六味地黃湯對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1、血小板源性生長(zhǎng)因子-a及pdgf-b在慢性腎功能衰竭大鼠腎組織中的表達(dá)及作用

六味地黃湯對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1、血小板源性生長(zhǎng)因子-a及pdgf-b在慢性腎功能衰竭大鼠腎組織中的表達(dá)及作用

根據(jù)研究，多種原因引起的慢性腎臟疾?。╧d）常見。慢性缺氧是終末期腎疾病的最后一條共同通道。英國(guó)學(xué)者Fine提出的“慢性缺氧學(xué)說”成為目前CKD學(xué)界研究的熱點(diǎn)。該學(xué)說提出,腎小管間質(zhì)部分的慢性氧缺失是促進(jìn)腎臟疾病進(jìn)展和纖維化的重要原因。缺氧可增加缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)表達(dá),而HIF可上調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血漿纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)等,促使腎間質(zhì)纖維化。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)能夠促進(jìn)肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生膠原,并通過抑制膠原酶,減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解,最終導(dǎo)致ECM合成增多、降解減少,過度沉積,形成纖維化。本研究旨在通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B在腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)和作用,以及六味地黃湯對(duì)其表達(dá)的影響。1材料和方法1.1湖南中醫(yī)藥scxk動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量(200±10)g,湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(湘)2009-0001,飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房。1.2原藥材/ml六味地黃湯(熟地黃24g,山藥12g,山萸肉12g,澤瀉9g,茯苓9g,牡丹皮9g)飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。先將藥材用5倍自來水浸泡2h,煮沸后再微火煎熬30min,過濾后收集煎液,原藥渣加少量水煎煮,取二煎液。將兩煎液混合,于水浴恒溫器上濃縮為1g原藥材/mL。一抗為兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B多克隆抗體(美國(guó)SantaCruz),PV-6001二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒,二抗山羊抗兔IgG-HRP多聚體PV-6001(北京中杉金橋公司),DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),Trizol(美國(guó)MRC公司),引物為英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,RT試劑盒(美國(guó)Fermentas公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司),TaqDNA聚合酶和dNTPs(美國(guó)Fermentas公司)。1.3腎組織手術(shù)組參考文獻(xiàn)方法,以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物,常規(guī)消毒鋪巾,從左腹部切口,打開腹腔,靜脈夾夾住腎蒂后切除左腎上下極(切除2/3),以明膠海綿壓迫止血,復(fù)位腎臟,1周后進(jìn)行第2次手術(shù),切除右側(cè)腎臟。假手術(shù)組采取同樣步驟,打開腹腔暴露腎臟后避免牽拉腎臟,不切除腎臟。1.4各組小鼠腎切除SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和六味地黃湯組,每組10只,模型組、六味地黃湯組均在無菌條件下進(jìn)行5/6腎切除術(shù)。1.5藥劑量及灌胃量造模后第2日,六味地黃湯組予以六味地黃湯煎煮方灌胃,給藥劑量按70kg成人的體表面積換算。假手術(shù)組和模型組以等容積蒸餾水灌胃,每日1次,連續(xù)12周。灌胃量:10mL/(kg·次)。各組大鼠灌胃中途死亡者予以剔除。1.6腎組織病理學(xué)檢測(cè)各組大鼠均于造模12周后處死,處死前收集24h尿液,ELISA法檢測(cè)24h尿白蛋白(24hUAlb);腹主動(dòng)脈采血分離血清,酶法測(cè)定血肌酐(SCr)濃度,尿素酶-GLDH法測(cè)定尿素氮(BUN)濃度。腎組織分為兩部分處理:(1)光鏡觀察。標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,分別進(jìn)行HE染色、Masson染色及免疫組化檢測(cè);(2)腎組織取出后立即放入液氮罐中,隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待用,用于RT-PCR檢測(cè)。1.7指標(biāo)測(cè)定1.7.1腎組織病理學(xué)觀察腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚度為3~4μm)后,常規(guī)HE染色及Masson染色,Olympus顯微鏡觀察各組腎組織病理變化并拍照。1.7.2數(shù)碼醫(yī)學(xué)分析免疫組化PV二步法染色,一抗用兔抗大鼠HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B抗體,二抗用相應(yīng)山羊抗兔IgG-HRP多聚體(工作濃度按產(chǎn)品說明書配制為1∶100),染色呈棕褐色或棕黃色者為陽(yáng)性染色。