高脂飼料配方及周齡對sd大鼠模型胰島素抵抗的影響

高脂飼料配方及周齡對sd大鼠模型胰島素抵抗的影響

高脂飲食、腹腔注射速尿素（stz）是目前廣泛使用的2型糖尿病模型的制備方法。該模型具有許多與臨床2型糖尿病類似的生化代謝及臨床特點,是研究2型糖尿病的較為理想的動物平臺。綜觀目前對于此種模型建立方法的研究報道,造模方法尚不統(tǒng)一,各位研究者采用的高脂飼料配方和造模動物周齡各不相同,導致研究結(jié)果難以復(fù)制或進行平行比較。因此,對于不同造模方法需要進行實驗研究進行比較,以篩選出最優(yōu)造模方法。前人研究中,關(guān)于造模采用的大鼠周齡以及飼料配方對于模型建立成功率影響的研究鮮有報道。為優(yōu)化造模方法,建立穩(wěn)定且成模率高的動物模型,本研究觀察不同配方的高脂飼料,以及不同周齡的大鼠對于該模型的造模成功率和模型病變特點的影響,以篩選出更適合建立此種模型的高脂飼料配方和大鼠周齡,為造模方法的優(yōu)化提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物及飼養(yǎng)清潔級雄性3周齡(剛斷乳)SD大鼠26只,體重(60±10)g;清潔級雄性5周齡SD大鼠26只,體重(120±10)g,來源于北京維通利華實驗動物中心[SCXK(京)2006-0001],飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心[SYXK(京)2006-0012],室溫20℃~25℃,相對濕度50%~60%,并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。1.2主要成分的熱量比普通飼料和高脂飼料均由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所加工提供。高脂飼料配方一:豬油18%、蛋黃粉10%、大豆油2%、蔗糖10%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.7%、糊精9%、纖維素7.5%、膽堿0.3%、多維預(yù)混料0.1%、多礦預(yù)混料0.8%、膽酸鈉0.3%。配方中主要成分提供的熱量比為:豬油35.8%、蛋黃粉15.4%、大豆油4.3%、蔗糖9.6%、酪蛋白17.3%、淀粉17.6%。高脂飼料配方二:豬油12%、蛋黃粉10%、大豆油2%、花生5%、奶粉5%、蔗糖8%、酪蛋白20%、蛋氨酸0.3%、淀粉21.2%、糊精7%、纖維素7.5%、食鹽0.5%、膽堿0.3%、多維預(yù)混料0.1%、多礦預(yù)混料0.8%、膽酸鈉0.3%。配方中主要成分提供的熱量比為:豬油24.5%、蛋黃粉15.6%、大豆油4.4%、花生6.8%、奶粉5.9%、蔗糖7.8%、酪蛋白17.6%、淀粉17.4%。1.3試劑檸檬酸(批號:0602102),檸檬酸鈉(批號:20070403),購自北京化學試劑公司;STZ,Sigma公司。1.4stz配置配制0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,調(diào)節(jié)pH為4.4;配制1%STZ溶液,溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,在冰浴中操作。1.5動物分組m組按體重將26只3周齡大鼠隨機分為3組:正常一組(N1組)、模型一組(M1組)和模型二組(M2組),其中N1組6只動物,M1組和M2組每組各10只動物。按體重將26只5周齡大鼠隨機分為3組:正常二組(N2組)、模型三組(M3組)和模型四組(M4組),其中N2組6只動物,M3組和M4組每組各10只動物。1.6高脂飼料配方模型N1組和N2組給予普通飼料。各模型組大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。其中M1組和M3組給予高脂飼料配方一喂養(yǎng),M2組和M4組給予高脂飼料配方二喂養(yǎng)。