗(yàn)日數(shù))。2.5檢測細(xì)胞dna含量取0751雌核發(fā)育或近交家系單個魚苗,剪取其肌肉或尾鰭,置于離心管中,將海水吸去,用蒸餾水清洗一遍,加入適量的DAPI特異熒光染液,研磨使細(xì)胞分散,加入適量鞘液,用小篩網(wǎng)過濾混懸浮液于樣品管中,制得細(xì)胞懸液。使用PartecPA-Ⅰ倍性檢測儀進(jìn)行樣品分析,測試時各項(xiàng)指標(biāo)分別為Gain=448.0,速度為2.0μL/s,對照組(二倍體)正常魚苗處理樣品先經(jīng)過倍性檢測儀測定,其峰值和DNA含量作參照標(biāo)準(zhǔn)。樣品的鑒定結(jié)果經(jīng)過倍性分析儀內(nèi)部軟件分析處理,轉(zhuǎn)化為DNA相對含量直方圖,對直方圖上數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)處理,個體倍性按如下公式判斷:細(xì)胞DNA含量以DNA指數(shù)(DNAindex,DI)即峰指數(shù)表示,以DI=1.0±0.1為二倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)。DI=處理組細(xì)胞G0/1峰值道數(shù)/對照組細(xì)胞G0/1峰值道數(shù)均值。2.6pcr擴(kuò)增及聚合酶系統(tǒng)成分DNA提取參照劉云國等的方法進(jìn)行。本研究利用的14個微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記,來源于Kim等、Ji等開發(fā)的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記,以及Kang等構(gòu)建的牙鲆圖譜,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選,對牙鲆特異性高,引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系為15μL,包括10×buffer,0.2mmol/dm3dNTPs,0.2μmol/dm3引物,1U的TaqDNA聚合酶(Tiangen)。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min,94℃30s,退火45s,72℃延伸30s,35個循環(huán),最后72℃延伸7min。反應(yīng)在PTC-200上進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后,加入體積的甲酰胺變性劑,95℃變性5min,迅速冰浴冷卻。變性產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后,銀染顯色。2.7位點(diǎn)多態(tài)性分析對照PBR322分子量標(biāo)準(zhǔn)確定每個個體的基因型,利用POPGENE軟件計算2個家系的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)。同時計算了各家系的近交系數(shù)(Fis)、平均遺傳雜合度(Ave_Het)、并根據(jù)Botstein等的分類方法計算位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)。用GenePop(Version3.4)軟件進(jìn)行各基因座間連鎖不平衡分析,χ2檢驗(yàn)估計Hardy-Weinberg平衡偏離,χ2檢驗(yàn)的概率P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。偏離指數(shù)d值則反映了Ho和He的平衡關(guān)系,能夠直觀的表明家系內(nèi)雜合子的缺失或過剩,由下列公式計算:d=(Ho-He)/He。3結(jié)果3.1家系間的生長情況利用鱸魚冷凍精子,經(jīng)過遺傳物質(zhì)滅活后誘導(dǎo)0719,0750和0751家系成熟個體的未受精卵,再利用冷休克法抑制第二極體排出,得到減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體,從而建立了以上3個家系的雌核發(fā)育系。