中藥揮發(fā)油對馬錢子總堿體外經(jīng)皮滲透的影響

中藥揮發(fā)油對馬錢子總堿體外經(jīng)皮滲透的影響

馬金子堿的主要成分是馬金子堿和科學(xué)家的寧，以及馬金子堿和一些馬金子堿的寧氧化物。它來自馬金錢子（也被稱為番禺區(qū)龜）。這是馬金科植物的主要成分。它具有改善微循環(huán)、增加血流量、抑制腫瘤、疼痛、抗炎、抑菌等功能?？捎糜谥委熌X癱、面癱、癌癥疼痛、坐骨神經(jīng)痛、頸椎病、關(guān)節(jié)炎等。馬錢子堿和士的寧具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用,但口服不良反應(yīng)大,治療劑量接近中毒劑量,通常以外用為主。但傳統(tǒng)外用制劑生物利用度低,且不利于精確控制給藥劑量與給藥時間,以達(dá)到平穩(wěn)安全的有效血藥濃度。透皮給藥系統(tǒng)是治療長期性與慢性疾病的簡單、方便和行之有效的第三代新型制劑。為了得到效果好、不良反應(yīng)小的天然滲透促滲劑,本實驗選擇砂仁、草果和白豆蔻揮發(fā)油作為促滲劑,研究其在馬錢子總堿透皮貼片中的促滲作用。前期研究結(jié)果表明三者對士的寧具有較好的促滲作用。馬錢子堿和士的寧是馬錢子總堿透皮貼片的主要藥效成分,并能相互促進(jìn)吸收,因此本實驗選擇二者作為共同檢測指標(biāo),考察了不同質(zhì)量濃度的砂仁、草果、白豆蔻揮發(fā)油對馬錢子總堿貼片中馬錢子總堿(以馬錢子堿和士的寧計)的體外經(jīng)皮滲透的影響,并以促滲劑氮酮進(jìn)行陽性對照觀察,為改進(jìn)傳統(tǒng)膏劑,提高馬錢子總堿的生物利用度,控制其釋藥速率以減少毒性,提高療效提供實驗依據(jù)。經(jīng)本研究提取精制的馬錢子總堿制成貼片,給藥方便,并可控制其釋藥速率。1藥品、試劑與儀器TK.12B型透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司);Agilent1100Series高效液相色譜儀(美國Agilent公司,DAD檢測器);KudosSK3300LH超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);SartoriusBT25S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,d=0.01mg]。馬錢子總堿(自制,經(jīng)HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù),馬錢子堿為34.67%、士的寧為55.20%,馬錢子總堿為89.87%);馬錢子堿對照品(20mg/支,質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.9%以上,批號110706-200505,中國藥品生物制品檢定所);士的寧對照品(20mg/支,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%以上,批號110705-200306,中國藥品生物制品檢定所)。馬錢為馬錢科植物馬錢Strychnosnux-vomicaL.的干燥成熟種子,砂仁為姜科植物綠殼砂AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen的干燥成熟果實;草果為姜科豆蔻屬植物草果Amomumtsao-koCrevostetLemarie的干燥成熟果實;白豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierreexGagnep.的干燥成熟果實;各藥材均購自云南綠生藥業(yè)有限公司,經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹德教授鑒定。氯化鈉、磷酸二氫鉀、丁二酸、無水乙醇等均為分析純,聚甲基丙烯酸酯E-100(德國Rhom公司生產(chǎn),批號E080301077),娃哈哈純凈水,庚烷磺酸鈉(色譜純,Biofer公司生產(chǎn),批號26547),乙腈為色譜純。昆明種小鼠由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供,(20±2)g,雌雄兼用。許可證號:SCXK(川2008-24)。2方法和結(jié)果2.1揮發(fā)油的分離和測定砂仁揮發(fā)油經(jīng)水蒸氣蒸餾后得到乳白色油狀液體,冷卻后底部為白色結(jié)晶,收率2.93%(mL/g);草果揮發(fā)油經(jīng)水蒸氣蒸餾后得到黃色油狀液體,收率1.91%(mL/g);白豆蔻揮發(fā)油經(jīng)水蒸氣蒸餾后得到白色油狀液體,收率5.7%(mL/g)。2.2馬錢子總堿透皮葉片的制備精密稱取處方量的馬錢子總堿90mg、丁二酸0.04g、聚甲基丙烯酸酯E-1000.4g,3.5mL60%乙醇攪拌溶解,混合均勻,超聲10min,在背襯層上采用流延法鋪膜,揮去溶媒后取出,表面覆蓋保護(hù)層,密封即得馬錢子總堿透皮貼片,含藥量1.8mg/cm2。