4周后,各模型組大鼠腹腔注射STZ溶液35mg/kg;正常組腹腔注射同等劑量0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測定空腹血糖(FBG),并進行口服葡萄糖耐量試驗(oralglucosetolerancetest,OGTT),凡空腹血糖值≥7.8mmol/L者納入實驗。1.7指標檢測1.7.1血糖、血脂指標檢測各組動物在給予高脂飼料前、注射STZ前及注射STZ4周后(處死前)測量體重、24h攝食量、飲水量;注射STZ前1d各組經(jīng)尾靜脈采血測定空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIN)、總膽固醇(TG)、甘油三酯水平(TC)。注射STZ后,各組動物每周測定FBG一次。STZ注射后7d以及STZ注射4周后各組大鼠測定OGTT。STZ注射4周后,經(jīng)腹主動脈取血檢測FBG、FIN、TG、TC水平,并處死所有動物。血糖采用美國強生公司的Onetouch隨手測血糖儀及血糖試紙測定。血清胰島素采用中國原子能科學研究院I1252胰島素放射免疫分析藥盒測定,用大鼠標準品繪制標準曲線。血清TC、TG由全自動生化分析儀完成測定。1.7.2葡萄糖曲線下面積大鼠禁食15h后,灌胃給予20%的葡萄糖溶液2g/kg。檢測0min及葡萄糖灌胃后30、60、120min的血糖,計算葡萄糖曲線下面積(AUC)=(血糖值0min+血糖值30min)×0.5/2+(血糖值30min+血糖值60min)×0.5/2+(血糖值60min+血糖值120min)×1/2。1.8統(tǒng)計方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)用表示,組間比較用one-wayANOVA方差分析。2結(jié)果2.1動物體重和stz4周后給予高脂飼料前,各模型組大鼠與各自對照的正常組大鼠的體重水平無明顯差異(P>0.05);注射STZ前,M1組和M3組動物體重均顯著低于各自對照組水平(P<0.01),M2組和M4組動物體重均顯著高于各自對照組水平(P<0.01);注射STZ4周后,M1組和M3組動物體重均顯著低于各自對照組水平(P<0.01),M2組和M4組動物體重與各自對照組相比無明顯差異(P>0.05)。詳見表1。2.2動物24h攝食量和飲水量給予高脂飼料前,各模型組大鼠與各自對照的正常組大鼠的24h攝食量和飲水量水平無明顯差異(P>0.05);注射STZ前,M1組和M3組動物的24h攝食量均顯著低于各自對照組水平(P<0.01),M2組和M4組動物的24h攝食量均明顯高于各自對照組水平(P<0.05);注射STZ后4周,M1組和M3組動物的24h攝食量均顯著低于各自對照組水平(P<0.01),M2組和M4組動物的24h攝食量均顯著高于各自對照組水平(P<0.01);各模型組大鼠的24h飲水量均顯著高于各自對照組水平(P<0.01)。詳見表2。2.3stz分次注射前后血糖水平變化的變化見表1、表4M1組和M2組的動物在注射STZ后FBG水平先升高后降低,在STZ注射后2周時達到最高值然后逐漸降低,至STZ注射后4周觀察結(jié)束時仍呈下降趨勢,因此認為此兩組動物的FBG水平在STZ注射后4周內(nèi)尚不穩(wěn)定。M3組和M4組的動物在注射STZ后FBG水平先升高,在STZ注射后2周時達到高值,至STZ注射后4周觀察結(jié)束時一直處于比較穩(wěn)定的狀態(tài),因此認為此兩組動物的FBG水平在STZ注射后2周即達到穩(wěn)定狀態(tài)。M1、M2、M3組的FBG水平在STZ注射后3周均明顯低于M4組水平(P<0.05);在STZ注射后4周均顯著低于M4組水平(P<0.01)。見表3。2.4動物tg、tc、fin水平的比較注射STZ前,M2組和M4組動物的FIN、TG和TC水平均顯著高于各自對照組水平(P<0.01),M1組和M3組動物的TG水平均顯著高于各自對照組水平(P<0.01);注射STZ4周后,M2組和M4組動物的FIN水平均明顯高于各自對照組水平(P<0.05),TG和TC水平均顯著高于各自對照組水平(P<0.01),M1組和M3組動物的TG水平均顯著高于各自對照組水平(P<0.01)。詳見表4。