0719的雌核發(fā)育系為46,47號,0750的雌核發(fā)育系為21,27號,0751的雌核發(fā)育系為20,38,39號;0750的近交系為5,90號,0751的近交系92號。平均生長至127d時,從體長和體重對比結(jié)果看,5號家系(0750近交)生長最快(P<0.05),20號家系(0751雌核發(fā)育)生長次之,家系47(0719雌核發(fā)育)生長最慢(P<0.05)。平均生長至190d時,20號和38號家系(0751雌核發(fā)育系)生長最快(P<0.05),46號和47號(0719雌核發(fā)育系)生長最慢(P<0.05),20號家系的絕對增重率也最大為1.919,20,38和39號(0751雌核發(fā)育系)的平均絕對增重為1.628;46和47號(0719雌核發(fā)育系)的平均增重率為1.324,21和27號(0750雌核發(fā)育系)的平均增重率為1.179,5和9號(0750近交系)的平均增重率為1.344,92號(0751近交系)增重率為1.176。從所有家系的絕對體長增長率和增重率看,0751雌核發(fā)育系的體長增長率和增重率較大。但是同一家系的雌核發(fā)育系和近交系相比,0750近交系的體長增長率和增重率大于其雌核發(fā)育系(表2,3)。3.2dna相對含量如圖1所示,X軸為熒光強(qiáng)度,即DNA的相對含量值,Y軸為細(xì)胞相對數(shù)量(細(xì)胞頻率)。核DNA含量測定的結(jié)果以直方圖的形式表示,直方圖中有兩個峰(Peak),峰1為DNA相對含量較低、細(xì)胞頻率高,是有絲分裂中G0-G1期的細(xì)胞峰值;峰2為DNA相對含量高、細(xì)胞頻率較低,是G2-M期的細(xì)胞峰值。近交系和雌核發(fā)育系峰1的峰指數(shù)(index)都為1,近交系峰2指數(shù)為1.864,雌核發(fā)育系峰2的指數(shù)為1.934,峰2的指數(shù)都是峰1的近2倍。兩家系DNA相對含量平均值(Mean)峰2近似于峰1的2倍,自交系峰2的DNA相對含量58.77,雌核發(fā)育系峰2的DNA相對含量61.95,表明兩家系的DNA含量相近。雌核發(fā)育家系和自交家系的DNA指數(shù)均為1.000,說明二者染色體倍性相同,均為二倍體。3.3ekop17-li位點(diǎn)的圖譜分析本研究采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。所采用的14對微衛(wèi)星引物均能穩(wěn)定重復(fù)地擴(kuò)增出相應(yīng)的同源序列。一般而言,1個微衛(wèi)星座位的特異引物在純合的材料中只能擴(kuò)增出1條DNA帶。在每個個體中僅出現(xiàn)一條帶為純合子,出現(xiàn)兩條帶為雜合子。在EKOP17-Li位點(diǎn)的圖譜上,兄妹近交系的純合子達(dá)到16.67%,雌核發(fā)育系的純合子達(dá)82.35%(見圖2),說明減數(shù)雌核發(fā)育較兄妹近交能使部分基因盡快的達(dá)到純合。說明減數(shù)雌核發(fā)育較兄妹近交能使部分基因盡快的達(dá)到純合。雌核發(fā)育家系的有效等位基因數(shù)(1.9369)略低于近交家系(2.0829),也表明雌核發(fā)育家系的純合度高于近交家系。3.4遺傳雜合度和基因型在近交家系中,除EKOP-E1-In,EKOP17-Li,EKOP-E1-Ey是高度多態(tài)位點(diǎn)以外,其余均為中度多態(tài)位點(diǎn);而在雌核發(fā)育家系中,14個微衛(wèi)星位點(diǎn)均為中度多態(tài)位點(diǎn)。近交系14個位點(diǎn)的平均PIC為0.403,雌核發(fā)育系為0.366,表明近交家系及雌核發(fā)育家系遺傳多態(tài)性都較低,但雌核發(fā)育系低于近交系。近交系和雌核發(fā)育系相比較,等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)、平均遺傳雜合度(Ave_Het)、多態(tài)信息含量(PIC)幾個遺傳指數(shù)都高于雌核發(fā)育系,其中觀測雜合度的差異達(dá)到了顯著性差異水平(P<0.05)。