第14章 急性毒性試驗(yàn)

第十四章

急性毒性試驗(yàn)

Acutetoxicitytest

2023/10/161第一節(jié)

概念和意義一、基本概念急性毒性：指24小時(shí)內(nèi)單次或多次大劑量給予某藥物所出現(xiàn)的有害作用，亦即指機(jī)體（人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物）一次性大劑量接受某種藥物后所產(chǎn)生的快速而劇烈的中毒反應(yīng)，包括一般行為和外觀改變、大體改變以及死亡效應(yīng)。急性毒性試驗(yàn)：以觀察急性毒性為目的而設(shè)計(jì)的一種毒理學(xué)試驗(yàn)，急性毒性試驗(yàn)以闡明藥物的劑量-毒效關(guān)系為出發(fā)點(diǎn)，為全面毒性試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。2023/10/162第一節(jié)

概念和意義急性毒性試驗(yàn)的內(nèi)容定性—毒性反應(yīng)的類型、出現(xiàn)和消失時(shí)間、可能的靶器官和死亡原因等；定量—致死量、最大給藥量、半數(shù)致死量等。急性毒性試驗(yàn)的目的和意義測(cè)定藥物的LD50及相關(guān)參數(shù)，初步估計(jì)該藥物的毒性大小；觀察藥物的急性中毒癥狀，推測(cè)藥物毒性靶器官為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)提供劑量設(shè)計(jì)參考一、基本概念2023/10/163急性毒性試驗(yàn)是臨床前新藥安全性評(píng)價(jià)的第一步，與其它毒性試驗(yàn)相比具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易行等特點(diǎn)。因此新藥研究開發(fā)時(shí)往往通過(guò)該項(xiàng)試驗(yàn)，盡可能多的了解一些新藥的毒理學(xué)特點(diǎn)，為早期判斷侯選新藥是否具有研究開發(fā)價(jià)值提供毒性強(qiáng)度資料。第一節(jié)

概念和意義2023/10/164第一節(jié)

概念和意義急性毒性試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)了藥理學(xué)與毒理學(xué)最基本的要素—?jiǎng)┝康脑黾映０殡S著反應(yīng)程度（或死亡率）的增加，如以藥物劑量對(duì)死亡率作圖，則可以得到劑量-反應(yīng)（死亡率）關(guān)系曲線。常見的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線有三種形式：S形曲線拋物線直線2023/10/165二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理LD50的概念

能引起一群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50%死亡所需的劑量,或者說(shuō)是某藥物于一次性給予一群動(dòng)物后預(yù)期引起50%死亡的、經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)演算得出的一個(gè)劑量，是一個(gè)有置信限估計(jì)的中介值,是反映藥物毒效應(yīng)的上限指標(biāo)。第一節(jié)

概念和意義2023/10/166二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理LD50

值的作用及意義LD50是藥物的重要特征性參數(shù)之一，是藥物及一切與人類接觸物質(zhì)的安全標(biāo)尺，用來(lái)判斷藥物對(duì)機(jī)體的毒性程度。有助于計(jì)算其它與LD50相關(guān)的毒性參數(shù)。

急性毒性作用帶（Zac）；治療指數(shù)（LD50/ED50）；安全指數(shù)（LD5/ED5）；可靠安全系數(shù)（LD1/ED1）；第一節(jié)

概念和意義2023/10/167急性毒作用帶（Zac）=半數(shù)致死量(LD50)急性毒性最小有作用劑量(Limac)

1.急性毒作用帶：以藥物的半數(shù)致死量與急性毒性最小有作用劑量(閾劑量)的比值來(lái)表示（是藥物毒性上限指標(biāo)與下限指標(biāo)的比值）。(1)急性毒作用帶

急性毒作用帶的大小反應(yīng)了急性閾劑量與LD50

距離的寬窄，其比值越大，說(shuō)明從急性閾劑量到死亡劑量的距離越寬，藥物引起死亡的危險(xiǎn)性就越?。槐戎翟叫?，則引起死亡的危險(xiǎn)性就越大。2023/10/168TI=半數(shù)致死量（LD50）半數(shù)有效量（ED50）治療指數(shù)（Therapeuticindex,TI）是指半數(shù)致死量與半數(shù)有效量之比值。（2）治療指數(shù)

TI值越大,表示該藥物在發(fā)揮其治療作用時(shí)所承擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)（危險(xiǎn)性）越小,一般認(rèn)為TI大于3的藥物才可能具有實(shí)用意義。目前用于臨床的藥物,其TI值大多大于10。2023/10/169SI=LD5ED95

安全指數(shù)（Safetyindex，SI）是指基本無(wú)害量與基本有效量之比值。（2）安全指數(shù)

