響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)-葡萄糖苷酶發(fā)酵工藝

響應(yīng)面法優(yōu)化米曲霉產(chǎn)-葡萄糖苷酶發(fā)酵工藝

葡萄糖水解酶（bet.-a）的名稱是d-葡萄糖水解酶，被稱為d-葡萄糖水解酶，也被稱為龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁糖酶。它屬于纖維素酶類,是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵而生成葡萄糖的酶。β-葡萄糖苷酶因其來源不同而性質(zhì)各異,在人類的糖原降解和動物、植物、微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。β-葡萄糖苷酶是米曲霉發(fā)酵產(chǎn)糖化酶中的一種。FAO/WHO/JECFA曾批準米曲霉可用于食品工業(yè)中酶制劑的生產(chǎn)。此外米曲霉是公認的安全菌株之一。用米曲霉發(fā)酵加工的產(chǎn)品對人類或動物具有一定的保健功效。因此研究米曲霉特性對于研發(fā)高質(zhì)量的產(chǎn)品有著廣泛的應(yīng)用前景。優(yōu)化發(fā)酵條件是發(fā)揮菌種生產(chǎn)能力,降低生產(chǎn)成本的主要途徑。本文采用響應(yīng)面法(RSM)研究米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝,有利于提高米曲霉的產(chǎn)酶活性,促進其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。通過Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計,模擬出最佳模型,得到最優(yōu)發(fā)酵條件,為β-葡萄糖苷酶工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供試驗依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1試驗消毒1.1.2基礎(chǔ)培訓(xùn)1.1.3活塞鎖發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成:麩皮3%,(NH4)2SO40.2%,CaCl20.04%,MgSO4·7H2O0.04%。1.1.4從實驗液的制作將米曲霉3.481菌株傳代數(shù)次,使其活力恢復(fù)。用無菌水將斜面上的孢子洗下,制成1×106個/mL的孢子懸浮液。按10%接種量接到50mL/250mL三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、120r/min條件下培養(yǎng)7d后測定搖瓶中β-葡萄糖苷酶活力。1.2儀器和試劑1.2.1儀器、試藥和儀器UV-2201型紫外-可見分光光度計,日本島津公司;OPTIPHOT-2顯微鏡,NIKON公司;pHS-3C酸度計,蕭山市鑫龍儀器有限公司;LRH-150B生化培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;THz-82B氣浴恒溫振蕩器,江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;LDZX-40BI型立式自動電熱蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠。1.2.2主試劑水楊苷[D-(-)-Sallcin](99%),進口分裝;瓊脂粉,英國進口分裝;其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。1.3測試方法1.3.1酶液的制備將發(fā)酵液離心,取其上清液1mL,稀釋10倍?？瞻诇缁?加入0.5mL0.5%水楊苷(溶于0.1mol/L、pH4.8的醋酸緩沖液中),55℃保溫20min,加入1mLDNS試劑,充分混合后沸水中煮沸5min,冷卻,用蒸餾水稀釋至10mL,于540nm處測OD值。以加熱滅活(100℃、5min)的酶液按照同樣方法處理作為空白。在上述條件下定義1mL酶液1min水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶活力為1個酶活單位(U)。1.3.2單因素試驗1.3.3box-benhnken設(shè)計試驗確定影響米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的關(guān)鍵因素后,用DesignExpert軟件(Vision7.1.3,stat-Ease.Inc.,Minneapolis,MN.USA)設(shè)計試驗。采用Box-Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理,確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。本文在單因素試驗基礎(chǔ)上選取麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、pH3個對β-葡萄糖苷酶活力影響較大的因素,設(shè)計三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗,確定影響β-葡萄糖苷酶活力的重要因素間的函數(shù)關(guān)系式;同時進行響應(yīng)面優(yōu)化,確定生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基。2結(jié)果與分析2.1碳源2.1.1混合碳源對產(chǎn)酶的影響為微生物提供營養(yǎng)的碳源物質(zhì)種類非常廣,從簡單的無機物(CO2、碳酸鹽)到復(fù)雜的有機含碳化合物(糖類、糖類的衍生物、脂類、醇類、有機酸等)。本文為了降低生產(chǎn)成本,利用單一碳源,即:麩皮、玉米粉、CMC;混合碳源:麩皮+玉米粉(1∶1,W/W)、麩皮+淀粉(1∶1,W/W)、麩皮+CMC(1∶1,W/W)來研究菌株產(chǎn)酶情況。以上碳源質(zhì)量分數(shù)均為3%。試驗結(jié)果如圖1所示。通過試驗發(fā)現(xiàn)米曲霉在不同的碳源中均能正常生長,產(chǎn)β-葡萄糖苷酶,其中以麩皮+淀粉(1∶1,W/W)作為碳源時,產(chǎn)酶活力較高。