從寵物農場到哈佛的小鼠

從寵物農場到哈佛的小鼠

1小鼠基因組計劃的發(fā)展和應用在分類上，老鼠屬于節(jié)肢動物門、幼齒科和甲狀腦。目前生物醫(yī)學研究領域通常所研究的是小家鼠(musculus),是和人類共居的一類小型嚙齒動物,在地球上分布廣泛,種類繁多。在被引進實驗室以前,一般認為中國和日本早在三四年前就建立了一些當作寵物的小鼠品系。然而一直到1902年,哈佛大學的Castle才在當時孟德爾遺傳學研究的影響下開始了小鼠遺傳學研究,并在其學生的幫助下對小鼠的遺傳和基因變化進行系統(tǒng)的分析。1909年Castle實驗室的Little得到了第一個近交系小鼠——DBA品系后,隨后在ColdSpringHarborLaboratory和TheJacksonLaboratory工作中陸續(xù)得到了C57BL/6、C3H、CBA和BALB/c等多種近交系小鼠,這些近交系構成了目前世界上使用最廣泛的幾種品系。在這一百年里人們已經(jīng)建立了近400多個近交系,6000多個突變品系。小鼠已成為了最適于基因組改造的模式動物。1982年,Palmiter和Brinster首先制造了攜帶外源基因的新的小鼠品系——“轉基因小鼠”。第一個轉基因小鼠品系攜帶了可表達的大鼠生長激素的基因片斷,過度的生長激素導致轉基因小鼠的體型增大,第一次在整體動物水平證明了生長激素的功能。在Evans、Smithies和Capecchi等實驗室的共同努力下,通過ES細胞內DNA同源重組的方法,科學家于1987年得到了第一只基因剔除小鼠?；蛱蕹峁┝搜芯吭谡w動物水平研究基因功能的“金標準”:即分析特定基因缺失后的功能障礙來推斷基因的功能。1998年,在Dolly羊出生一年后,克隆小鼠也在夏威夷的實驗室中誕生。由于在1990年啟動人類基因組計劃時小鼠就被列為五種核心模式生物之一,所以小鼠基因組計劃是最早啟動的非人基因組計劃。到了2002年,小鼠C57BL/6j近交系基因組的研究相繼取得了成果:5月小鼠的16號染色體基因圖譜被首先被繪制出來,并發(fā)現(xiàn)其與人類的21號染色體是高度同源的;8月小鼠的全基因組圖譜完成;12月小鼠基因組測序基本完成。至此小鼠的研究進入了一個新階段。和小鼠的分子生物學研究同步的是小鼠的生理生化數(shù)據(jù)的積累。各種專門用于小鼠的代謝、心血管、呼吸、骨骼、血液、行為等生理功能檢測儀器設備和方法在過去幾十年中得到的迅速發(fā)展,比較醫(yī)學的研究使得我們可以將小鼠的特定生理生化功能和人類進行比較分析。由于不同的小鼠近交系在許多上述指標上有明顯的差異,因此,通過這些近交系基因組的多態(tài)性的連鎖分析,可以建立特定功能表型在基因組上的定位,發(fā)現(xiàn)和確定表型與基因型之間的關系。從最早的簡單分析不同近交系的分子多態(tài)性,進而采用微衛(wèi)星標記,最新發(fā)展到單核苷酸多態(tài)性,在基因組中將一個特定功能或表型定位到1kb將不再是夢想[7~9]。近年來,在基因組計劃完成的基礎上,通過化學誘變、DNA“基因陷阱”或轉座子轉座作用建立新的突變小鼠品系成為一種時尚,這種以新突變品系的病理表型為出發(fā)點,然后通過突變的染色體定位最終克隆突變基因的方法已經(jīng)大大推動了疾病模型的研究,并在短期內提供了大量的新的小鼠品系[10~12]。經(jīng)典的小鼠遺傳學家也找到了新的思路,他們正在建立上百種通過現(xiàn)有近交系雜交而形成的新的重組近交系。通過對這些新的近交系與母本近交系在生理生化表型和基因型的連鎖比較,我們有望對一些復雜性狀(如代謝過程)的調控作深入的遺傳學分析,從而發(fā)現(xiàn)復雜疾病(包括糖尿病/肥胖癥、高血壓、免疫失調、及神經(jīng)性疾病等)的發(fā)病機理機制。從2005年起,大規(guī)模開展基因剔除的研究計劃分別在美國、歐盟和加拿大實施,第一期總投資達1億多美元。該計劃的最終目標是要將小鼠的3萬多個基因逐一進行基因剔除,建立基因剔除小鼠品系,從而分析基因的功能。