SI值可以說(shuō)明藥物的臨床安全性，但該值往往難以精確計(jì)算出來(lái)，測(cè)定誤差很大。2023/10/1610CSF=LD1ED99

可靠安全系數(shù)（Certainsafety

factor，CSF）是指肯定無(wú)害量與肯定有效量之比值。（2）可靠安全系數(shù)

CSF

值可以說(shuō)明藥物的臨床安全性，CSF越大，越安全。2023/10/1611二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理LD50

值的作用及意義LD50是藥物的重要特征性參數(shù)之一，是藥物及一切與人類接觸物質(zhì)的安全標(biāo)尺，用來(lái)判斷藥物對(duì)機(jī)體的毒性程度。有助于計(jì)算其它與LD50相關(guān)的毒性參數(shù)藥物急性毒性分級(jí)依據(jù)第一節(jié)

概念和意義2023/10/1612毒性分級(jí)大鼠一次經(jīng)口LD50(mg·kg體重-1)6只大鼠吸入4小時(shí),死亡2-4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg·kg體重-1)對(duì)人可能致死的估計(jì)量g·kg體重-1g·60kg體重-1劇毒﹤1﹤10﹤5﹤0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250微毒5000~10000~2180~﹥15﹥1000表14-1化學(xué)異物急性毒性分級(jí)（WHO）

小鼠LD50（mg/kg體重）口服皮下注射靜脈或腹腔注射毒藥﹤30﹤20﹤10劇藥﹤300﹤200﹤100普通藥﹥300﹥200﹥100表14-2毒、劇藥按LD50值的劃分2023/10/1613二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理LD50

值的作用及意義LD50是藥物的重要特征性參數(shù)之一，是藥物及一切與人類接觸物質(zhì)的安全標(biāo)尺，用來(lái)判斷藥物對(duì)機(jī)體的毒性程度。有助于計(jì)算其它與LD50相關(guān)的毒性參數(shù)藥物急性毒性分級(jí)依據(jù)為毒效應(yīng)的靶器官確定和機(jī)制分析提供線索第一節(jié)

概念和意義2023/10/1614二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理LD50

值的作用及意義LD50是藥物的重要特征性參數(shù)，是藥物及一切與人類接觸物質(zhì)的安全標(biāo)尺，用來(lái)判斷藥物對(duì)機(jī)體的毒性程度有助于計(jì)算其它與LD50相關(guān)的毒性參數(shù)藥物急性毒性分級(jí)依據(jù)為毒效應(yīng)的靶器官確定和機(jī)制分析提供線索作為藥物生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)措施第一節(jié)

概念和意義2023/10/1615二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)LD50

及相關(guān)參數(shù)的評(píng)價(jià)

LD50

絕非判斷藥物急性毒性作用的惟一指標(biāo)，僅是一個(gè)為描述某一藥物在某個(gè)特殊的群體中以致死反應(yīng)為指標(biāo)而設(shè)計(jì)的一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)，是許多反映藥物急性毒性的參數(shù)之一。

急性毒性作用具有比LD50更為深刻的內(nèi)涵，劑量-效應(yīng)（死亡）曲線的斜率在評(píng)價(jià)藥物的急性毒性中比LD50

更有價(jià)值甚至更為關(guān)鍵。第一節(jié)

概念和意義2023/10/1616反應(yīng)是指藥物與機(jī)體接觸后引起的生物學(xué)改變。量反應(yīng)屬于計(jì)量資料，有強(qiáng)度和性質(zhì)的差別，可以某種測(cè)量數(shù)值表示，如藥物引起血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的升高，這類效應(yīng)稱為量反應(yīng)。質(zhì)反應(yīng)屬于計(jì)數(shù)資料，沒有強(qiáng)度的差別，不能以具體的數(shù)值表示，而只能以“陰性或陽(yáng)性”、“有或無(wú)”來(lái)表示，如死亡或存活、患病或未患病等。質(zhì)反應(yīng)與量反應(yīng)？2023/10/1617致死性反應(yīng)是一個(gè)質(zhì)反應(yīng)過(guò)程

累積反應(yīng)的幾率與劑量呈雙曲線函數(shù)（S形曲線）關(guān)系。對(duì)數(shù)劑量-反應(yīng)曲線的斜率揭示了劑量變化與致死反應(yīng)之間的關(guān)系，這種關(guān)系在安全性評(píng)價(jià)中有時(shí)比LD50

更為重要，因?yàn)樗商峁└鼮樯钊氲膬?nèi)在毒性特征，有時(shí)還能引出毒性作用機(jī)制的線索。累積反應(yīng)的幾率與劑量的對(duì)數(shù)及群體標(biāo)準(zhǔn)差呈線性關(guān)系。2023/10/1618

