人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量規(guī)范（征求意見稿）

ICS點(diǎn)擊此處添加ICS號點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號DB51Qualitycontrolandtechnicalspecificationsofhumandental-derivedmesenchymal1DBXX/XXXXX—XXXX 32規(guī)范性引用文件 33術(shù)語和定義 34縮略語 35技術(shù)要求 46檢測方法 57檢驗(yàn)規(guī)則 68廢棄物處理 72DBXX/XXXXX—XXXX本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省市場監(jiān)督管理局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省XXXXXX歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省干細(xì)胞技術(shù)與細(xì)胞治療協(xié)會、成都世聯(lián)康健生物科技有限公司牽頭，中國測試技術(shù)研究院生物研究所,XXXXXXXX。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：XXXXXXXX。3DBXX/XXXXX—XXXX人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量規(guī)范本文件規(guī)定了人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞的原輔料要求、細(xì)胞關(guān)鍵質(zhì)量屬性、細(xì)胞制備過程控制、細(xì)胞質(zhì)量檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和廢棄物處理要求。本文件適用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞的制備、檢測和質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T40365-2021細(xì)胞無菌檢測通則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞humandental-derivedmesenchymalstemcells從人不同發(fā)育階段牙齒組織或其附屬組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，包括牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、牙囊干細(xì)胞、脫落乳牙干細(xì)胞、根尖牙乳頭干細(xì)胞等，貼壁生長后呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，可在體外自我更新，并具有成骨分化、成脂分化能力的干細(xì)胞。3.2原材料rawandprocessedmaterial可用于分離各種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞的原始材料包括牙髓組織、牙囊組織、牙周膜組織乳牙牙髓組織、根尖組織等。3.3輔助材料accessorymaterial用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、運(yùn)輸、儲存等過程中的采集器械、容器、清洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長因子等。4縮略語下列縮略語適用于本文本EBV—人類皰疹病毒（Epstein-BarrVirus）HBV—乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV—人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV—丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV—人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HTLV—人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）4DBXX/XXXXX—XXXXSTR—短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）TP—梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）SOP—標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（StandardOperatingProcedure）5技術(shù)要求5.1原材料和輔助材料5.1.1原材料要求5.1.1.1用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料來源應(yīng)符合倫理規(guī)范和法律法規(guī)。5.1.1.2用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料供者應(yīng)簽署書面的合法有效的知情同意書；如原材料供者屬未成年人，知情同意書應(yīng)由供者及其法定監(jiān)護(hù)人共同簽署；知情同意書應(yīng)包括但不限于：人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞在合適的條件下潛在的研究及治療應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用、剩余材料的處置以及其他相關(guān)問題所適用的內(nèi)容；應(yīng)有明確的供者（如供者系未成年人，應(yīng)包括其法定監(jiān)護(hù)人）的個(gè)人隱私保護(hù)機(jī)制。5.1.1.3用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞分離的原材料應(yīng)建立原材料獲取方式、獲取途徑及相關(guān)臨床資料，包括但不限于供者一般信息、既往病史及家族史等。既往病史和家族史應(yīng)對遺傳性疾病相關(guān)信息進(jìn)行詳細(xì)采集。5.1.2輔助材料要求5.1.2.1用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞分離的采集器械、容器、清洗液、保存液、培養(yǎng)基、生長因子等輔料應(yīng)符合相關(guān)的質(zhì)量要求，應(yīng)包括但不限于供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證、產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告和批次檢驗(yàn)報(bào)告、質(zhì)量抽檢報(bào)告等。