遺傳雜合度顯示雌核發(fā)育群體的遺傳一致性較高,該群體的遺傳變異較少,遺傳多樣性較低。近交家系的遺傳偏離指數(shù)d為0.0915,說明該家系雜合子過剩,而雌核發(fā)育家系的遺傳偏離指數(shù)d為-0.1573,處于雜合子缺失狀態(tài),實(shí)際純合子過量,反映了雌核發(fā)育更利于基因的純合。但兩家系相比較,近交家系d值更接近0,其基因型分布比較接近于平衡狀態(tài)。用基于馬可夫鏈模型(Markovchainmethod)的Hardy-Weinberg精確P值無偏估計,對單群體單基因座檢測(HWtestforeachlocusineachpopulation)發(fā)現(xiàn),近交系中EKOP-E1-In、Pod2兩個基因座分別表現(xiàn)為顯著的遺傳不平衡(P<0.05)和極顯著遺傳不平衡(P<0.01)。在雌核發(fā)育系中KOP63,Pod2表現(xiàn)為顯著遺傳不平衡(P<0.05),EKOP17-Li和Poli113TUF兩個基因座表現(xiàn)為極顯著的遺傳不平衡(P<0.01),其余的基因座處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05)(表4,5)。4繁殖生物學(xué)及篩選張建森等利用家系選育、系間雜交和雌核發(fā)育技術(shù)相結(jié)合,成功培育出了淡水養(yǎng)殖新品種建鯉(Cyprinuscarpiovar.Jian),但在海水魚類養(yǎng)殖方面,除近年來從國外引進(jìn)大菱鲆等優(yōu)良養(yǎng)殖品種外,國內(nèi)在鲆鰈魚類養(yǎng)殖新品種的培育方面還需做大量的工作。利用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育和兄妹近交的方式可以逐步建立魚類純系,通過不同純系之間的雜交可以獲得性狀優(yōu)良的品種,為魚類的品種改良提供重要手段。最早建立純系一般采用連續(xù)近親交配的方法,但是利用此法至少要經(jīng)過連續(xù)8～10代同胞兄妹交配才能達(dá)到目的。人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育因?yàn)楦副救旧w沒有參與合子核的形成而大大地縮短了子代純合的過程,一般第一代雌核發(fā)育后代純合的比例為0.6,高于兄妹交配(0.25)和自體受精(0.5),第二代雌核發(fā)育后代的純合率可達(dá)0.9。抑制第一次卵裂雌核發(fā)育的純合度相當(dāng)于連續(xù)四代的兄妹近交,雌核發(fā)育子二代相當(dāng)于連續(xù)八代的近交,這樣經(jīng)過1～2次雌核發(fā)育,就可以達(dá)到建立純系的目的。我們對3個近交系和7個雌核發(fā)育系的生長性狀進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)在家系生長至190d左右時,0751雌核發(fā)育系生長較其他幾個近交系和雌核發(fā)育系生長快,但是0750的近交系生長快于雌核發(fā)育系,理論上遺傳的純合性會對后代的生長會產(chǎn)生影響,特別是利用連續(xù)近交的方法建立純系,可能會出現(xiàn)后代適應(yīng)力減弱等現(xiàn)象,即“近交衰退”,但在目前近交系中還沒有發(fā)現(xiàn)明顯的近交衰退現(xiàn)象。雌核發(fā)育系的生長與母本性狀有直接的關(guān)系,魚苗在1齡之前的生長受母體效應(yīng)的影響也較大,從目前各自交系和雌核發(fā)育系生長看,還不能確定是自交系生長快還是雌核發(fā)育系生長快。雌核發(fā)育系和近交系以后的生長性狀及適應(yīng)能力如何將做進(jìn)一步研究。對于某一物種,其細(xì)胞核中DNA含量是一定的,利用流式細(xì)胞儀檢測魚類個體的DNA含量,可以快速直觀的檢測其倍性。這一技術(shù)應(yīng)用于大黃魚三倍體、鯽、雌核發(fā)育草魚、半滑舌鰨雌核發(fā)育后代等魚類的倍性分析。本文利用遺傳物質(zhì)滅活的冷凍保存鱸魚精子誘導(dǎo)并經(jīng)冷休克的方法建立了雌核發(fā)育系。