例如,一個(gè)很陡的斜率（斜率大，線A）表明毒性反應(yīng)性質(zhì)較嚴(yán)重,毒性作用出現(xiàn)得迅速或吸收速率較大;反之較平坦的量—效曲線（斜率小，線B）則反應(yīng)了安全范圍較大。圖14-1不同藥物毒效應(yīng)量-效關(guān)系比較2023/10/1619圖14-1不同藥物毒效應(yīng)量-效關(guān)系比較依據(jù)斜率，?？蓪⒎磻?yīng)外推至低劑量范圍，求算出LD1、LD10，甚至推測(cè)出不能觀察到的效應(yīng)水平。2023/10/1620圖14-1不同藥物毒效應(yīng)量-效關(guān)系比較斜率的大小在比較同系列化合物時(shí)顯得更為重要，兩個(gè)藥物可能有一個(gè)完全相同或相近的LD50值，但斜率卻可以不同，因此，在相同的劑量范圍內(nèi)，表現(xiàn)出不同的毒理學(xué)特征具平行量-效曲線的兩藥盡管LD50不同，但卻可能表現(xiàn)出相近的毒性作用機(jī)制、藥動(dòng)學(xué)特征和相似的預(yù)后無(wú)論是LD50還是斜率都不能絕對(duì)地揭示出某一特殊的毒性作用機(jī)制

2023/10/1621二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)LD50

及相關(guān)參數(shù)的評(píng)價(jià)

TI值僅適用于比較治療效應(yīng)和致死效應(yīng)的量-效曲線相互平行的藥物，對(duì)于二種效應(yīng)的量-效曲線斜率不同的藥物，還應(yīng)適當(dāng)參考ED95與LD5及ED99與LD1之間的距離。安全指數(shù)（SI）可靠安全系數(shù)（CSF）第一節(jié)

概念和意義2023/10/1622

CSF與TI并不平行，在評(píng)價(jià)A、B兩藥時(shí)，從治療指數(shù)來(lái)看A藥（4）優(yōu)于B藥（2.6）。但從可靠安全系數(shù)來(lái)看B藥CSF（1.33）大于A藥（0.7）。圖14-2致死量、有效量與藥物安全性評(píng)價(jià)的關(guān)系TI=LD50ED50CSF=LD1ED992023/10/1623二、LD50

測(cè)定的意義及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理對(duì)LD50

及相關(guān)參數(shù)的評(píng)價(jià)

——LD50

的測(cè)定存在明顯的不足動(dòng)物消耗量大,獲得的信息有限影響LD50值的因素較多，比如試驗(yàn)動(dòng)物的種類、品系、年齡、性別、健康狀況等,因而不同實(shí)驗(yàn)室之間所得的數(shù)值也很難相似從安全性評(píng)價(jià)角度來(lái)講，需要的不是精確的LD50值，而是更多的毒性信息第一節(jié)

概念和意義2023/10/1624（三）LD50值計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理致死性反應(yīng)是一種質(zhì)反應(yīng)過(guò)程，其量-效關(guān)系應(yīng)符合以下規(guī)律1.劑量對(duì)數(shù)值與死亡率之間呈常態(tài)分布曲線關(guān)系

在一個(gè)群體中特別敏感的動(dòng)物總是比較少的，特別不敏感的動(dòng)物也較少，而多數(shù)動(dòng)物處于中等敏感狀態(tài)，即符合“兩頭少,中間多”的規(guī)律。如以劑量為橫坐標(biāo)，死亡率為縱坐標(biāo)，則可繪出一個(gè)偏態(tài)曲線。小劑量下毒效應(yīng)差別較明顯，在大劑量一端，毒效應(yīng)差別隨劑量的增加而減小，形成拖尾現(xiàn)象。

劑量-死亡率的偏態(tài)分布曲線第一節(jié)

概念和意義2023/10/1625（三）LD50值計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理致死性反應(yīng)是一種質(zhì)反應(yīng)過(guò)程，其量-效關(guān)系應(yīng)符合以下規(guī)律1.劑量對(duì)數(shù)值與死亡率之間呈常態(tài)分布曲線關(guān)系

將橫坐標(biāo)改為對(duì)數(shù)劑量，亦即將橫坐標(biāo)改為等比數(shù)列，則就由偏態(tài)曲線轉(zhuǎn)化為對(duì)稱的常態(tài)曲線。第一節(jié)