可以預見,小鼠的突變品系,將在不遠的將來達到4到5萬個品系。2小鼠的生物學特性小鼠作為模式生物相對于其他物種有什么優(yōu)勢?首先,從進化的角度上來看小鼠作為哺乳動物的代表有其不可動搖的地位。除了小鼠以外的四種模式動物都至少在2.7億年前就在進化上與人類走到了不同的分支,而小鼠在6千萬年前還和人類共同擁有一個祖先。在2002年小鼠基因組的測序工作初步完成時,研究者們分析了96%小鼠基因組序列。在這其中有99%的基因能在人的基因組序列中找到同源序列,證實了小鼠與人類在基因水平上的高度同源。同樣,小鼠的生理生化指標及其調控機制和人類相同或相似,因此小鼠的研究成果就有很大的可能性是可以推演到人類,所以對小鼠進行研究的有很大的應用價值。其次,和狗、猴等大型哺乳動物相比,小鼠的繁殖能力強,生殖周期短。通常實驗用的近交系小鼠一胎生育5~10只幼鼠,而遠交群的小鼠的生殖能力更強。這些幼鼠在10周之后就能達到性成熟的狀態(tài),開始繁殖下一代。同時小鼠沒有親子相殘的習性,這樣生產后的雌鼠和幼鼠仍可以和雄鼠同籠。這樣不但確保了幼鼠的成活率,同時也能提高交配的頻率,確保了繁殖的高效率。小鼠飼養(yǎng)也相對簡單,由于小鼠體積小(通常成年鼠的體重在20~40g之間),所以可以在有限的空間內進行大規(guī)模飼養(yǎng),因而十分利于進行大規(guī)模的實驗。再次,小鼠交配時會形成陰栓,這有助于判斷交配的時間,對研究中判斷不同發(fā)育階段十分重要。因為其他動物的受精時間通常要通過觀察交配行為來確定,而小鼠的這種特性就使研究人員不必時刻注意實驗動物的行為,為工作提供了便利。小鼠的大多數(shù)品系比較溫順,容易抓取和進行實驗操作。最后,由于小鼠的這些特點使其在世界范圍內廣泛使用,而且形成了各種實驗用近交系,使用有基本一致遺傳背景的近交系小鼠所做出的實驗成果容易在不同的實驗室重復,這就使實驗結果更容易被接受。這也是小鼠作為模式生物的主要優(yōu)勢之一。3小鼠細胞移植的功能小鼠在生命科學的研究中有著諸多用途。根據(jù)其對小鼠的影響,常見的實驗應用可以分為三大類:第一類是只對小鼠進行觀察和檢測的實驗應用;第二類是不改變小鼠基因,但是對小鼠施加了外界影響的實驗應用;第三類是改變小鼠基因組的實驗應用。第一大類的實驗應用中使用的實驗技術是相對較為常規(guī)的。該類包括了小鼠的解剖、形態(tài)觀察和組織學分析、基因鑒定(genometyping)、各種免疫印跡(Western,Northern,SouthernBlot)和RNA檢驗方法(RT-PCR)等微觀實驗。這些實驗技術不僅僅適用于小鼠,在其他大多數(shù)生命科學的研究中都被廣泛使用著,因此本文不作詳細介紹。但是由于小鼠有其自身的特性,所以這一類實驗應用有其自身獨特的價值。例如小鼠的近交系通常都是高癌系,可以用于進行自發(fā)癌癥的研究;而小鼠的生活周期短,也便于進行老化研究。這類實驗由于都是自然發(fā)生的表型,所以其結果的可信度較高。只是進行分析研究時較為復雜,并需要大量的小鼠以獲得足夠的樣本。這恰恰就是小鼠相對于其他哺乳動物的優(yōu)勢所在。第二大類的實驗應用根據(jù)對小鼠施加的外界影響分為兩種,一種是非生物源性的,另一種是生物源性的。非生物源性的外界影響包括了輻射、毒素等各種環(huán)境因素以及各種化學合成藥品。在這些實驗當中,將小鼠暴露在特定環(huán)境中。然后通過小鼠對這些刺激的反應,可以研究動物如何抵抗不利環(huán)境的作用,及不利環(huán)境下動物受到什么傷害。這些結果將有助于提高人類自身對不利環(huán)境的抵抗,同時也可以利用小鼠的反應將其作為環(huán)境檢測的實驗對象。另一方面的應用是新的藥物及治療方案的安全性和有效性測試,這類生物源性的外界刺激包括了蛋白質、激素等試劑的注射以及細胞、組織移植等。注射各種生物制劑的目的和注射化學合成藥品的目的相仿,都是希望通過小鼠來研究這些制劑的作用效果。而細胞或者組織的移植則在醫(yī)學上有較為重要的意義。