Olympus顯微鏡觀察每張切片并隨機(jī)選取5個(gè)視野,用麥克奧迪數(shù)碼醫(yī)學(xué)分析系統(tǒng)(MoticMed6.0)進(jìn)行圖像分析。觀察視野內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值,半定量法評(píng)估,測(cè)得組織細(xì)胞平均灰度值愈小,其蛋白水平愈高。1.7.3反應(yīng)條件用Trizol法提取總RNA,于15μL反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,PCR擴(kuò)增目的基因HIF-1α、PDGF-A、PDGF-B及內(nèi)參基因β-actin片段。引物設(shè)計(jì)與合成:按GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索目的序列,Primer引物設(shè)計(jì)與分析軟件設(shè)計(jì)引物。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。反應(yīng)條件:94℃變性5min,循環(huán)采用94℃變性0.5min,56℃退火0.5min,72℃延伸0.5min,35個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10min。引物序列:HIF-1α上游5’-GTTTACTAAAGGACAAGTCACC-3’,下游5’-TTCTGTTTGTTGAAGGGAG-3’;PDGF-A上游5’-GAGATACCCCGGGAGTTGAT-3’,下游5’-AAATGACCGTCCTGGTCTTG-3’;PDGF-B上游5’-CCCACAGTGGCTTTTCATTT-3’,下游5’-GTGGAGGAGCAGACTGAAGG-3’;內(nèi)參(β-actin1)上游5’-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游5’-GCATTTGCGGTGGACGAT-3’;內(nèi)參(β-actin2)上游5’-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’,下游5’-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3’。以上PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析目的條帶的灰度值。1.8均數(shù)展望和分析方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用—x±s表示,多組均數(shù)的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LDS-t),相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1腎功能檢測(cè)結(jié)果見表12.2腎間質(zhì)纖維組織造模后12周,HE染色下假手術(shù)組腎小球結(jié)構(gòu)清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,基底膜完整,間質(zhì)中未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組腎小球纖維化、玻璃樣變,腎小管萎縮、消失,部分腎小管發(fā)生代償性擴(kuò)張,可見蛋白管型,腎間質(zhì)纖維組織增生明顯及大量淋巴細(xì)胞為主炎細(xì)胞浸潤(rùn);六味地黃湯組病理變化較模型組明顯減輕。Masson染色下假手術(shù)組腎小球、腎小管無異常,腎間質(zhì)無明顯膠原纖維;模型組腎小球硬化,腎小管數(shù)量明顯減少,腎間質(zhì)見大量的膠原纖維;六味地黃湯組腎間質(zhì)可見少量膠原纖維,纖維化程度明顯減輕。2.3免疫組化檢測(cè)結(jié)果2.3.1各組小鼠肝腎上皮細(xì)胞表達(dá)比較造模后12周,假手術(shù)組HIF-1α在腎小管上皮細(xì)胞均有微量表達(dá),模型組和治療組腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核中HIF-1α表達(dá)增加,尤以近曲小管表達(dá)明顯,腎小球未見明顯表達(dá)。2.3.2皮細(xì)胞漿和胞核中pdgf-a表達(dá)增加,小鼠肝腎組織pgf-a表達(dá),將pdgf-a造模后12周,假手術(shù)組PDGF-A的表達(dá)不明顯,模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核中的PDGF-A表達(dá)增加,腎小球表達(dá)不明顯。2.3.3血小板起源生長(zhǎng)因子b的出現(xiàn)造模后12周,假手術(shù)組PDGF-B表達(dá)不明顯,模型組和六味地黃湯組腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核中PDGF-B表達(dá)增加,腎小球微量表達(dá)。2.3.4兩組實(shí)證結(jié)果比較造模后12周,腎組織HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的表達(dá)在模型組最強(qiáng),六味地黃湯組次之,假手術(shù)組最弱。模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);六味地黃湯組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B蛋白水平均明顯低于模型組(P<0.01)。見表2。PDGF-A、PDGF-B與HIF-1α的蛋白水平呈正相關(guān)。2.4兩組患者血清中機(jī)制比對(duì)模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-BmRNA表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),六味地黃湯組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-BmRNA表達(dá)均明顯低于模型組(P<0.01),見圖1、表3。