概念和意義2023/10/1626（三）LD50值計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

致死性反應(yīng)是一種質(zhì)反應(yīng)過(guò)程,其量一效關(guān)系應(yīng)符合以下規(guī)律:1.劑量對(duì)數(shù)值與死亡率之間呈常態(tài)分布曲線關(guān)系2.劑量對(duì)數(shù)值與累積死亡率之間呈S形曲線關(guān)系2023/10/1627▲由常態(tài)分布曲線累積而來(lái),當(dāng)劑量被轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值(X)后，反應(yīng)幾率(P)與X遵循常態(tài)分布?！揝形曲線是向心對(duì)稱的，對(duì)稱中心的縱坐標(biāo)為50%死亡率，橫坐標(biāo)為1ogLD50。▲曲線兩端平坦，中間較斜。當(dāng)劑量有變化時(shí)LD50附近的死亡率變化很大，兩端（LD5或LD95附近）則變化很小。2023/10/1628以LD50來(lái)表示致死性毒效應(yīng)比LD5、LD95更為靈敏精確；LD50的誤差遠(yuǎn)小于LD5或LD95；曲線中段死亡率在50%附近的點(diǎn)比5%或95%附近的點(diǎn)更為重要，更能代表大多數(shù)動(dòng)物的反應(yīng)水平，提示我們?cè)谠O(shè)計(jì)劑量分組時(shí)必須格外重視引起50%死亡效應(yīng)的劑量組及其鄰近的劑量組。

2023/10/1629▲由常態(tài)分布曲線累積而來(lái),當(dāng)劑量被轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值(X)后，反應(yīng)幾率(P)與X遵循常態(tài)分布?！揝形曲線是向心對(duì)稱的，對(duì)稱中心的縱坐標(biāo)為50%死亡率，橫坐標(biāo)為1ogLD50。▲

曲線兩端平坦，中間較斜。當(dāng)劑量有變化時(shí)LD50附近的死亡率變化很大，兩端（LD5或LD95附近）則變化很小。▲

Bliss根據(jù)常態(tài)累積曲線的特點(diǎn)列出了死亡率各點(diǎn)的“權(quán)重系數(shù)”作為權(quán)衡各點(diǎn)重要性的定量數(shù)值。2023/10/1630▲由常態(tài)分布曲線累積而來(lái),當(dāng)劑量被轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值(X)后，反應(yīng)幾率(P)與X遵循常態(tài)分布?！揝形曲線是向心對(duì)稱的，對(duì)稱中心的縱坐標(biāo)為50%死亡率，橫坐標(biāo)為1ogLD50?！?/p>

曲線兩端平坦，中間較斜。當(dāng)劑量有變化時(shí)LD50附近的死亡率變化很大，兩端（LD5或LD95附近）則變化很小?！?/p>

Bliss根據(jù)常態(tài)累積曲線的特點(diǎn)列出了死亡率各點(diǎn)的“權(quán)重系數(shù)”作為權(quán)衡各點(diǎn)重要性的定量數(shù)值?！鴱腟形曲線來(lái)看，兩端只能趨近而不能達(dá)到0%或100%，實(shí)際工作中因組內(nèi)動(dòng)物數(shù)(n)有限，當(dāng)遇到0/10或10/10的死亡率時(shí)一般均采用以下近似計(jì)算方法:2023/10/1631▲由常態(tài)分布曲線累積而來(lái),當(dāng)劑量被轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值(X)后，反應(yīng)幾率(P)與X遵循常態(tài)分布?！揝形曲線是向心對(duì)稱的，對(duì)稱中心的縱坐標(biāo)為50%死亡率，橫坐標(biāo)為1ogLD50。▲

曲線兩端平坦，中間較斜。當(dāng)劑量有變化時(shí)LD50附近的死亡率變化很大，兩端（LD5或LD95附近）則變化很小。▲

Bliss根據(jù)常態(tài)累積曲線的特點(diǎn)列出了死亡率各點(diǎn)的“權(quán)重系數(shù)”作為權(quán)衡各點(diǎn)重要性的定量數(shù)值?！鴱腟形曲線來(lái)看，兩端只能趨近而不能達(dá)到0%或100%，實(shí)際工作中因組內(nèi)動(dòng)物數(shù)(n)有限，當(dāng)遇到0/10或10/10的死亡率時(shí)一般均采用以下近似計(jì)算方法:A.

將n/n計(jì)算為(n-0.25)/nB.

