第16章 反義核酸類(lèi)藥物

反義藥物主要內(nèi)容一、反義核酸與反義技術(shù)反義核酸和反義技術(shù)概念反義核酸的基本原理反義核酸的種類(lèi)反義核酸與反義技術(shù)的應(yīng)用反義核酸和反義技術(shù)反義核酸(antisensenucleicacid)

是一段與靶基因的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列

它可通過(guò)堿基配對(duì)與細(xì)胞內(nèi)核酸特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易修飾、選擇性高、親和力高等特點(diǎn)反義核酸技術(shù)（antisensenucleicacidstechnology)

是根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計(jì)的，以選擇性地抑制特定基因表達(dá)為目的的一類(lèi)核酸研究新技術(shù)

包括反義RNA(asRNA)、反義DNA(asDNA)、核酶(Rz)反義核酸的基本原理絕大多數(shù)DNA由兩條堿基互補(bǔ)的單鏈組成，生物信息以核苷酸不同排列順序編碼在DNA鏈上，基因組形成單順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)在DNA雙鏈上被轉(zhuǎn)錄為RNA的鏈為正義鏈，與其相對(duì)應(yīng)的鏈為反義鏈精心設(shè)計(jì)一段寡核苷酸與正義鏈互補(bǔ)，一般由7到30個(gè)核苷酸組成，將會(huì)阻斷基因轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒑蟹戳x序列的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，干擾特定基因表達(dá)利用這一原理可以在基因位點(diǎn)、前體mRNA、mRNA及蛋白水平，通過(guò)干擾特定基因功能限制細(xì)胞增殖、分化和凋亡反義基因治療

DNADNA

RNARNA

反義RNA

阻斷表達(dá)利用人工合成的反義RNA或DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，控制細(xì)胞的中間階段使編碼蛋白的基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA或阻斷翻譯相應(yīng)蛋白反義技術(shù)的兩種技術(shù)路線(xiàn)將表達(dá)與體內(nèi)基因或mRNA互補(bǔ)序列的基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的mRNA，從而阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)體外合成mRNA互補(bǔ)的核苷酸類(lèi)似物，通過(guò)靜脈注射等途徑進(jìn)入細(xì)胞，特異性地與目標(biāo)mRNA作用以第二種為主來(lái)介紹反義核酸的種類(lèi)反義RNA：一類(lèi)能與特異mRNA互補(bǔ)的小分子質(zhì)量的、可擴(kuò)散的DNA轉(zhuǎn)錄物，能夠從翻譯、轉(zhuǎn)錄和核酸復(fù)制水平上高度特異地抑制靶基因表達(dá)反義DNA：人工合成一小段反義寡核苷酸，與DNA或mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合，封閉靶基因表達(dá)（ASODN）

理論上認(rèn)為寡核苷酸與其意義鏈互補(bǔ)，會(huì)象“封條”一樣，阻斷mRNA拼接、轉(zhuǎn)錄、翻譯，下調(diào)特定基因表達(dá)反義RNA的作用機(jī)制作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū)，阻止mRNA前體的剪接反義RNA與DNA結(jié)合時(shí)能阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而阻止特定基因的轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)于特定mRNA的非編碼區(qū)，如SD序列或核糖體結(jié)合位點(diǎn)及其上游區(qū)，影響核糖體結(jié)合，從而抑制翻譯互補(bǔ)于特定mRNA的編碼區(qū)，抑制翻譯或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子結(jié)構(gòu)形成，影響mRNA的成熟作用于PoIyA形成位點(diǎn)，阻止靶mRNA成熟及向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)反義RNA的作用機(jī)制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA反義RNA的獲得途徑化學(xué)合成法：利用核酸合成儀直接合成反義RNA體外轉(zhuǎn)錄法：利用帶有噬菌體SP6或T7等啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，將特異基因的DNA片段反向插入其多克隆位點(diǎn)中，在RNA聚合酶的作用下體外合成特異性反義RNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄法：利用基因重組技術(shù)，在適宜啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間反向插人一段靶基因，人工構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體(病毒表達(dá)載體或質(zhì)粒表達(dá)載體)，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞并使之在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)反義RNA反義RNA的臨床作用抗病毒：將特定的病毒基因反向插入到表達(dá)性載體中，以構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體再將重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞(病毒宿主細(xì)胞)中表達(dá)特異性反義RNA從而抑制特異有害基因的表達(dá)或抑制病毒復(fù)制（皰疹病毒、流感病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒）抗腫瘤：設(shè)計(jì)出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的癌基因、突變基因、非正常表達(dá)基因及某些腫瘤相關(guān)病毒的癌基因反義RNA以阻斷這些有害基因的表達(dá)，達(dá)到治療腫瘤的目的ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反義技術(shù)與反義核酸的應(yīng)用治療方法

根據(jù)已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA

相應(yīng)的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達(dá)的mRNA的起始翻譯位

點(diǎn)結(jié)合成RNA/RNA雙鏈體

雙鏈體阻止啟動(dòng)子與核糖體結(jié)合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯反義RNA的應(yīng)用（一）治療方法

根據(jù)已知癌基因的核苷酸序列合成反義RNA

相應(yīng)的反義寡聚核苷酸與腫瘤癌基因活化表達(dá)的mRNA的起始翻譯位

點(diǎn)結(jié)合成RNA/RNA雙鏈體

雙鏈體阻止啟動(dòng)子與核糖體結(jié)合，或核糖體沿mRNA上移，抑制翻譯反義RNA的應(yīng)用（一）

反義RNA的應(yīng)用（二）

反義RNA的應(yīng)用（二）

反義RNA的應(yīng)用（二）抗HIV-l的作用：從翻譯水平封閉基因表達(dá)，并干擾mRNA的剪切、加工而實(shí)現(xiàn)抗病毒作用tat為HIV-l重要的調(diào)節(jié)基因，編碼反式激活因子Tat蛋白在逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子LTR之后連接反義tat與多聚TAR的構(gòu)建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反義tat及TAR誘餌的雙重作用由于LTR啟動(dòng)子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的細(xì)胞中得以高表達(dá)將這種外源基因?qū)隡olt-3T細(xì)胞系、CEM-SST細(xì)胞系及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，對(duì)實(shí)驗(yàn)及臨床分離病毒株均有抑制作用

反義RNA的應(yīng)用（二）gag是HIV-1的結(jié)構(gòu)基因，編碼p24等病毒結(jié)構(gòu)蛋