細菌形態(tài)學檢查課件

第二章細菌形態(tài)學檢查第二章細菌形態(tài)學檢查2二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查2二細菌染色標本的檢查三顯微鏡概述一細菌不染色標本的檢查3一、顯微鏡概述

顯微鏡（microscope）

顯微鏡是由一個透鏡或幾個透鏡的組合構成的一種光學儀器，主要用于放大微小物體成為人的肉眼所能看到的儀器。3一、顯微鏡概述顯微鏡（microscope）4光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分辨率為0.25μm，可以清楚的觀察到細菌、寄生蟲等個體。4光學顯微鏡以自然光或燈光為光源，在最佳條件下最大分5暗視野顯微鏡

用特制的暗視野集光器代替普通光學顯微鏡上的明視野集光器，故背景視野黑暗無光。常用于觀察活細菌、螺旋體、寄生蟲的運動現(xiàn)象。5暗視野顯微鏡6相差顯微鏡

根據(jù)標本中密度不同引起光相差異的原理觀察病原生物，主要用于檢查不染色病原生物的形態(tài)及某些內部結構。6相差顯微鏡7熒光顯微鏡

病原生物經熒光染色后，置于熒光顯微鏡下可激發(fā)熒光，可以看到發(fā)射熒光的各種病原生物。7熒光顯微鏡8電子顯微鏡

是以電子流代替光源，能分辨1nm物體，又分為透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。8電子顯微鏡9二、細菌不染色標本的檢查9二、細菌不染色標本的檢查101、懸滴法(a)在潔凈蓋玻片周圍涂少許凡士林。(b)在蓋玻片中央滴一小滴菌液。(c)將凹玻片反轉，使凹窩中心對準蓋玻片上的菌液滴，液滴不得與凹玻片接觸，輕壓使蓋玻片與凹玻片粘在一起，液滴處于封閉的小室中，防止液滴干燥和氣流的影響。101、懸滴法11(d)小心將凹玻片翻轉過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩中心。

(e)先用低倍鏡找到懸滴邊緣，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調得

暗一些。11(d)小心將凹玻片翻轉過來，使菌滴仍懸浮在蓋玻片下和凹窩122、壓滴法(a)制備菌懸液：取出1ml菌液稀釋至肉眼看不到混濁為止。(b)取2-3環(huán)稀釋菌液，放在載玻片中央。(c)用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個蓋玻

片慢慢放下，注意不要產生氣泡。(d)先以低倍鏡找到標本，再用高倍鏡觀察，觀察時光線要調得暗些。122、壓滴法13三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色2、抗酸染色3、熒光染色13三、細菌染色標本的檢查1、革蘭染色141、革蘭染色

（Gram

stain）

染色原理：

通過結晶紫初染和碘液媒染，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次多且致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時，能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭陰性菌在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，結晶紫與碘復合物的溶出，通過脫色后呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革陰性菌呈紅色。141、革蘭染色（Gramstain）15操作方法：1）涂片固定。2）草酸銨結晶紫染1分鐘。3）用蒸餾水沖洗。4）加碘液覆蓋涂面媒染約1分鐘。

15操作方法：165）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，20秒后水洗，吸去水分。7）稀釋復紅或沙黃復染2分鐘后，水沖洗。干燥，鏡檢。

165）水洗，用吸水紙吸去水分。17鏡檢結果：革蘭染色陽性細菌（紫色）革蘭染色陰性細菌（紅色）17鏡檢結果：革蘭染色陽性細菌革蘭染色陰性細菌18臨床意義：1）細菌鑒定，分為革蘭染色陽性和陰性兩類。2）根據(jù)細菌染色性質初步確定致病物質。3）參考選擇抗菌藥物，合理指導臨床用藥。18臨床意義：192、抗酸染色（acid-faststain）

染色原理：

分枝桿菌的細胞壁內含有大量的脂質，包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經過加熱和延長染色時間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。192、抗酸染色（acid-faststain）染色原理20操作方法：1）初染：滴加石炭酸復紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，出現(xiàn)蒸汽即暫時離開，避免干涸，加熱3-5分鐘，冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30秒-1分鐘；用水沖洗。3）復染：用堿性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用油鏡觀察。20操作方法：21鏡檢結果：結核分枝桿菌21鏡檢結果：結核分枝桿菌22

臨床意義：

用于鑒定分枝桿菌屬細菌，如結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌。22臨床意義：233、熒光染色