小鼠便于獲取、實驗重復性好、與人類的反應性相似等特性使其成為一種較好的藥物和治療方案的測試用動物。選擇小鼠來做移植實驗有許多優(yōu)勢。近交系小鼠中由于個體之間的遺傳背景基本相同,所以同品系的異體移植的組織排異反應十分輕微,為研究這類技術和需要使用這項技術的研究提供了便利。而且小鼠中免疫缺陷的品系,如裸鼠等對異體移植物無排異反應,所以經(jīng)常用來做人類腫瘤細胞的轉移和生長模型的載體。由于實驗用小鼠是小家鼠來源,具有與人類基本相近一致的居住環(huán)境適應性,所以易感病原體在很大程度上和人類相同,因而小鼠對許多種類傳染病的研究也非常重要。第三大類是經(jīng)典的小鼠突變模型大多是通過對自發(fā)突變的篩選與培育得到的,但是小鼠發(fā)生自然突變的概率大約只有20萬分之一,所以期待運用自然突變進行飽和突變篩選完全不可能實現(xiàn)。在眾多科學家的努力下,小鼠基因組改造技術已經(jīng)非常成熟,成為功能基因組研究的最主要手段之一。證明一個特定基因的在某個器官或發(fā)育過程中的功能不外乎要給出三個證據(jù):首先,要確證該基因在此器官或發(fā)育過程中特異性表達;其次,證明運用分子生物學手段“剔除”或“敲落”該基因導致器官功能或發(fā)育調控的異常;最后,改變該基因的表達特異性也可能導致器官功能或發(fā)育調控的異常。前一個問題涉及RNA和蛋白水平的分析,而后兩個證據(jù)則主要依賴于基因剔除和轉基因的手段。運用基因組改造技術建立起來的疾病模型,不僅僅對生物醫(yī)學的基礎研究至關重要,而且對發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標、新藥篩選等有重大意義。目前基因組改造技術又可以分為三類:一是通過物理或化學方法在小鼠生殖細胞DNA中隨機誘導單個或多個堿基的突變形成,然后通過與野生型小鼠交配,將突變傳給后代;二是通過ES細胞或受精卵原核顯微注射,在基因組中隨機插入特定的堿基序列,轉基因技術、“基因陷阱”技術及轉座子技術可以歸到此類;三是在基因組的特定位置插入或者刪除特定的堿基序列,即基因定位突變,基因剔除(knock-out)和基因敲入(knock-in)屬于此類。第一類技術中又可以分為輻射誘變和用化學藥品誘變兩種。這兩種方法在制造突變體上的應用都已經(jīng)有很久的歷史,果蠅突變體的篩選最初就是使用X射線誘變的方法來實現(xiàn)的。一般來說,小鼠配子基因組中輻射誘變的概率是2000到8000細胞中有一個基因會發(fā)生突變,常規(guī)化學藥品誘變的概率與輻射誘變概率差不多。但由于小鼠的生殖能力并沒有果蠅那么強,所以用輻射誘變和如苯丁酸氮芥(chlorambucil)等常規(guī)化學藥品的效率相對于小鼠來說是比較低的,也較難實現(xiàn)。目前小鼠誘變研究中主要使用突變劑是Ethylnitrosourea(ENU)。ENU主要誘導產生點突變,誘導效率為每700個后代中就有1個基因發(fā)生突變。由于ENU的高效性、突變隨機性好、方法相對簡單,加上人類遺傳疾病大多由點突變造成,因而目前ENU誘變仍是建立疾病模型的一個重要途徑,受到許多實驗室青睞。但是,這一方法獲得的突變小鼠由于突變位點沒有標志,后期的突變基因染色體定位需要花費較多時間。第二類技術是利用ES細胞或受精卵有絲分裂時會發(fā)生外源DNA整合進基因組的現(xiàn)象導入外源基因或DNA片段。當有意識將表達載體插入基因組時,外源基因會在特定啟動子的作用下在特定組織或器官表達,我們稱此外源基因為“轉基因”。由于“轉基因”是隨機插入基因組,有5%~10%的機會“轉基因”將插入功能基因結構區(qū),導致基因突變。借助相似思路,基因陷阱(genetrap)就是將一個不完整的表達載體插入基因組,和基因組結構整合形成新的基因表達單元?；蛳葳灏ㄔ鰪娮酉葳?enhancertrap)、啟動子陷阱(promotertrap)和基因陷阱等,通過這些方法插入的報告基因(如β-半乳糖苷酶LacZ,綠色熒光蛋白GFP等)的表達情況,可以提供增強子、啟動子和基因的相關表達信息。