0/n的計(jì)算為0.25/n2023/10/1632（三）LD50值計(jì)算的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

致死性反應(yīng)是一種質(zhì)反應(yīng)過(guò)程,其量一效關(guān)系應(yīng)符合以下規(guī)律:1.劑量對(duì)數(shù)值與死亡率之間呈常態(tài)分布曲線關(guān)系

2.劑量對(duì)數(shù)值與累積死亡率之間呈S形曲線關(guān)系3.劑量對(duì)數(shù)值與幾率單位之間呈直線關(guān)系

為通過(guò)數(shù)學(xué)的方法更加準(zhǔn)確地計(jì)算LD50等重要的毒理學(xué)參數(shù)并得出曲線的斜率，有必要將S形曲線轉(zhuǎn)換為直線。2023/10/1633

當(dāng)把縱坐標(biāo)的標(biāo)識(shí)單位反應(yīng)率改為反應(yīng)頻率時(shí)，對(duì)稱S形曲線轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布曲線。在該分布曲線下，如把使一半受試個(gè)體出現(xiàn)反應(yīng)的劑量作為中位數(shù)劑量，并以此為標(biāo)準(zhǔn)劃分若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，則在其兩側(cè)1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)分別包括了受試總體的68.3%、95.5%和99.7%。將各標(biāo)準(zhǔn)差的數(shù)值均加上5即為概率單位。概率單位與反應(yīng)率之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系反應(yīng)率（%）概率單位

0.122.3315.9450.0584.1697.7799.982023/10/1634非對(duì)稱S形曲線轉(zhuǎn)換為直線，需要分兩步進(jìn)行：1.把橫坐標(biāo)的劑量單位換算為相應(yīng)的對(duì)數(shù)；2.把縱坐標(biāo)的反應(yīng)率改為概率單位（幾率單位），即可得到一條直線。2023/10/1635三、非致死性毒性反應(yīng)及其轉(zhuǎn)歸

非致死性（毒性）反應(yīng)有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雖可幸免于致死性毒效應(yīng)，但由于藥物可對(duì)機(jī)體的生理、生化、免疫、神經(jīng)或其它系統(tǒng)產(chǎn)生損害，使正常生理功能發(fā)生嚴(yán)重紊亂，因而出現(xiàn)上述系統(tǒng)不可逆的損傷。非致死性有害反應(yīng)與致死性反應(yīng)僅僅是程度上的差異，都是用藥過(guò)程中不希望出現(xiàn)的。2023/10/1636非致死性反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸問題主要涉及到反應(yīng)是否可逆。可逆反應(yīng)是指當(dāng)藥物在體內(nèi)消除后，反應(yīng)也亦隨之消失，不殘留任何效應(yīng)。反應(yīng)是否可逆主要取決于:●

毒性作用涉及的器官與系統(tǒng)●

藥物的內(nèi)在毒性●

用藥時(shí)間的長(zhǎng)短●

在確定的時(shí)間范圍內(nèi)，藥物在體內(nèi)的量●

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡（月齡）和健康狀況2023/10/1637

再生能力強(qiáng)的組織和器官(如肝臟)的損傷通常較再生能力弱的組織和器官(如神經(jīng)組織)的損傷易于逆轉(zhuǎn)，肝腎功能不全或尚未發(fā)育完善(如幼年動(dòng)物)的個(gè)體易形成不可逆性損傷。

在藥物安全性評(píng)價(jià)中，了解毒性作用是否可逆是非常重要的，如在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中觀察到不可逆反應(yīng)，則應(yīng)注意這一不可逆反應(yīng)外推至人時(shí)是否存在。2023/10/1638第二節(jié)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1639一、一般程序和基本要求

一般程序?qū)⑺幬锿ㄟ^(guò)經(jīng)口途徑（灌胃）或其他預(yù)期臨床用藥途徑給予數(shù)組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，必要時(shí)可增加一個(gè)溶媒對(duì)照組，在特定時(shí)間間隔內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為表現(xiàn)、中毒癥狀及死亡情況。實(shí)驗(yàn)條件及方法必須規(guī)范化試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1640一、一般程序和基本要求

基本要求兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小動(dòng)物—LD50、最大耐受量試驗(yàn)大動(dòng)物—單次給藥的近似致死量和最大耐受量?jī)煞N給藥途徑—其中一種必須與臨床用藥途徑相同試驗(yàn)周期—7-14天LD50計(jì)算方法—bliss法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1641表14-3各國(guó)對(duì)急性毒性試驗(yàn)的基本要求FDA日本美國(guó)英國(guó)前西德歐共體前蘇聯(lián)WHO瑞士動(dòng)物種類3-4

2

3

2

2

2

2

3

2給藥途徑

1

3

3

2

2

2

2

3

2試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1642二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物選擇的主要原則：●

盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動(dòng)物；●

易于飼養(yǎng)管理、試驗(yàn)操作方便的動(dòng)物；●

繁殖生育力較強(qiáng)，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)；●

價(jià)格較低，易于獲得的動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1643二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在基礎(chǔ)性研究工作中按科研課題的具體要求選擇，在法規(guī)性毒理學(xué)評(píng)價(jià)工作中，必須按照其規(guī)范要求進(jìn)行。無(wú)論使用何種動(dòng)物都必須注明動(dòng)物的來(lái)源、品系、年齡、體重、性別、飼養(yǎng)條件以及動(dòng)物生產(chǎn)合格證書。如系無(wú)特殊病原體動(dòng)物也應(yīng)在報(bào)告中注明。試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1644二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種類小鼠、大鼠、犬、猴、家兔（經(jīng)口給藥不用）下列情況考慮選用非嚙齒類動(dòng)物大、小鼠LD50差別明顯藥物的生物轉(zhuǎn)化形式和速率在嚙齒類與非嚙齒類之間存在明顯差異為了得到明確的毒效表現(xiàn)，初步了解藥物的特性后，在條件許可的情況下可考慮選用其他敏感動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法2023/10/1645二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種類健康狀況體重與年齡試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法同一批實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的年齡、體重應(yīng)盡可能一致急性毒性試驗(yàn)原則上選用年輕成年動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物的年齡一般為7

~

9周齡，非嚙齒類動(dòng)物起始為6

~

8月齡。同一批試驗(yàn)中，動(dòng)物的初始體重變異要求不超過(guò)平均體重的±20%。2023/10/1646表14-4常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生活年限及體重選擇動(dòng)物生活年成年體重選擇范圍（g）種類限（年）時(shí)間(月)體重(g)急性實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)期性實(shí)驗(yàn)小鼠1.5~221518~2515~18大鼠2~2.53150150~24050~100豚鼠6~82250200~250150~200家兔4~93~415001500~20001200~1500狗10~203~4-8000~150004000~60002023/10/1647二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種類健康狀況體重與年齡性別試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法急性毒性試驗(yàn)中應(yīng)考慮雌雄動(dòng)物數(shù)目相等但在試驗(yàn)中如發(fā)現(xiàn)某性別動(dòng)物的死亡率明顯高于另一性別時(shí)，則最好對(duì)該性別的LD50另外計(jì)算，或考慮選用敏感性別的動(dòng)物重新進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。2023/10/1648二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種類健康狀況體重與年齡性別動(dòng)物分組方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法動(dòng)物應(yīng)隨機(jī)分配至各劑量組。隨機(jī)分組可使動(dòng)物形成一個(gè)均勻的整體，并可減少因個(gè)體差異而造成的誤差。體重或健康狀況不符合要求的動(dòng)物應(yīng)在隨機(jī)分組前剔除。2023/10/1649二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種類健康狀況體重與年齡性別動(dòng)物分組方法動(dòng)物給藥前禁食處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則及方法經(jīng)口途徑染毒，在試驗(yàn)前應(yīng)作禁食處理。

大鼠主要在夜間進(jìn)食，要求染毒前應(yīng)隔夜禁食。小鼠由于其消化吸收和代謝速度較快，可隔夜禁食也可禁食4小時(shí)以上。大動(dòng)物常前一天正常給食，染毒前不喂食即可。禁食期間均正常給水。染毒2小時(shí)后提供飼料。經(jīng)口多次染毒，可不禁食。2023/10/1650三、劑量水平的選擇劑量水平的選擇以測(cè)定LD50及劑量-反應(yīng)曲線的斜率為目的（10%-50%-90%）；4上以上劑量，至少有3個(gè)落在10%-90%之間；做預(yù)試驗(yàn)來(lái)摸索劑量通過(guò)文獻(xiàn)檢索，為已知化學(xué)類別的藥物確定預(yù)期毒性中值對(duì)全新結(jié)構(gòu)的藥物或中草藥復(fù)方，可先通過(guò)小批量動(dòng)物摸索，找出Dmin和Dmax2023/10/1651▲

為已知化學(xué)類別的藥物確定預(yù)期毒性中值劑量水平的選擇對(duì)于己了解化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物，在確定其所屬化學(xué)類別及其所含的特殊基團(tuán)的基礎(chǔ)上，查閱有關(guān)文獻(xiàn)，找出與藥物結(jié)構(gòu)近似或有共性基團(tuán)的藥物的毒性資料；其次最好能了解藥物的理化性質(zhì)，最后綜合考慮這兩方面的資料，選擇與藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)最為接近的己知藥物的LD50作為藥物的預(yù)期毒性中值。2023/10/1652▲

為已知化學(xué)類別的藥物確定預(yù)期毒性中值劑量水平的選擇

確定預(yù)期毒性中值（LD50）后，以此值為中間劑量，再以該中間劑量值為基準(zhǔn)，按一定的組間距上下各推二個(gè)劑量，作為預(yù)試驗(yàn)的劑量分組。預(yù)試時(shí)，組間距可稍大些，i值可取0.6，相鄰劑量比為1:4。如果估計(jì)藥物的致死劑量范圍較窄，組間距可適當(dāng)縮小，i值取0.2，相鄰劑量比為1:1.6。組間距i值，劑量的對(duì)數(shù)值等差分布，劑量等比分布2023/10/1653通過(guò)預(yù)試找出藥物使10%-90%實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡劑量的大致范圍,再據(jù)此確定正式試驗(yàn)的具體分組方案,此時(shí)可按下式求算組間距（i