原理：

采用熒光素標記的已知抗體與細菌結合，含有該抗體的目的細菌在顯微鏡下發(fā)出熒光，非目的細菌則不發(fā)出熒光。233、熒光染色原理：24

臨床意義：

主要應用于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌、痢疾志賀菌、病毒以及寄生蟲等的檢測與鑒別。24細菌形態(tài)學檢查法細菌形態(tài)學檢查法重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查染色標本的形態(tài)學檢查革蘭染色抗酸染色重點提示不染色標本的形態(tài)學檢查一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscope）光源：可見光2.暗視野顯微鏡（darkfieldmicroscope）暗背景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細菌和螺旋體的形態(tài)及運動觀察3.熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope）光源：100W~200W的高壓汞燈一、顯微鏡1.普通光學顯微鏡（lightmicroscop一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）檢查不染色活細菌的形態(tài)及某些內部結構5.電子顯微鏡（electronmicroscope)光源：電子流透射電鏡：觀察細菌內部超微結構掃描電鏡：對細菌表面結構及附件觀察一、顯微鏡4.相差顯微鏡（phasecontrastmi二、不染色標本的細菌學檢查常用方法壓滴法懸滴法用途動力試驗：檢查細菌有無動力及運動狀況制動試驗：初步鑒別病原菌；鑒定血清型二、不染色標本的細菌學檢查常用方法三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料1.堿性染料：解離后色基帶正電荷，如美藍、結晶紫、堿性復紅等。2.酸性染料：解離后色基帶負電荷，如伊紅、酸性復紅、剛果紅等。3.中性染料：堿性染料與酸性染料的復合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等。三、細菌染色標本的檢查（一）常用染料三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍。用于觀察細菌的形態(tài)、大小、排列。復染色法（鑒別染色法）用兩種或兩種以上不同顏色的染料，以區(qū)別細菌的著色性。三、細菌染色標本的檢查(二)常用染色方法三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstaining）（1）原理細胞壁學說：兩種細菌細胞壁結構不同-G+菌肽聚糖層厚、致密，脂質含量少；G-菌薄而疏松，脂質含量多。等電點學說：G+菌pI2～3；G-菌pI4～5化學學說：G+菌含有核糖核酸鎂鹽多，G-菌含量少。三、細菌染色標本的檢查1.革蘭染色（Gramstainin三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結果細菌分為革蘭陽性（G+）菌和革蘭陰性（G-）菌紫色為革蘭陽性菌，紅色為革蘭陰性菌三、細菌染色標本的檢查-革蘭染色（2）結果紫色為革蘭陽性菌，革蘭染色方法革蘭染色方法三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色（1）原理：分枝桿菌細胞壁含脂質較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復紅結合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復紅的顏色，達到初步鑒別細菌的目的。（2）結果：抗酸性細菌和非抗酸性細菌三、細菌染色標本的檢查2.抗酸染色未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌脫色經復染呈藍色為非抗酸性細菌未脫色細菌呈紅色為抗酸性細菌3.其他染色方法（1）鞭毛染色（2）莢膜染色3.其他染色方法第三章細菌的分離培養(yǎng)第三章細菌的分離培養(yǎng)39二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法39二細菌的培養(yǎng)方法三培養(yǎng)基一細菌的接種方法40一、培養(yǎng)基1、概念

將細菌生長繁殖所需的各類營養(yǎng)物質按照一定比例配制而成的營養(yǎng)基質，主要用于分離純種細菌、傳代保存細菌、鑒別細菌、研究細菌的生理生化特性和研制疫苗等。40一、培養(yǎng)基1、概念412、種類1）根據(jù)組成分類：①合成培養(yǎng)基：用已知化學成分的物質配制而成。

特點：組成成分精確、重復性好，但價格較昂貴。

用途：適用于實驗室研究。②天然培養(yǎng)基：用化學成分尚不清楚或不恒定的天然有機物質制成。（如肉浸汁、蛋白胨）

特點：經濟。

用途：適用于大規(guī)模培養(yǎng)和生產及實驗室。412、種類422）根據(jù)物理性狀分類①液體培養(yǎng)基：把供細菌生長所需要的成分溶于水中，調適當pH，滅菌后即為液體培養(yǎng)基。②固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入1.5％-2％瓊脂。③半固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中加入0.2％-0.5％瓊脂。422）根據(jù)物理性狀分類43液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基43液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基443）根據(jù)用途分類：①基礎培養(yǎng)基②營養(yǎng)培養(yǎng)基③鑒別培養(yǎng)基④選擇培養(yǎng)基⑤厭氧培養(yǎng)基⑥L型培養(yǎng)基443）根據(jù)用途分類：453、基本成分（1）營養(yǎng)成分1）水分：水是細菌生長不可缺少的物質，不僅是細菌細胞的組成成