同法在基質(zhì)溶解后加入3%、5%、7%、10%的3種揮發(fā)油和氮酮,可制備含不同質(zhì)量濃度揮發(fā)油和氮酮促滲劑的馬錢子總堿透皮貼片。2.3磷酸總ph值hd色譜柱為LicrospherC18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀等體積混合溶液(28∶72),用10%磷酸調(diào)pH值2.8;柱溫30℃;檢測波長260nm;體積流量為1mL/min;進(jìn)樣量5μL。在上述條件下,馬錢子堿、士的寧的保留時間在6min左右,保留時間適中,樣品峰分離度較好,以馬錢子堿和士的寧的理論塔板數(shù)計不低于6000,且基質(zhì)和揮發(fā)油對馬錢子堿和士的寧的測定無干擾,HPLC色譜圖見圖1。2.4馬錢子堿和寧的對照品溶液的配制將馬錢子堿和士的寧對照品置P2O5減壓干燥器中干燥12h以上,取馬錢子堿3mg,士的寧5mg,精密稱定,置于10mL量瓶中,適量10%磷酸溶液超聲溶解,加透皮吸收接收液(20%乙醇生理鹽水)至刻度,振搖均勻制成混合對照品儲備液。分別取母液用接收液稀釋得到1.89、3.15、6.30、15.75、31.50、63.00、126.00、252.00、315.00μg/mL的馬錢子堿對照品溶液與3.16、5.27、10.54、26.35、52.70、105.40、210.80、421.60、527.00μg/mL的士的寧對照品溶液,進(jìn)樣5μL,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),測得的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:馬錢子堿Y=6912.13X-4.22,r=0.99995;士的寧Y=9571.99X-11.52,r=0.99992;結(jié)果表明馬錢子堿在1.89~315.00μg/mL、士的寧在3.16~527.00μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。2.5方法研究2.5.1馬錢子堿和士的寧的峰面積測定取同一混合對照品溶液(馬錢子堿63.00μg/mL,士的寧105.40μg/mL),連續(xù)進(jìn)樣6次,測定馬錢子堿和士的寧的峰面積,結(jié)果馬錢子堿和士的寧的峰面積值的RSD分別為0.22%、0.12%,表明精密度良好。2.5.2馬錢子堿與士的寧在峰面積和濃度的測定取同一接收池中0.5h的馬錢子總堿透皮貼片透過液6份,分別進(jìn)樣5μL,測得馬錢子堿與士的寧的峰面積,計算得其質(zhì)量濃度的RSD分別為1.48%、0.67%。2.5.3樣品溶液相對穩(wěn)定性試驗取同一個皮膚透過液的樣品溶液分別于0、1、2、4、6、8、12h測得馬錢子堿與士的寧的峰面積,結(jié)果馬錢子堿和士的寧峰面積的RSD分別為1.73%、0.60%,表明樣品溶液在12h內(nèi)相對穩(wěn)定。2.5.4加樣回收率和加樣回收率在已知質(zhì)量濃度的低、中、高3個質(zhì)量濃度樣品皮膚透過液中加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的馬錢子堿和士的寧對照品溶液,每個質(zhì)量濃度樣品3份,3個質(zhì)量濃度共9個供試品,測定質(zhì)量濃度,計算回收率,結(jié)果馬錢子堿低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為104.86%、104.15%、101.84%,RSD分別為為0.47%、0.28%、0.77%;士的寧低、中、高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為100.88%、101.75%、99.61%,RSD分別為0.98%、0.29%、0.34%。2.6皮膚組織病理學(xué)觀察將小鼠腹部皮膚仔細(xì)剃毛,斷頸處死,立即取腹部皮膚,去掉皮下脂肪及黏液組織,用生理鹽水洗凈、浸泡,-40℃冷凍保存,實驗前自然解凍,1周內(nèi)進(jìn)行實驗。2.7透皮接收池的制備剪取略大于擴散池表面積的皮膚角質(zhì)層,置于Franz擴散池的供給池與接收池結(jié)合處,使角質(zhì)層面向供給池,用彈簧夾固定,有效擴散面積為2.92cm2,接收池體積7mL,將含不同質(zhì)量濃度促滲劑的馬錢子總堿透皮貼片覆于皮膚角質(zhì)層表面,使藥物與鼠皮充分接觸,在透皮接收池中放入磁力攪拌子并注滿20%乙醇生理鹽水,并將接收池固定于磁力攪拌器上并置于37℃恒溫水浴中,開啟恒溫磁力攪拌器,轉(zhuǎn)速為300r/min。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12h吸取接收液,同時補充等量等溫接收液,并排除接收室中的氣泡。將取出接收液用0.45μm的微孔濾膜濾過,冷至室溫,HPLC法測定。