2.1.2麩皮+淀粉質(zhì)量分數(shù)對產(chǎn)酶活力的影響從圖2可以看出,產(chǎn)酶活力先隨著麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)的增加而增大,當(dāng)質(zhì)量分數(shù)達到一定時又隨著其增大而減小。當(dāng)麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)為9%時產(chǎn)酶活力最高,發(fā)酵7d,β-葡萄糖苷酶活力達1.662U/mL。在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為13%、15%的麩皮+淀粉(1∶1,W/W)時,產(chǎn)酶活力之間差異不顯著,其它質(zhì)量分數(shù)的麩皮+淀粉(1∶1,W/W)之間差異顯著。2.2氮的來源2.2.1無機氮源對葡萄糖苷酶活力的影響常見的氮源種類有有機氮源和無機氮源。分別采用酵母膏、NH4Cl、草酸銨、尿素、(NH4)2SO4、蛋白胨、豆粕粉為氮源,質(zhì)量分數(shù)均為0.2%,其它成分保持不變,發(fā)酵7d后分別測定β-葡萄糖苷酶的活力,如圖3所示?？傮w來說,添加無機氮源比有機氮源效果好。當(dāng)以(NH4)2SO4和NH4Cl為氮源時,米曲霉產(chǎn)酶均較高。這可能是因為由強酸根和銨根離子組成的NH4C1和(NH4)2SO4是生理酸性鹽,隨著銨離子的消耗發(fā)酵液pH下降,而米曲霉適宜在酸性條件下生長,這一變化促進了菌株的正常生長。添加草酸銨并未使產(chǎn)酶水平得以很大提高。在添加牛肉膏、蛋白胨、尿素、豆粕粉時,融合菌種產(chǎn)酶活力與添加(NH4)2SO4時相比稍低一些,并且這幾種有機氮源價格較高,所以本試驗中選用(NH4)2SO4作為培養(yǎng)基的氮源。2.2.2葡萄糖苷酶活力測定保持其它成分不變,考察不同質(zhì)量分數(shù)(NH4)2SO4對產(chǎn)酶活力的影響。質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%時進行發(fā)酵產(chǎn)酶,7d后分別測定β-葡萄糖苷酶的活力,結(jié)果見圖4。米曲霉產(chǎn)酶活力在硫酸銨質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%和0.5%時較高,分別是1.44U/mL和1.50U/mL;當(dāng)其質(zhì)量分數(shù)大于0.5%時產(chǎn)酶活力又開始下降?？赡苁怯捎诹蛩徜@質(zhì)量分數(shù)過低遠遠不能滿足菌體生長的需要,而硫酸銨質(zhì)量分數(shù)過高則對酶的生成起阻礙作用。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)分別為0.3%、0.4%時方差分析差異不顯著;當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%、0.6%時產(chǎn)酶活力之間差異不顯著;當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%產(chǎn)酶活力差異顯著。2.3無機鹽2.3.1金屬離子對糖苷酶活力的影響以KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、KCl、NaNO3、FeSO4、CaCl2為考察對象,選用七因子二水平的正交試驗來確定米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的最適合無機鹽含量。KH2PO4和K2HPO4質(zhì)量分數(shù)均為0.1%,MgSO4、KCl、FeSO4、NaCl、NaNO3質(zhì)量分數(shù)均為0.05%。試驗結(jié)果見表1,方差分析見表2。表1試驗結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中應(yīng)添加KH2PO4、KCl、FeSO4和CaCl2。表2方差分析表明CaCl2、NaNO3對產(chǎn)酶活力的影響顯著,但添加NaNO3顯著降低產(chǎn)酶活力,其它無機鹽對產(chǎn)酶活力的影響不顯著。為了滿足菌體生長的需要,將無機鹽CaCl2和KCl添加到米曲霉產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中。2.3.2搖瓶發(fā)酵篩選在培養(yǎng)基其它成分不變的條件下,分別加入質(zhì)量分數(shù)為0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%的CaCl2,搖瓶發(fā)酵,結(jié)果如圖5所示。CaCl2的質(zhì)量分數(shù)對產(chǎn)酶活力的影響極顯著(F=14.971,P<0.0001)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%CaCl2時,它們的產(chǎn)酶活力之間差異不顯著。當(dāng)添加0.06%CaCl2時產(chǎn)酶活力較高,β-葡萄糖苷酶活力可達1.680U/mL。2.3.3kcl質(zhì)量分數(shù)對產(chǎn)酶活力的影響在培養(yǎng)基中其它成分不變的情況下,分別加入0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%KCl,搖瓶發(fā)酵,試驗結(jié)果見圖6。從圖6可以看出,KCl質(zhì)量分數(shù)對產(chǎn)酶活力的影響極顯著(F=14.971,P<0.0001)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%KCl時產(chǎn)酶活力之間差異不顯著;當(dāng)添加0.04%KCl時酶活力較高,β-葡萄糖苷酶活力可達1.632U/mL。2.4產(chǎn)酶活力的變化初始pH分別為3.0、4.0、4.29(自然pH)、5.0、6.0、7.0時做發(fā)酵試驗,結(jié)果如圖7所示。初始pH對產(chǎn)酶活力的影響極顯著(F=37.80,P<0.0001)。pH為5.0、5.5、6.5、7.0時產(chǎn)酶活力之間差異不顯著;pH分別為3.0、6.0時產(chǎn)酶活力之間差異不顯著;pH分別為4.29(自然pH)、7.0時產(chǎn)酶活力之間差異不顯著。在pH為5.0時酶活力最高,β-葡萄糖苷酶活力可達0.946U/mL,故選初始pH為5.0。