同時,插入片段破壞基因產生的異常表型,又反映了該基因的功能。由于這種方法在突變位點引進了特定DNA分子標志,所以突變基因可以通過簡單的分子生物學分析迅速找到。但是,由于DNA分子體積大,在基因組上的插入有“熱點”和“冷點”,一般認為基因陷阱不能用于飽和誘變[11~12]。第三類技術利用了ES細胞內DNA的同源重組過程,導入的DNA片斷上含有與基因組某段序列相同的堿基序列。這些序列會與基因組上的相同序列發(fā)生同源重組后,結果導致兩段DNA同源臂之間的序列發(fā)生了置換。雖然同源重組的概率只有百萬分之一,但如果在置換區(qū)帶上可篩選標記基因(如新霉素磷酸轉移酶neo,胸苷激酶TK等),我們可以特異性篩選重組取代原有基因序列的細胞克隆,實驗的結果通?？梢垣@得幾乎100%的基因突變后代。這種方法的實際應用有兩種形式:一是序列置換導致基因的失活,這被稱為基因打靶或是基因剔除;二是取代的序列中只引進特定突變(特別是點突變),這被稱為基因敲入?；蚯贸悄壳把芯磕撤N基因功能最直接的方法,到2002年6月已報道的基因敲除小鼠品系已達到了3000種以上。在進化過程中,同一基因常常在不同的發(fā)育階段及不同的器官發(fā)揮不同的功能,這也是人類僅有3萬個基因但能控制高度有序的復雜結構模式及穩(wěn)態(tài)的基礎。另一方面,腫瘤等復雜疾病的主要發(fā)病機制是發(fā)生于不同組織與器官的體細胞突變。因此,要真正闡明基因在特定組織的功能,真實模擬特定腫瘤突變,建立合適的疾病模型,必須采用組織特異性基因剔除小鼠的方法。目前建立組織特異性基因剔除小鼠的方法是首先通過同源重組建立基因“flox”小鼠和通過受精卵原核注射建立組織特異性表達Cre重組酶的轉基因小鼠?！癴lox”小鼠基因組中靶基因的編碼區(qū)兩端通過同源重組插入了可被Cre重組酶識別的LoxP位點。在沒有Cre表達時,該基因的表達和功能不受影響。但是,在表達Cre的細胞內,Cre將刪除兩個LoxP位點之間的序列,從而導致該基因在此細胞內失活。所以,通過“flox”的小鼠與組織特異性表達Cre轉基因小鼠的交配,可以得到在特定組織剔除該基因的小鼠模型?；蚬δ艿难芯靠梢栽谌齻€層次展開,分子層次主要從結構域和位點分析到分子間相互作用,細胞層次研究探討細胞分化、增殖、凋亡等行為的機制。但是,對于復雜生物,特別是包括人類在內的脊椎動物,整體動物研究層次才能徹底和全面的闡明基因的生理功能及其在疾病發(fā)生過程中的作用。以血糖的穩(wěn)態(tài)調控為例,多個器官和基因的相互作用只有在整體水平才能得以說明。胰島素、瘦素和GLP1等關鍵內分泌分子的靶器官包括肝臟、肌肉、大腦等多個組織,其分泌和代謝過程也涉及多器官和細胞類型,因此其作用的效果只有在整體動物水平才能得到系統(tǒng)說明。通過在特定組織剔除特定基因,分析其對整體動物生理生化過程的影響,是最準確、也是最明確的基因功能研究手段。目前,只有小鼠具有成熟的基因剔除技術,充分反映了小鼠在基因改造領域的得天獨厚的優(yōu)勢。4小鼠基因組改造技術的應用現(xiàn)狀由于種種原因,我國小鼠基因組改造相關工作研究起步晚、規(guī)模小,制約了我國功能基因組研究,相關疾病的動物模型研究也因此成為致病機理研究和生物醫(yī)藥研究開發(fā)的瓶頸。但近年來,在國家科技部、國家自然科學基金委員會、中國科學院及有關地方政府的資助下,我國科技工作者利用多種模式生物開展了生物技術、基因識別、基因表達譜、基因功能、個體發(fā)育、疾病發(fā)病機制及藥理、毒理方面的研究,取得了一系列重要科研成果。2001年,科技部啟動了“十五”攻關重點項目“國家遺傳工程小鼠資源庫的建立”,該項目于2005年順利結題。資源庫建立了完善的轉基因、基因剔除和化學誘變等小鼠基因組改造技術服務平臺,三年多來已為國內外研發(fā)機構建立了遺傳工程小鼠品系100余種,其中基因剔除品系30余種,這些小鼠品系中包括糖