5.1.2.2用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，應(yīng)采用無動物源成分的培養(yǎng)基。5.1.2.3用于人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中如含有人源血液成分，應(yīng)明確其來源、批號及質(zhì)量檢定合格報(bào)告，原則上采用國家批準(zhǔn)的相關(guān)產(chǎn)品，如使用未經(jīng)批準(zhǔn)的人源血液相關(guān)制劑，則應(yīng)提供相應(yīng)的檢驗(yàn)檢測合格報(bào)告。5.1.3供者應(yīng)篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP，并記錄保存結(jié)果。5.2關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)5.2.1細(xì)胞形態(tài)人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下，細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)以梭形或紡錘形為主，細(xì)胞形態(tài)隨細(xì)胞密度可略有改變。5.2.2細(xì)胞標(biāo)志蛋白人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞CD105、CD73、CD90陽性率≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率≤2%。5.2.3細(xì)胞存活率未經(jīng)凍存的細(xì)胞活率≥90%，凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞活率≥80%。5.2.4免疫調(diào)節(jié)人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者TNF-α)誘導(dǎo)后可表達(dá)吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）；與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，能抑制T淋巴細(xì)胞增殖及IFN-γ、TNF-α分泌。5.2.5多向分化人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞具有成骨、成脂分化能力。5.2.6成瘤性人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性。5.2.7微生物5DBXX/XXXXX—XXXX真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應(yīng)為陰性。5.3質(zhì)量控制5.3.1原材料采集原材料相關(guān)的牙體組織、牙胚組織應(yīng)由具有口腔執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格的醫(yī)師在醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集完成；供者應(yīng)無牙體和牙髓病變。樣品采集后，應(yīng)置于無菌采集容器中密閉保存，并賦予唯一識別碼。5.3.2原材料運(yùn)輸原材料運(yùn)輸應(yīng)制定完整的SOP及應(yīng)急預(yù)案，運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；樣本運(yùn)輸全程應(yīng)有詳細(xì)的記錄，內(nèi)容包括但不限于運(yùn)輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時(shí)間、人員、地址及樣本信息，相關(guān)記錄入檔保留至少20年；運(yùn)輸溫度為2℃~10℃,運(yùn)輸時(shí)間不得超過12小時(shí)。5.3.3原材料接收原材料接收應(yīng)制定完整的接收SOP，原材料樣本接收人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；應(yīng)制定原材料接收信息記錄表及明確的原材料樣品接收標(biāo)準(zhǔn)，遵從安全與準(zhǔn)確的原則對樣本接收制定規(guī)范及應(yīng)急預(yù)案，并填寫相關(guān)記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年；原材料樣本接收后應(yīng)及時(shí)處理，對不能及時(shí)處理的樣本，應(yīng)保存在2℃~10℃條件下，最長時(shí)間不得超過12小時(shí)。5.3.4細(xì)胞分離與培養(yǎng)5.3.4.1細(xì)胞分離與培養(yǎng)應(yīng)制定完整的操作SOP；細(xì)胞分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)避免不同供體之間的交叉污染；同一供體牙體或牙胚組織分離多種細(xì)胞的，應(yīng)有完整的操作SOP，避免同一供體不同類型細(xì)胞之間的混淆或交叉污染。5.3.4.2細(xì)胞分離后擴(kuò)增培養(yǎng)過程中應(yīng)明確細(xì)胞的名稱、培養(yǎng)代次、操作時(shí)間、培養(yǎng)條件等詳細(xì)的操作記錄，相關(guān)記錄入檔保留至少20年。5.3.4.3細(xì)胞凍存應(yīng)制定完整的操作SOP，凍存的細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞名稱、培養(yǎng)代次、操作時(shí)間等信息；凍存細(xì)胞應(yīng)具有唯一識別碼，且可與供體、采集、分離、擴(kuò)增培養(yǎng)等信息相對應(yīng)；細(xì)胞凍存液應(yīng)采用國家已批準(zhǔn)的臨床級產(chǎn)品或藥品輔料，凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器氣相凍存；細(xì)胞凍存庫由專人負(fù)責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定，并定期巡檢并記錄。5.3.4.4細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)制定完整的操作SOP，復(fù)蘇的細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明細(xì)胞名稱、代次、批次、培養(yǎng)條件、操作人員、復(fù)蘇時(shí)間等信息。