益腎護骨方對sd大鼠尿酸、股骨生物力學及脛骨組織形態(tài)計量學指標的影響

益腎護骨方對sd大鼠尿酸、股骨生物力學及脛骨組織形態(tài)計量學指標的影響

廢用性骨質(zhì)疏松癥屬于復發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。本病可因運動功能受限或障礙所致,也可因神經(jīng)、肌肉、骨骼系統(tǒng)損傷或術后長期制動所引起。廢用性骨質(zhì)疏松癥給患者帶來諸多麻煩,如疼痛、易發(fā)病理性骨折、肢體功能障礙等一系列并發(fā)癥。本病已引起醫(yī)學工作者們的廣泛關注,國內(nèi)外學者在探討本病病因、發(fā)病機理和防治措施方面做了大量的深入的研究。然而對于益腎活血中藥對廢用性骨質(zhì)疏松動物模型的血尿生化、骨組織形態(tài)學、生物力學的影響這一最重要的研究目前鮮見。本實驗研究不同劑量益腎護骨方對廢用性骨質(zhì)疏松動物模型骨組織的血尿生化、股骨生物力學及脛骨骨組織形態(tài)計量學指標的影響,本研究為臨床治療廢用性骨質(zhì)疏松和學科交叉研究益腎活血中藥防治廢用性骨質(zhì)疏松提供新思路。1材料和方法1.1動物分組、溫度設定3月齡SD大鼠70只,雌雄不限,由江蘇大學實驗動物中心提供。動物合格證:SCXK(蘇2009-0002),發(fā)證機關是江蘇省實驗動物管理委員會。動物分組后置于溫度23℃～26℃,相對濕度55%～70%,自然光照、隔音的動物室內(nèi),動物自由飲水、進食。大鼠喂食標準混合飼料。1.2特效藥1.2.1益腎護骨處方和劑量鹿角片10g,補骨脂10g,骨碎補10g,淮牛膝15g,熟地15g,當歸15g,白芍15g,川芎10g。1.2.2含骨碎補總黃酮有效成分購買自北京岐黃制藥有限公司,每粒膠囊0.25g,含骨碎補總黃酮有效成分0.18g。使用時加蒸餾水制成一定濃度溶液,2.5g/100mL,給大鼠灌胃給藥。1.3各組大鼠坐骨神經(jīng)切斷術組的分組動物實驗室適應性喂養(yǎng)1周,再按照體重排序后,按隨機數(shù)字表分別將大鼠分為7組,即A組-正常對照組、B組-假手術組、C組-模型組、D1組-益腎護骨方高劑量組(相當于成人劑量的20倍)、D2組-益腎護骨方中劑量組(相當于成人劑量的10倍)、D3組-益腎護骨方低劑量組(相當于成人劑量的6.25倍)、E組-陽性藥物強骨膠囊對照組,每組10只。C組、D1組、D2組、D3組、E組行右后肢坐骨神經(jīng)切斷術,B組的手術過程只分離顯露坐骨神經(jīng)后縫合切口。A組只作參照飼養(yǎng)。1.4帶骨神經(jīng)的傳統(tǒng)消毒大鼠用10%水合氯醛以3mL/100g行腹腔麻醉后,剔除右側臀部、大腿部及尾部近段的毛,再將大鼠俯臥位固定于事先制作的手術臺上,以碘伏消毒剃毛區(qū),鋪巾,定位髖關節(jié)后側,切口沿大腿縱軸方向長約2cm,切口皮膚及皮下筋膜,暴露股二頭肌,切斷二頭肌暴露坐骨神經(jīng),于近髖處用銳利刀片切除坐骨神經(jīng),長約5mm,并將神經(jīng)斷端打結處理以預防斷端包塊的形成,逐層縫合切口。肌注慶大霉素0.1mL,以預防感染。每天用酒精棉球和碘酒擦拭傷口,直至傷口愈合。1.5組不同造模后重新灌胃造模后第2天分別予以藥物干預,灌胃給藥4周,每日1次,給藥情況如下:A組:正常飼料喂養(yǎng),自由飲水。B組:正常飼料喂養(yǎng),自由飲水。C組:造模后第2天予以藥物組同體積的生理鹽水灌胃。D1組:造模后第2天予以益腎護骨方52g/kg體重灌胃。D2組:造模后第2天予以益腎護骨方26g/kg體重灌胃。D3組:造模后第2天予以益腎護骨方16.25g/kg體重灌胃。E組:造模后第2天予以強骨膠囊0.25g/kg體重灌胃。以上各組灌胃液體量為10mL/kg體重,其濃度及等效劑量按體重折算。1.6測試指標1.6.1酸酶及免疫酶聯(lián)法使用全自動生化分析儀測定尿肌酐(Cr)、血堿性磷酸酶(ALP)指標,尿羥脯氨酸(HOP)用對二甲氨苯甲醛法測定,血清骨鈣素(BGP)用放射免疫法測定,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)用免疫酶聯(lián)法。1.6.2材料點彎曲實驗取出股骨標本,生理鹽水沖洗干凈,自凝樹脂將樣本兩端固定于統(tǒng)一包埋深度。將樣本固定于實驗夾上,進行三點彎曲實驗。在BOSE3510萬能材料實驗機上,在變形率為2mm/min恒定作用下對股骨標本施加載荷,股骨標本中點上方有一個壓桿。記錄股骨斷裂過程中力與位移曲線。1.6.3遠側干端骨組織形態(tài)檢測取各組右脛骨近側三分之一段,10%中性甲醛固定24～48h,10%中性EDTA液4℃～8℃脫鈣,冠狀對剖,70%、80%、90%酒精順濃度梯度脫水,組織浸蠟,石蠟包埋,5μm切片,HE染色和Masson染色,鏡下觀察股骨遠側干骺端骨組織形態(tài)改變。