分，也是良好的溶劑。培養(yǎng)基最好使用蒸餾水。2）蛋白胨：是細菌氮、碳的來源。3）血液和血清：血液中含有多種營養(yǎng)成分，是營養(yǎng)培養(yǎng)基的主要原

料之一，適用于對營養(yǎng)要求高的細菌的培養(yǎng)。453、基本成分464）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。5）肉浸膏：用?；蝰R的肉浸液濃縮而成，是豐富的營養(yǎng)液，適用于多數(shù)細菌的培養(yǎng)。6）酵母浸膏：將面包酵母細胞用自融方法破壞、沉淀后進行濃縮、干燥而成。7）雞卵和卵黃：凝固后可作為固體培養(yǎng)基，如培養(yǎng)結核分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基。8）膽汁和膽鹽：可用于制備鑒別培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基。464）糖類：通常用糖發(fā)酵試驗檢測細菌的生化性狀。47（2）凝固劑1）瓊脂：主要化學成分是多糖，在98℃以上溶于水，至45℃以下凝固。2）明膠：主要成分是蛋白質，但是營養(yǎng)價值不高，在24℃以上溶解，故不能在37℃孵育。47（2）凝固劑48（3）抑菌劑

抑制雜菌的生長，常用的有膽鹽、孔雀綠、亞硫酸鈉、苯乙醇等。（4）指示劑

指示劑是為了檢測培養(yǎng)基中pH的變化，常用的有酚紅、溴甲酚紫、甲基紅、酸性復紅等。48（3）抑菌劑494、培養(yǎng)基的制備1）調配與溶化：用電子天平稱量一定的原料，并加蒸餾水至所配置的體積，若加有瓊脂粉，則需加熱溶解。2）調整pH：一般培養(yǎng)基的pH為7.2-7.6左右，經高壓鍋滅菌后其PH可發(fā)生0.1-0.2的變動。494、培養(yǎng)基的制備503）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基在融化后趁熱用紗布或雙層紗布加脫脂棉過濾。4）分裝503）過濾澄清：液體或半固體培養(yǎng)基常采用濾紙過濾，固體培養(yǎng)515）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，15-30min。6）檢測與質控7）保存：注明名稱、日期。一般放在4℃冰箱保存，不宜超過一周。515）滅菌：高壓滅菌，103.4kPa，121.3℃，15525、細菌常用培養(yǎng)基

血平板、巧克力平板、

中國藍平板或伊紅亞甲藍平板、

麥康凱平板、SS瓊脂、堿性瓊脂

或TCBS瓊脂、血液增菌培養(yǎng)基、

營養(yǎng)肉湯血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂平板525、細菌常用培養(yǎng)基血培養(yǎng)瓶真菌培養(yǎng)管麥康凱瓊脂平板血瓊脂53

二、細菌的接種方法1）平板劃線法：分區(qū)劃線法：含菌量較多的標本（如膿汁等）。連續(xù)劃線法：含菌量較少的標本。2）斜面接種法：

挑取單個菌落，接種針從斜面底部自下而上劃一直線，再從底

部向上做S型劃線接種。53二、細菌的接種方法54分區(qū)劃線法54分區(qū)劃線法553）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經適當稀釋的標本1ml，置于無菌平皿內，傾入已融化并冷至50℃左右的培養(yǎng)基，立即混勻待凝固后倒置于35±1℃培養(yǎng)。4）穿刺接種法：由培養(yǎng)基中央刺到距管底約半厘米處，然后沿穿刺線退出接種針。553）傾注平板法：用無菌吸管吸取原標本或經適當稀釋的標本15）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內壁研磨數(shù)次，然后讓試管回復到原來的直立位置淹沒接種部位。6）涂布接種法：加定量的菌液于瓊脂平板表面，用滅菌L型玻璃棒反復涂布幾次，使菌液均勻的分布在瓊脂表面。565）液體接種法：將試管傾斜30度角，接種環(huán)觸到試管的內壁研磨57三、細菌的培養(yǎng)1）需氧培養(yǎng)：指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養(yǎng)。2）二氧化碳培養(yǎng)：某些細菌在培養(yǎng)時，特別是初次分離時需要5%-10%的CO2環(huán)境。3）微需氧培養(yǎng)：即在5%-6%