5.3.5細(xì)胞運(yùn)輸5.3.5.1細(xì)胞運(yùn)輸應(yīng)制定完整的操作SOP及應(yīng)急預(yù)案，運(yùn)輸人員應(yīng)是經(jīng)過培訓(xùn)合格的人員；根據(jù)干細(xì)胞的使用要求，選擇合適的承載細(xì)胞的容器、運(yùn)輸方式、運(yùn)輸條件、運(yùn)輸設(shè)備和運(yùn)輸路線，保證細(xì)胞的穩(wěn)定性和有效性。5.3.5.2運(yùn)輸條件的控制應(yīng)包括但不限于溫度控制、運(yùn)輸時(shí)間、無污染、運(yùn)輸設(shè)備性能和外包裝等。5.3.5.3細(xì)胞的運(yùn)輸應(yīng)全程記錄，包括但不限于細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆绞?、條件、路徑、時(shí)間、人員、地址及干細(xì)胞信息等，記錄入檔保存至少20年。5.3.5.4凍存細(xì)胞應(yīng)采用不高于-130℃的條件下運(yùn)輸，復(fù)蘇細(xì)胞或新鮮制劑應(yīng)在2℃~10℃條件下運(yùn)輸。6檢測方法6.1病原微生物檢測6.1.1無菌檢測參照《中華人民共和國藥典》無菌檢測法執(zhí)行，對樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測。細(xì)菌和真菌檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性。6DBXX/XXXXX—XXXX6.1.2支原體檢測參照《中華人民共和國藥典》支原體檢測法執(zhí)行，對樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測。支原體檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性。6.1.3細(xì)胞內(nèi)外源致病因子檢測采用核酸檢測法，對樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測,HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP檢測應(yīng)為陰性。6.2內(nèi)毒素檢測參照中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法執(zhí)行，對樣本采集、運(yùn)輸、分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇等生產(chǎn)制備環(huán)節(jié)進(jìn)行留樣（至少包括保存液、清洗液、培養(yǎng)基上清、細(xì)胞懸液、凍存液等）檢測。各類樣本中的內(nèi)毒素檢測值應(yīng)≤0.5EU/mL。6.3異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測采用流式細(xì)胞術(shù)或ELISA技術(shù)測定牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞對于活化的人總淋巴細(xì)胞的增殖和對不同淋巴細(xì)胞亞群增殖能力的影響，以及對淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)無異常增殖，細(xì)胞因子表達(dá)水平應(yīng)無異常增加。6.4致瘤性檢測采用免疫缺陷動物（裸鼠或SCID鼠通過局部皮下接種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞，評價(jià)人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞致瘤性。體內(nèi)致瘤試驗(yàn)嚴(yán)格遵照動物倫理要求執(zhí)行，單只小鼠接種人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量≥106個(gè)細(xì)胞，觀察期≥12周。人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)無致瘤性。6.5細(xì)胞活率檢測采用臺盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞存活率測定，各代數(shù)及批次人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞比例6.6細(xì)胞純度檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物以及人基因組DNA短片段重復(fù)序列（STR）測序進(jìn)行檢定。各代數(shù)及批次人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性/陰性比率應(yīng)符合要求，單一供者來源的細(xì)胞各代次及批次細(xì)胞STR檢測結(jié)果應(yīng)保持一致。6.7干細(xì)胞分化能力檢測體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、成骨細(xì)胞。成脂分化鑒定采用油紅O染色法鑒定，成骨分化鑒定采用茜素紅染色法鑒定。6.8染色體核型檢測采用G帶分析法進(jìn)行測定，人牙來源牙囊間充質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)量為46XX或46XY，染色體結(jié)構(gòu)無缺失、重復(fù)、斷裂、倒位、異位。7檢驗(yàn)規(guī)則7.1抽樣方法和數(shù)量在一個(gè)細(xì)胞制備周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一工藝、同一代次制備的細(xì)胞規(guī)定為一批；在同一批次制備的細(xì)胞中，隨機(jī)抽取3個(gè)最小包裝單元用于相關(guān)檢測檢驗(yàn)。7.2出庫檢驗(yàn)每批次細(xì)胞進(jìn)行出庫檢驗(yàn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括5.2中規(guī)定的所以項(xiàng)目，并附簽字蓋章的檢驗(yàn)報(bào)告。7.3復(fù)核檢驗(yàn)7DBXX/XXXXX—XXXX根據(jù)實(shí)際使用情況需要，細(xì)胞由具有相關(guān)資質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)/實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行獨(dú)立復(fù)核檢驗(yàn)。8廢棄物處理