2.5造模成功率各模型組大鼠成功建立2型糖尿病模型的比率如下:M1組10只大鼠,6只造模成功,造模成功率為60%;M2組10只大鼠,6只造模成功,造模成功率為60%;M3組10只大鼠,7只造模成功,造模成功率為70%;M4組10只大鼠,9只造模成功,造模成功率為90%。2.6兩組對照組水平比較注射STZ后7d及注射STZ后4周,所有模型動物的AUC值均顯著高于各自對照組水平(P<0.01);注射STZ后4周,M1組和M2組的AUC值均顯著低于M4組水平(P<0.01),M3組的AUC值明顯低于M4組水平(P<0.05)。見表5。3大鼠周齡模型的建立流行病學的研究提示,高糖、高脂肪的高熱量飲食,會誘發(fā)IR,增加患2型糖尿病的風險,是2型糖尿病發(fā)病的重要因素。這種高熱量飲食可減弱胰島素抑制肝糖輸出的能力,并影響葡萄糖刺激胰島細胞的胰島素分泌。本研究觀察了不同配方的高糖高脂飼料,以及不同周齡的大鼠對于該模型的造模成功率和模型病變特點的影響,以篩選出更適合建立此種模型的高脂飼料配方和大鼠周齡,改進造模方法。本研究結(jié)果提示,高脂喂養(yǎng)合并腹腔注射小劑量STZ制備2型糖尿病大鼠模型,選取5周齡SD大鼠較為適合,其FBG水平在注射STZ后兩周即可達到穩(wěn)定狀態(tài),并維持在較高的水平;高脂飼料配方二更容易被動物接受,攝食量和體重增加明顯,并且成功誘導出IR,更加符合2型糖尿病模型的要求。選取5周齡SD大鼠作為模型動物,并給予配方二高脂飼料喂養(yǎng),所建立的大鼠模型血糖、胰島素以及血脂譜(TC、TG)均明顯升高,具備高血糖、高胰島素血癥、血脂異常等2型糖尿病的主要特征,是值得推廣的2型糖尿病動物模型。綜觀目前的研究報道,對于建立此種模型采用的大鼠周齡鮮有研究者進行探討,大鼠周齡的選擇范圍較大,從斷乳(約出生后3周)到8周齡均有報道。大鼠的生長和發(fā)育特性隨周齡不同而存在較大差別,對環(huán)境因素(如營養(yǎng)因素)的反應(yīng)也不同。有研究者認為,剛斷乳的大鼠未接受過普通飼料飼養(yǎng),對于高脂飼料更加易于接受,因此認為采用剛斷乳或斷乳不久的大鼠進行實驗效果較好。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),3周齡的大鼠與5周齡的大鼠相比,對于同種高脂飼料的24h進食量無明顯差異,血清FIN、TG和TC水平無明顯差異。但兩組給予不同高脂飼料的3周齡大鼠與兩組5周齡大鼠相比,造模成功率明顯低于5周齡大鼠,并且造模后4周內(nèi)其FBG水平明顯低于5周齡大鼠。兩組3周齡大鼠的FBG水平在造模后4周內(nèi)均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在觀察時間內(nèi)FBG水平未達到穩(wěn)定狀態(tài)。認為可能與幼齡動物處于生長發(fā)育的高峰期,對于外界干預(yù)損傷的自愈能力較強有關(guān)。但是作為模型動物,在沒有藥物及其他干預(yù)的情況下,FBG水平在較長的時期內(nèi)一直處于波動狀態(tài),是不利于進行藥物干預(yù)研究的。本研究結(jié)果提示,5周齡大鼠是較為適合的造模動物,其FBG水平在注射STZ后兩周即可達到穩(wěn)定狀態(tài),即可進行藥物干預(yù)研究。目前的文獻報道中大多是在普通飼料中添加10%~20%左右的脂肪,5%~20%左右的蔗糖,另有研究者添加雞蛋、花生、奶粉、食鹽等。飼料中脂肪比例增加是形成肥胖和胰島素抵抗的重要環(huán)境因素。文獻報道,脂肪熱卡從10%增加到59%,碳水化合物由69%降至20%,4周內(nèi)可以觀察到大鼠體內(nèi)脂肪堆積,外周組織和肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗,體內(nèi)葡萄糖利用率下降超過50%。但是,脂肪含量過高的高脂飼料存在難以干燥、質(zhì)軟易碎、口感較差的缺點。配方一中含有18%的豬油,飼料易碎,約有1/3的飼料都是碎末或渣滓而無法使用。食用此種飼料的兩組大鼠24h攝食量均顯著低于正常飼料組和配方二組,且大鼠體重增長緩慢,體重顯著低于同周齡的正常飼料組和配方二組動物。檢測結(jié)果提示,服用配方