雖然鱸魚和牙鲆的染色體數(shù)目都為2n=48,端著絲點(diǎn)染色體,但二者發(fā)育對外界環(huán)境要求不同,且胚后發(fā)育速度也不一致,因此盡管鱸魚精子具有和牙鲆雜交的能力,但是雜交的胚胎發(fā)育到眼囊期就開始死亡,不能形成尾部,所以利用滅活的鱸魚精子誘導(dǎo)牙鲆雌核發(fā)育可保證正常發(fā)育后代的遺傳物質(zhì)中不會有父本基因。倍性分析結(jié)果顯示,雌核發(fā)育系與近交系具有相同的倍性,而且DNA含量相近,保證了雌核發(fā)育純系建立的可靠性。多態(tài)信息含量PIC是指后代所獲得的分子標(biāo)記來源于其親本同一個分子標(biāo)記的概率。PIC>0.5時,為高度多態(tài)位點(diǎn);0.25<PIC<0.5時,為中度多態(tài)位點(diǎn);PIC<0.25時為低度多態(tài)位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)近交家系平均PIC=0.403,處于中度偏高多態(tài)基因座水平,雌核發(fā)育家系平均PIC=0.366,處于中度多態(tài)基因座水平。雜合度能較好地反映群體中等位基因的豐富程度和均勻程度,普遍認(rèn)為其為度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù),其大小可以反映群體遺傳變異的高低。朱曉琛等用8個微衛(wèi)星位點(diǎn)對牙鲆雌核發(fā)育二倍體家系純合性進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體平均雜合子比例為0.8224,而本實(shí)驗(yàn)近交系和雌核發(fā)育系的平均雜合度分別為0.5066和0.4828,雌核發(fā)育系相對較低,多樣性水平偏低,說明利用本文方法建立的雌核發(fā)育系具有較高的純合度。d值越接近0,基因型分布越接近平衡狀態(tài),但是在本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果中近交系出現(xiàn)了2個不平衡位點(diǎn),雌核發(fā)育系出現(xiàn)了4個不平衡位點(diǎn),這與牙鲆家系的建立和篩選中有意的篩選個別突出性狀相符,以上家系是從大量家系中篩選出的長得快、成活率高的牙鲆家系,因此不平衡的位點(diǎn)很可能與以上性狀相關(guān),但這一點(diǎn)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。在野生群體中有效等位基因數(shù)目的減少可能是由于捕撈量的加大、生存環(huán)境日益惡化等所導(dǎo)致的有效種群縮小,進(jìn)而使得有效等位基因更容易丟失。養(yǎng)殖環(huán)境下由于近親繁殖和長期的人工篩選,也會導(dǎo)致等位基因的丟失。本研究中近交系和雌核發(fā)育系的有效等位基因數(shù)偏小(僅2～3),主要是由于近親交配和母系遺傳使其基因位點(diǎn)發(fā)生了大量的純合,導(dǎo)致有效等位基因數(shù)偏小。微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)程度高,符合孟德爾遺傳規(guī)律,呈共顯性遺傳,檢測容易、重復(fù)性好,在群體遺傳研究方面具有重要的作用。牙鲆微衛(wèi)星DNA同樣遵循孟德爾遺傳定律,即親本基因型決定子代基因型,排除基因突變及基因錯配情況下,子代單座位的等位基因必定一個來自母本,一個來自父本。雌核發(fā)育家系中,理論上子代不存在父本等位基因,子代等位基因應(yīng)全部來自母本。本文中雌核發(fā)育家系通過遺傳滅活的鱸魚精子誘導(dǎo),冷休克阻止第二極體的排出實(shí)現(xiàn)染色體加倍。但是在減數(shù)分裂過程中由于同源染色體間可能發(fā)生交換,導(dǎo)致基因重組,因此減數(shù)分裂雌核發(fā)育二倍體后代中仍會出現(xiàn)部分雜合子。有關(guān)魚類雌核發(fā)育群體基因重組的報道,重組率的變動范圍較大。王曉清等對大黃魚人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育后代的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了分析,兩家系后代的基