PDGF-A、PDGF-B與HIF-1αmRNA表達(dá)呈正相關(guān)。3雞雞mda的表達(dá)慢性腎功能衰竭(chronicrenalfailure,CRF)是各種腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的最終結(jié)局,其主要病理學(xué)特征為慢性腎臟纖維化。HIF-1是1992年Semenza等在低氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì),是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉(zhuǎn)錄因子。目前研究表明,缺氧環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)HIF-1α并促進(jìn)間質(zhì)纖維化,因此,HIF-1α可能是導(dǎo)致各器官纖維化的關(guān)鍵因子。PDGF是從血小板中分離出的一種重要的促有絲分裂因子,具有刺激特定細(xì)胞群分裂增殖的能力。PDGF家族至少有4個(gè)亞基,即PDGF-A、B、C、D,其中PDGF-A和PDGF-B是經(jīng)典的PDGF存在形式。已有研究表明,PDFG表達(dá)受HIF-1α的調(diào)控。Shin等在缺氧條件下體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞,HIF-1α表達(dá)增加并可上調(diào)PDGF的表達(dá),而在棘霉素阻斷HIF-1α后,PDGF表達(dá)也隨之下降。Mermis等通過研究HIV轉(zhuǎn)基因大鼠認(rèn)為病毒蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激依賴于HIF-1α上調(diào)PDGF-B的表達(dá)。Ishizuka等研究缺氧的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn),增加細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子水平可能減輕HIF-1α表達(dá),從而減輕缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和PDGF-B的轉(zhuǎn)錄。Mizuno等研究發(fā)現(xiàn),慢性缺氧導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓過程中,HIF-1α持續(xù)表達(dá),并可上調(diào)PDGF的表達(dá),促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖。另有研究表明,PDGF的表達(dá)與肝纖維化關(guān)系密切。Moon等通過結(jié)扎小鼠膽總管復(fù)制肝纖維化模型,發(fā)現(xiàn)野生型小鼠HIF-1α蛋白水平在術(shù)后3d明顯升高,而在HIF-1α基因敲除小鼠無明顯升高。在結(jié)扎后第7、14日分別檢測(cè)PDGF-A、PDGF-BmRNA,發(fā)現(xiàn)PDGF-A、PDGF-B基因表達(dá)水平在野生型小鼠較HIF-1α基因敲除小鼠增加更明顯。Copple等早期研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞缺氧可激活HIF-1α,后者調(diào)節(jié)PDGF-A、PDGF-B基因表達(dá),促進(jìn)肝纖維化。后來研究HIF基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的PDGF-B蛋白水平和基因表達(dá)均明顯減少,從而推測(cè)HIF還可能通過上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)PDGF-B,從而促進(jìn)纖維化。本研究采用的5/6腎切除法是目前研究CKD進(jìn)展的理想動(dòng)物模型。已有研究表明,5/6腎切除的大鼠腎臟組織中存在小動(dòng)脈病變,這種小動(dòng)脈病變可導(dǎo)致腎小球后毛細(xì)血管血流減少和小管間質(zhì)缺血,而缺血就意味著低氧。Manotham等研究顯示,5/6腎切除的大鼠模型在發(fā)生小管纖維化前,腎小管已存在明顯的缺氧。Zhang等經(jīng)研究5/6腎切除的大鼠模型同樣顯示,管周毛細(xì)血管丟失和腎小管間質(zhì)缺氧在腎間質(zhì)纖維化不明顯之前的早期階段(術(shù)后第3周)已經(jīng)很嚴(yán)重,并且持續(xù)存在于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展過程中。Zeng等發(fā)現(xiàn),HIF-1α在5/6腎切除大鼠腎組織中顯著升高,這一結(jié)果表明慢性缺氧存在于5/6腎切除大鼠模型。俞氏等研究5/6腎切除大鼠亦發(fā)現(xiàn),在早期階段(術(shù)后第1周末),HIF-1α在腎內(nèi)表達(dá)即開始增加,在術(shù)后12周仍有持續(xù)表達(dá)。本研究顯示:5/6腎切除術(shù)后12周,HE和Masson染色均顯示模型組存在明顯纖維化,且腎功能指標(biāo)均明顯異常,說明造模成功。模型組HIF-1α、PDGF-A和PDGF-B的蛋白水平和基因表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01),且PDGF-A、PDGF-B的表達(dá)和HIF-1α具有相關(guān)性(P<0.01),提示HIF-1α可能通過上調(diào)PDGF-A、PDGF-B的表達(dá)促進(jìn)腎臟纖維化。六味地黃湯是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑。其臨床療效肯定,然其具體作用機(jī)制尚未闡明,何氏等研究發(fā)現(xiàn),給5/6腎切除大鼠灌胃六味地黃湯8周后,其血清BUN、SCr的水平明顯低于模型組,并能減少留存腎系膜細(xì)胞的增生及間質(zhì)纖維化,