值）。

或

i=logLD90-logLD10n-1

i=logLD100-logLD0n-1劑量水平的選擇2023/10/1654▲

對(duì)全新結(jié)構(gòu)的藥物或中草藥復(fù)方劑量水平的選擇

先通過(guò)小批量動(dòng)物的摸索，找出0%及100%估計(jì)致死量(即Dmin和Dmax)，再求出

i

值。

(1)用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動(dòng)物（每組2-3只），找出大致死亡范圍。2023/10/1655劑量水平的選擇

劑量死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)5mg/kg

0/250mg/kg1/2

500mg/kg2/25000mg/kg2/2上述結(jié)果提示,大致死亡范圍為50mg/kg-500mg/kg。(1)先用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動(dòng)物（每組2-3只），找出大致死亡范圍。2023/10/1656劑量水平的選擇(1)先用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動(dòng)物（每組2-3只），找出大致死亡范圍。(2)再用1、2、4、8………等2倍稀釋的藥物濃度每組4只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，找出Dmin和Dmax。劑量死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)50mg/kg0/4100mg/kg2/4200mg/kg

2/4400mg/kg4/4800mg/kg4/42023/10/1657劑量水平的選擇(2)再用1、2、4、8………等2倍稀釋的藥物濃度每組4只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，找出Dmin和Dmax。

當(dāng)出現(xiàn)4/4死亡時(shí)如其前一組為3/4死亡，則取4/4組的劑量為Dmax，如前一組為2/4或1/4死亡(如本例為2/4)，考慮到4/4組的劑量在正式實(shí)驗(yàn)中可能的死亡率低于70%，為慎重起見，可將4/4組的劑量乘以2作為Dmax；

當(dāng)出現(xiàn)0/4死亡時(shí)，如其后一組的死亡率為1/4，則取0/4組的劑量為Dmin，如后一組死亡率大于1/4，考慮到0/4組的劑量在正式實(shí)驗(yàn)中可能的死亡率高于70%，則將0/4組的劑量除以2，作為Dmin。2023/10/1658劑量水平的選擇

劑量死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4Dmax：出現(xiàn)4/4死亡時(shí)，前一組為2/4，考慮到4/4組的劑量在正式實(shí)驗(yàn)中可能的死亡率低于70%，可將4/4組的劑量乘以2。Dmax

=

400×70%×2

=

560（mg/kg）Dmin：出現(xiàn)0/4死亡時(shí)，后一組死亡率大于1/4，則考慮到0/4組的劑量在正式實(shí)驗(yàn)中可能的死亡率高于70%，將0/4組的劑量除以2。Dmin=50÷70%÷2≈35（mg/kg）2023/10/1659劑量水平的選擇

劑量死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)

50mg/kg0/4*

100mg/kg2/4200mg/kg2/4400mg/kg4/4*800mg/kg4/4陳奇：《中藥藥理研究方法學(xué)》第2版Dmax：當(dāng)出現(xiàn)4/4死亡時(shí),如前一組死亡率為2/4時(shí)Dmax=4/4死亡劑量×1.4()=400×1.4=560（mg/kg）Dmin：當(dāng)出現(xiàn)0/4死亡時(shí)，如后一組死亡率大于1/4Dmin=0/4死亡劑量÷1.4()=50÷1.4≈35（mg/kg）2023/10/1660本法用較少的動(dòng)物和藥物，尋找出正式實(shí)驗(yàn)時(shí)最高死亡率不低于70%，最低死亡率不高于30%的劑量范圍。在確定了Dmax和Dmin以后，可求得組間距（i值):以Dmin的對(duì)數(shù)為起點(diǎn)，向上推出n

組動(dòng)物的各組劑量的對(duì)數(shù)值，求出反對(duì)數(shù)即可求得各組的劑量。

劑量水平的選擇(1)先用10倍稀釋的藥物濃度系列，用少量動(dòng)物（每組2-3只），找出大致死亡范圍。(2)再用1、2、4、8………等2倍稀釋的藥物濃度每組4只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，找出Dmin和Dmax。

i=logDmax-logDminn-12023/10/1661四、劑量組數(shù)及動(dòng)物數(shù)LD50

測(cè)定中劑量組數(shù)的設(shè)計(jì)，除符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求外，還應(yīng)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)所提供的藥物的毒性情況而定。