2.5反應(yīng)分析與優(yōu)化基本培養(yǎng)2.5.1回歸模型的建立及方差分析根據(jù)單因素試驗結(jié)果,安排Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計。選擇對產(chǎn)酶活力影響最大的麩皮+淀粉(1:1,W/W)質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、初始pH3個因素為變量,酶活力為響應(yīng)值,其它因素值為CaCl2質(zhì)量分數(shù)0.06%和KCl質(zhì)量分數(shù)0.04%,設(shè)計三因素三水平共17個試驗點的響應(yīng)面分析試驗,其因素水平選取見表3,試驗方案及結(jié)果見表4。利用DesignExpert軟件對表4數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合,獲得米曲霉3.481產(chǎn)酶活力對麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)及培養(yǎng)基初始pH的二次多項回歸方程:對此回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表5。該模型顯著(p<0.0098),失擬項在a=0.1水平上不顯著(p=0.17>0.1),模型的校正系數(shù)Radj2=0.7640,表明該模型能夠解釋米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力響應(yīng)值的變化。該模型與實際情況擬合很好,可用于預(yù)測米曲霉3.481產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的情況。由回歸方程各項方差分析表明,麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對酶活力影響極顯著,而培養(yǎng)基初始pH對酶活力影響不顯著;麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)、pH三者之間的交互作用對酶活力影響極顯著。2.5.2最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的確定利用DesignExpert軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合,得到二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖8~圖10。由圖8可知,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH5.0時,麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)與硫酸銨質(zhì)量分數(shù)兩個因素之間的交互作用明顯,酶活力均隨麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)的增加和硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的減小而增加。從趨勢上看,在試驗范圍內(nèi)增加麩皮+淀粉(1∶1,W/W)的質(zhì)量分數(shù)比減小硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)更有效。當(dāng)麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)為11%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為0.4%時,酶活力達到最大。從圖9可知,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%硫酸銨時,酶活力隨麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)的增大、pH的減小而提高;麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)與初始pH值兩個因素之間的交互作用效果顯著,提高麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)比降低pH對酶活力的影響更有效;pH4.5、麩皮+淀粉(1∶1,W/W)質(zhì)量分數(shù)為11%時,酶活力較高。由圖10可知,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加9%麩皮+淀粉(1∶1,W/W),隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的減小和初始pH的增加酶活力逐漸增大。硫酸銨質(zhì)量分數(shù)與初始pH兩個因素之間的交互作用明顯。從趨勢上看,降低硫酸銨質(zhì)量分數(shù)比增加pH對酶活力的影響更有效。當(dāng)初始pH5.5、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)為0.4%時,酶活力較高。利用DesignExpert軟件進行優(yōu)化獲得1組最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,其組成為:麩皮+淀粉(1∶1,WW)質(zhì)量分數(shù)10.93%、硫酸銨質(zhì)量分數(shù)0.4%、CaCl2質(zhì)量分數(shù)0.06%、KCl質(zhì)量分數(shù)0.04%,pH5.0。預(yù)測β-葡萄糖苷酶活力為1.93U/mL。2.5.3最佳培養(yǎng)基的確定以響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組成進行發(fā)酵試驗,7d后得到的酶活力為1.89U/mL,與模型計算值相差0.04%,從而證明用響應(yīng)面法來尋求最佳培養(yǎng)基是可行的,酶活力比以前有較大地提高。3最優(yōu)培養(yǎng)基的確定通過單因素試驗確定米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶所需最佳碳源為麩皮+淀粉(1∶1,W/W),氮源為硫酸銨,無機鹽為CaCl2和KCl,初始pH5.0。通過響應(yīng)面分析方法確定米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