O2，6%-10%

CO2的環(huán)境生長。4）厭氧培養(yǎng)：細菌對氧敏感，培養(yǎng)過程中需造成無氧環(huán)境。57三、細菌的培養(yǎng)58四、細菌的生長性狀1）液體培養(yǎng)基：大多數(shù)菌呈均勻混濁狀態(tài)，少數(shù)鏈狀的細菌（如鏈球菌）則呈沉淀生長，專性需氧菌（如分枝結核桿菌）呈表面生長，形成菌膜。58四、細菌的生長性狀59

3）固體培養(yǎng)基（1）菌落：單個細菌分裂繁殖成一堆肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。

（2）菌落分為三型：①光滑型（S型菌落）：表面光滑、濕潤、邊緣整齊。②粗糙型菌落（R型菌落）：表面粗糙，干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣不整齊。③黏液型菌落（M型菌落）：粘稠、有光澤、似水珠樣。593）固體培養(yǎng)基602）半固體培養(yǎng)基（1）有鞭毛的細菌，沿穿刺線呈羽毛狀或云霧狀渾濁生長。（2）無鞭毛的細菌：只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長。602）半固體培養(yǎng)基細菌的培養(yǎng)與分離技術細菌的培養(yǎng)與分離技術重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基制備的基本程序細菌接種與培養(yǎng)方法細菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象重點提示培養(yǎng)基的主要成分及作用一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質。要求：培養(yǎng)基必須含有細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質和適宜的pH值。一、培養(yǎng)基概念：人工配制的、適合細菌生長繁殖的營養(yǎng)基質。一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成1.營養(yǎng)物質：氮源、碳源、無機鹽、生長因子蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）類、血液、雞蛋和動物血清、無機鹽類、生長因子2.水：蒸餾水或去離子水3.凝固物質：即賦形劑，常用瓊脂、明膠一、培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基的組成一、培養(yǎng)基4.抑制劑抑制非檢出菌的生長或使其少生長，以利于檢出菌的生長。膽鹽、煌綠、亞硫酸鈉、某些染料及抗生素等。5.指示劑常用的指示劑：酚紅、中性紅、中國藍、溴甲酚紫、酸性復紅等。一、培養(yǎng)基4.抑制劑一、培養(yǎng)基1.按用途分類基礎培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液、血清等鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑特殊培養(yǎng)基：厭氧、細菌L型（二）培養(yǎng)基分類一、培養(yǎng)基1.按用途分類（二）培養(yǎng)基分類一、培養(yǎng)基2.按物理性狀分類液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基：分離培養(yǎng)、純化、增菌半固體培養(yǎng)基：動力檢測、保存菌種一、培養(yǎng)基2.按物理性狀分類一、培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的制備1.調配：根據(jù)培養(yǎng)基組成，準確稱取各組分，先加一部分蒸餾水，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量。2.溶解：液體培養(yǎng)基不需加熱3.校正pH：一般7.2~7.64.過濾澄清：液體培養(yǎng)基用濾紙；固體培養(yǎng)基用紗布（若培養(yǎng)基澄清，此步可省略）一、培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基5.分裝平板：滅菌后冷卻至50~60℃時傾倒

90mm內徑傾注25~30ml（4mm厚）：藥敏用

90mm內徑傾注13~15ml（3mm厚）：培養(yǎng)用瓊脂斜面：分裝量為試管的1/4~1/3，滅菌后趁熱擺成斜面，斜面長度約為試管的2/3。高層、半固體、液體：分裝量為試管長度的1/3。一、培養(yǎng)基5.分裝一、培養(yǎng)基6.滅菌高壓蒸汽滅菌無糖：103.4kPa121.3℃維持15~20min有糖：68.95kPa115℃維持15min間歇蒸汽滅菌法：血清、牛乳、雞蛋血清凝固器滅菌一、培養(yǎng)基6.滅菌一、培養(yǎng)基7.質量檢驗無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在35℃孵育過夜，判定是否滅菌合格。效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應菌種，觀察細菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。8.保存

4℃冰箱保存1周左右一、培養(yǎng)基7.質量檢驗二、細菌的人工培養(yǎng)（一）無菌技術無菌技術是指防止微生物進入物品或機體，同時防止待檢物中可能存在的病原微生物污染周圍環(huán)境及工作人員的規(guī)范化操作技術無菌技術是保證細菌檢驗質量，防止