2.8滲透系數(shù)法測定qn根據(jù)下式求得累積滲透量(Qn)。Cn為第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度,Ci為第i個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度以Qn對時間t作圖,藥物滲透達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,其中直線部分的斜率為藥物的透皮速率常數(shù),即穩(wěn)態(tài)滲透速率常數(shù)(JSS),藥物的滲透系數(shù)(KP)=JSS/C(C為供給池的藥物質(zhì)量濃度),增滲倍數(shù)(ER)=KP/KP0(KP為加促滲劑后藥物的滲透系數(shù),KP0為藥物固有的滲透系數(shù))。將測定結(jié)果代入回歸方程,計算不同時間點的Qn。由圖2可知馬錢子堿和士的寧Qn的增加都是同向增加,且士的寧的JSS是馬錢子堿的2倍,與文獻(xiàn)報道相符,為方便計算,優(yōu)選揮發(fā)油促滲劑,馬錢子總堿Qn采用馬錢子堿和士的寧Qn之和,即Q總堿=Q馬錢子堿+Q士的寧表示。2.9qn對qn的促透效果由圖2-C可知,12h的Q1210%氮酮>陰性對照>7%氮酮>3%氮酮>5%氮酮。10%氮酮對馬錢子總堿有一定的促透效果,其他質(zhì)量濃度的氮酮對馬錢子總堿無促透效果,由Qn-t1/2曲線圖可知6h(2.45h1/2)后Qn增加趨于平緩,因此選擇前6h的數(shù)據(jù)進(jìn)行JSS與ER的計算,結(jié)果見表1。綜上所述,選擇10%氮酮為陽性促滲劑。2.10砂油質(zhì)量濃度對馬錢子總堿的促透效果由圖3可知,12h的Q1210%砂仁油>3%砂仁油>5%砂仁油>陽性對照>7%砂仁油>陰性對照,說明砂仁油的各個質(zhì)量濃度對馬錢子總堿都有一定的促透效果,4h后Qn增加趨于平緩,因此選擇了Qn-t1/2曲線的直線部分前4h的數(shù)據(jù)進(jìn)行JSS與ER的計算。綜合表2可知,5%砂仁油的JSS及ER均大于10%砂仁油及陽性對照,因此,5%砂仁油促透效果相對最好。2.11不同質(zhì)量濃度的蘋果油對馬錢子總堿的促透效果由圖4可知,12h的Q12陽性對照>3%草果油>5%草果油>陰性對照>7%草果油>10%草果油,說明3%、5%草果油對馬錢子總堿均有一定促透效果,其他質(zhì)量濃度對馬錢子總堿無促透效果。8h(2.83h1/2)后Qn增加趨于平緩,因此選擇了Qn-t1/2曲線的直線部分前8h的數(shù)據(jù)進(jìn)行JSS與ER的計算,從表3數(shù)值上看,3%草果油的促透效果相對最好。2.12%白豆不同質(zhì)量濃度對馬錢子總堿的促透效果由圖5可知,12h的Q12陽性對照>10%白豆蔻油>5%白豆蔻油>3%白豆蔻油>陰性對照>7%白豆蔻油,說明7%白豆蔻油對馬錢子總堿無促透效果,其他質(zhì)量濃度對馬錢子總堿有一定的促透效果。6h(2.45h1/2)后Qn增加趨于平緩,因此選擇了Qn-t1/2曲線的直線部分前6h的數(shù)據(jù)進(jìn)行JSS與ER的計算,從表4數(shù)值上看,10%白豆蔻油的促透效果相對最好。3最佳透皮吸收促進(jìn)劑的篩選本實驗參考文獻(xiàn)方法用0.01mol/L庚烷磺酸鈉與0.02mol/L磷酸二氫鉀的等體積混合溶液(用10%磷酸調(diào)節(jié)pH值2.8)-乙腈不同比例的溶液為流動相進(jìn)行分離,當(dāng)配比為72∶28時分離效果較佳,馬錢子堿及士的寧色譜峰與其他峰可達(dá)到基線分離,且保留時間在6min左右,揮發(fā)油及氮酮對馬錢子堿與士的寧的定量測定無干擾,并確定為最后的流動相。本實驗參考文獻(xiàn)方法,馬錢子堿在PBS中的溶解度(1.988±0.032)mg/mL遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于士的寧的(0.292±0.003)mg/mL,士的寧的溶解度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加,為了增加士的寧的溶解度以達(dá)到漏槽狀態(tài),實驗在生理氯化鈉溶液中加入了20%乙醇,因此本實驗接收液選擇含20%乙醇的生理氯化鈉溶液。最佳氮酮質(zhì)量濃度篩選中,結(jié)合本課題組前期士的寧溶液體外經(jīng)皮滲透研究,1%、3%、5%、7%氮酮促透效果與10%氮酮促透效果不同,促透效果1%氮酮小于10%氮酮,本實驗中促透效果10%氮酮>7%氮酮>3%氮酮>5%氮酮。在有關(guān)經(jīng)皮給藥的制劑研究中,如何確保足夠量的藥物透過皮膚進(jìn)入人體內(nèi)以達(dá)到有效的血藥濃度是其中的關(guān)鍵。促進(jìn)藥物透皮吸收的方法很多,選擇理想的透皮促滲劑較為常見。氮酮是公認(rèn)的高效無毒的透皮吸收促進(jìn)劑,本實驗以氮酮為陽性對照,旨在優(yōu)選出更好的透皮吸收促滲劑。揮發(fā)油為天然促滲劑,其本身具有起效快、效果好、副作用小、無