陜西茯磚茶中金花菌的分離與鑒定

陜西茯磚茶中金花菌的分離與鑒定

最早的沱磚茶是明初陜西茶商在陜西用陜西茶作為原料修建的緊壓茶。金色的細菌生長在他們的磚體內和周圍。人們通常稱之為“金華”菌。隨著“金花”菌的生長繁殖,其他微生物的生長會受到抑制,“金花”菌吸收茯磚茶上的營養(yǎng)物質進行代謝轉化,產(chǎn)生各種胞外酶和生物活性物質,賦予茯磚茶獨特的品質和功能,這正是茯磚茶不同于其它黑茶茶品的獨特之處。近幾年來受到人們的關注。對于茯磚茶中“金花”菌的研究多是以湖南、四川等地的茶樣為研究對象,而作為茯磚茶的發(fā)源地陜西,對陜西茯磚茶中“金花”菌的研究還鮮見報道。通過微生物經(jīng)典鑒定方法結合DNA序列對陜西茯磚茶中的“金花”菌進行研究。1材料和方法1.1茶葉測試陜西蒼山茶葉有限公司提供1.2鑒定培養(yǎng)基分離純化培養(yǎng)基:CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基;鑒定培養(yǎng)基:PDA、CZG(5%NaCl)、CZG(14%NaCl)、察氏瓊脂培養(yǎng)基、20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基。1.3czg菌懸液的稀釋、標準溶液及鏡檢無雜菌的培養(yǎng)稱取10g茯磚茶茶葉,加入到裝有90mL無菌水和玻璃珠的250mL的三角瓶中,充分震蕩10min。用滅過菌的移液管吸取1mL,按10倍進行梯度稀釋到102,103,104,105,106,將稀釋后的菌懸液涂布到CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基上,在28℃下培養(yǎng)。選擇適當稀釋濃度的菌落,進行劃線分離,28℃培養(yǎng)后挑取單菌落,多次劃線分離挑取單菌落后鏡檢無雜菌。將純化菌種轉接斜面保存。1.4培養(yǎng)單菌種在無菌條件下,取3環(huán)菌種到含玻璃珠的50mL的無菌水中,在28℃,150r/min震蕩10min,用無菌漏斗和脫脂棉過濾得單孢子懸液,培養(yǎng)時的單菌落便于準確測量菌落直徑,取0.1~0.2mL單孢子懸液分別接種到PDA,CZG(5%NaCl),CZG(14%NaCl),察氏瓊脂培養(yǎng)基,20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上進行涂布培養(yǎng)。在28℃培養(yǎng)觀察菌落的生長情況。1.5光學顯微鏡和掃描電鏡觀察在光學顯微鏡下對其菌體形態(tài)、繁殖特性進行觀察。從中挑取菌落、在表面刮取孢子干燥后常規(guī)制片在掃描電鏡下觀察。1.6測序結果及測序結果從CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基上生長的“金花”菌的菌絲中提取基因組DNA,進行ITS測序。ITS序列擴增采用引物ITS1和ITS4,測序工作由生工生物工程有限公司完成。2結果與分析2.1培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)“金花”菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1-A。在28℃培養(yǎng)3d后菌落直徑為0.6cm~0.7cm,菌落中間會長出黃色的閉囊殼,菌落為規(guī)則的圓形且密集。7d菌落直徑達1.5cm~1.6cm,從菌落中間開始顏色逐漸加深,變?yōu)楹诤稚?菌落邊緣培養(yǎng)基顏色也逐漸加深變?yōu)楹诤稚?。培養(yǎng)15d后菌落長滿平皿,在整個生長過程為有性生殖方式?！敖鸹ā本诟牧疾焓吓囵B(yǎng)基(含5%NaCl)上的菌落形態(tài)見圖1-B。