一般而言，在實(shí)際工作中設(shè)4~5個(gè)劑量組，劑距以0.65~0.85為宜。

小鼠每組10只(雌雄各半)，大鼠不應(yīng)少于6~8只。2023/10/1662五、劑型與給藥應(yīng)寫明受試藥物的名稱、批號(hào)、來(lái)源、純度、保存條件及配制方法。供試藥品應(yīng)能溶于或混懸于適當(dāng)?shù)娜苊?，如果溶媒的毒性情況是未知的，則應(yīng)設(shè)立一個(gè)溶媒對(duì)照組，溶媒對(duì)照組的給藥容量應(yīng)與最高劑量組相等。對(duì)所用的溶媒及助溶劑的種類、規(guī)格、批號(hào)及來(lái)源等都必須有詳細(xì)的記錄，以備分析和審核。2023/10/1663五、劑型與給藥給藥途徑要用兩種，其中應(yīng)包括推薦臨床研究的給藥途徑。溶于水的藥物應(yīng)當(dāng)測(cè)定靜脈給藥途徑的急性毒性，口服藥物應(yīng)灌胃給藥。藥物可以等體積（各劑量組的藥物濃度不同，而給藥體積相同）或等濃度（藥物濃度相同，而各劑量組的給藥體積不同）給藥，但必須注意上述兩種方式給藥所觀察到的毒性效應(yīng)可能是不盡相同的。2023/10/1664五、劑型與給藥給藥的體積，嚙齒類動(dòng)物口服給藥的最大的體積，對(duì)非水溶液而言以不超過(guò)10ml/kg為宜，水溶液或混懸液一般不超過(guò)20ml/kg。如果劑量較大而不便于一次給藥，可以分成相等的容量，每隔6~8小時(shí)給藥，但必須在第一次給藥后的24小時(shí)內(nèi)完成?？诜o藥應(yīng)禁食；靜注給藥應(yīng)注意藥液的pH值、溫度、滲透壓、注射速度等可能影響毒效應(yīng)的各種因素。2023/10/1665動(dòng)物給藥途徑常用容量最大容量小鼠ig0.2ml/20g1.0ml/20giv0.2ml/20g0.5ml/20gip0.2ml/20g1.0ml/20gsc0.1ml/20g0.5ml/20gim0.1ml/20g0.2ml/20g表14-6急性毒性試驗(yàn)常用動(dòng)物單次給藥的常用容量和最大容量大鼠ig

1.0ml/200g

3.0ml/200giv

0.5ml/200g

1.0ml/200gip

1.0ml/200g

3.0ml/200gsc

0.5ml/200g

1.0ml/200g狗im

0.2ml/200g

0.5ml/200gig

10ml/只

20ml/只iv

35ml/只

50ml/只2023/10/1666六、試驗(yàn)時(shí)限與量限

急性毒性試驗(yàn)的觀察時(shí)間取決于癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、毒性強(qiáng)弱、致死速度、恢復(fù)速率以及藥物本身的代謝特征等。

我國(guó)新藥審批辦法規(guī)定：急性毒性試驗(yàn)必須觀察7~14天，但一般不必超過(guò)2周（14天）。在表示藥物的LD50時(shí)最好同時(shí)注明觀察時(shí)間，這樣在毒性比較時(shí)，才會(huì)有共同的基礎(chǔ)。2023/10/1667從量上考慮試驗(yàn)的限度，在特定的試驗(yàn)條件下，如給予足夠大的量，所有的藥物都有可能產(chǎn)生毒性。這一限度對(duì)于口服急性毒性是5g/kg，注射是2g/kg，在此劑量下如無(wú)死亡出現(xiàn)，通?？刹槐刈龈叩膭┝?。

在實(shí)際工作中，對(duì)于毒性低的藥物可用最大給藥濃度和最大給藥容量單次或24小時(shí)內(nèi)分次給藥，一般使用20只嚙齒類動(dòng)物，連續(xù)觀察7~14天，如無(wú)死亡出現(xiàn)，則該劑量即為藥物的最大耐受劑量。2023/10/1668七、觀察指標(biāo)

通過(guò)深入細(xì)致地觀察試驗(yàn)動(dòng)物的中毒癥狀及其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程與規(guī)律、死亡前癥狀特點(diǎn)、死亡所需時(shí)間的差異等，找出毒性作用的特征，初步獲得藥物毒效應(yīng)的靶器官和受試動(dòng)物的死亡原因。2023/10/1669七、觀察指標(biāo)

籠邊觀察

特別要注意給藥后６小時(shí)內(nèi)動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。觀察的時(shí)間間隔及頻度必須根據(jù)癥狀出現(xiàn)、恢復(fù)、變化及死亡時(shí)間而定，一般給藥后持續(xù)觀察30