菌絲為白色絲絨狀,之后再中間長出一個乳白色的點(大量菌絲生長在一起),隨著菌絲的延伸,乳白色也隨之長大,菌落顏色逐漸加深,由乳白色變?yōu)榈S色(閉囊殼長出)。3d后菌落直徑達1.4cm~1.6cm,黃色加深,中間密集且隆起,淡黃色變?yōu)榻瘘S色。7d后菌落平均直徑達2.5cm~2.7cm。在整個生長過程為有性生殖方式?！敖鸹ā本诓焓檄傊囵B(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1-C,培養(yǎng)3d后菌落直徑達0.4cm~0.6cm,培養(yǎng)7d后菌落直徑達2.5cm~2.7cm,菌落菌絲生長比較快,菌落表面會長出黃色的閉囊殼且閉囊殼比較稀疏,不像CZG(5%NaCl)培養(yǎng)基中閉囊殼那么密集。菌落邊緣培養(yǎng)基顏色較早變?yōu)楹诤稚??！敖鸹ā本诟牧疾焓吓囵B(yǎng)基(含14%NaCl)上的菌落形態(tài)見圖1-D。培養(yǎng)3d后菌落直徑達0.9cm~1.95cm,菌落未出現(xiàn)黃色,在菌落表面長出灰綠色的分生孢子,6d后菌落中間開始變黃長出閉囊殼。10d菌落直徑達2.4cm~2.5cm。在此培養(yǎng)基上“金花”菌的有性型與無性型同時存在?！敖鸹ā本?0%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)見圖1-E,菌落生長較快,28℃培養(yǎng)3d直徑達0.8cm~1.2cm,培養(yǎng)5d達1.8cm~2.2cm,8d長滿平皿。菌落比察氏瓊脂培養(yǎng)基黃色閉囊殼生長較多且密集。2.2網(wǎng)狀聯(lián)合現(xiàn)象在培養(yǎng)基上“金花”菌絲形態(tài)為絲絨狀。在光學顯微鏡下該菌的菌絲有橫隔是多細胞構造,具不規(guī)則分枝(圖2-A),菌絲之間有網(wǎng)狀聯(lián)合現(xiàn)象(圖2-B)。閉囊殼形成過程是在在受精體的上半部分產(chǎn)生一條彎管形的受精絲(圖2-C),受精絲與多核的雄器接觸后,雄器內的細胞質和細胞核通過受精絲進入產(chǎn)囊器內,同時在兩性器官表面生出許多纏繞在一起的菌絲將其包圍(圖2-D),形成初期的閉囊殼。2.2藥物代謝和子囊孢子釋放出多態(tài)性“金花”菌的有性世代會長出大量閉囊殼(圖3-A),閉囊殼表面為黃色,球形。在閉囊殼里面包裹有大量的子囊,閉囊殼破裂釋放出子囊(圖3-B),子囊近球形,每個子囊里面都含有8個子囊孢子(圖3-C),子囊孢子橢圓形或球形(圖3-D)?！敖鸹ā本臒o性世代會長出分生孢子(圖3-E),在菌絲頂端形成膨大的頂囊,依其部位有分生孢子梗,頂囊,小梗,分生孢子。分生孢子呈鏈,分生孢子球形或橢圓形(圖3-F)。2.3表面粗糙度b掃描電鏡下觀察到培養(yǎng)基上生長的閉囊殼,球形或近球形,直徑80μm~150μm,表面粗糙。閉囊殼破裂釋放出子囊(圖4-C),子囊球形或近球形,直徑10μm左右,子囊易釋放出子囊孢子,子囊孢子有兩個明顯的冠狀突起,子囊孢子大小為(4~5)μm×(5~6)μm。2.4“治療”pcr擴增結果將“金花”菌的ITS區(qū)域擴增的序列片段在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation數(shù)據(jù)庫上進行nucleotideblast比對,其結果為:“金花”菌的ITS片段為532bp與數(shù)據(jù)庫中的Eurotiumcristatum(ACCESSION:GU784865)相似度為100%。3形態(tài)鑒定原則雖然“金花”菌在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)表現(xiàn)出多樣性,但在相同的生殖方式上其菌體形態(tài)基本一致?！敖鸹ā本钱a(chǎn)生有性型和無性型的全型真菌,在通常條件下以有性生殖方式存在,其無性