光學顯微鏡下觀察,取10×10倍下骨骺線下緣一視野,測節(jié)點數(shù)和游離末端數(shù)。1.7數(shù)據(jù)處理和分析統(tǒng)計分析采用SPSS11.5軟件包,所有數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗,呈正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)(xˉ±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間相互比較采用LSD分析,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1大鼠患下肢癟行問題實驗中無動物意外死亡,觀察各時間段內(nèi)大鼠體重增長基本正常。部分大鼠手術切口紅腫,經(jīng)消毒等處理后愈合良好,縫線自行脫落。C組、D1組、D2組、D3組、E組大鼠造模后即出現(xiàn)患肢跛行,至處死仍不能恢復,但均可以三個肢體行走及正常覓食。B組術后1周內(nèi)即可恢復四個肢體行走及正常覓食。2.2腎護骨方劑對血液中alp、bgs、trach和尿丙酮c的影響2.2.1各組大鼠血bgp的比較C組血BGP與B組相比顯著降低(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,與C組比較,D1組、D2組、D3組血BGP顯著升高(P<0.01)。2.2.2各組血alp、b的比較C組血ALP與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,D1組、D2組、D3組血ALP與C組相比顯著降低(P<0.01)。2.2.3各組大鼠血tracp的比較C組血TRACP與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,與C組比較,D1組、D2組、D3組血TRACP顯著降低(P<0.01)。2.2.4尿hop/cr檢測C組尿HOP/Cr與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,與C組比較,D1組、D2組、D3組尿HOP/Cr顯著降低(P<0.01)。2.3兩組最大載荷對比C組股骨最大載荷與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,D1組、D2組、D3組最大載荷與C組相比顯著降低(P<0.01)。C組彈性模量與B組相比顯著升高(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,D1組、D2組、D3組彈性模量與C組相比顯著降低(P<0.01)。2.4腎護骨方法對脛骨組織形態(tài)的觀察和骨小梁形狀的計量學的影響2.4.1金礦化株的篩選Masson染色:松質(zhì)骨部分,C組以藍色為主,表明骨基質(zhì)中礦物成分喪失,骨基質(zhì)向礦化骨樣組織轉化受抑制;D1組、D2組、D3組及E組則大部呈相互移行的紅色區(qū)域,表明該處骨基質(zhì)礦化良好。(見插頁Ⅰ圖5～8)。2.4.2益腎護骨方對脛骨組織骨小梁形態(tài)計量學的影響C組骨小梁節(jié)點數(shù)與B組相比顯著減少(P<0.01),而游離末端數(shù)顯著增多(P<0.01),予以益腎護骨方干預后,D1組、D2組、D3組骨小梁節(jié)點數(shù)與C組相比顯著增多(P<0.01),而游離末端數(shù)顯著減少(P<0.01)。3中醫(yī)藥干預廢用性皮質(zhì)從中藥理學角度的探索與研究總結歷代醫(yī)家所論,骨質(zhì)疏松發(fā)生與腎的關系最為密切,其病機關鍵在于各種原因所至的腎虛,因腎為先天之本,主骨生髓,腎精虧虛則骨無以充,使骨礦含量下降,骨密度降低而導致骨質(zhì)疏松。體內(nèi)、體外實驗證實,應用中醫(yī)“腎精不足、髓虧骨痿”理論,從補腎理論出發(fā),運用補腎中藥治療骨質(zhì)疏松,發(fā)現(xiàn)補腎中藥能促進成骨細胞和抑制破骨細胞的雙向調(diào)節(jié)作用。對于骨質(zhì)疏松癥的主要病機,形成了腎虛為本、血瘀為標的普遍認識。血瘀既是病理產(chǎn)物,又是致病因素,先后天因素均可致腎虛,腎虛是骨質(zhì)疏松癥的主要原因和機理,腎虛可促進血瘀的發(fā)生發(fā)展,血瘀又加重腎虛。所以,治療骨質(zhì)疏松歷代醫(yī)家多數(shù)均從補腎活血入手。目前,雖然借助現(xiàn)代科學技術對廢用性骨質(zhì)疏松癥病因、病理的分子生物、生物力學等方面有了較深入的進展,但從西藥治療方面來看,目前仍無長足進展。雖然對原發(fā)性骨質(zhì)疏松有很多有效方案可以選擇,但缺乏有效的治療方案治療廢用性骨質(zhì)疏松。國內(nèi)有少數(shù)學者從中醫(yī)藥的角度出發(fā),試圖運用中醫(yī)藥對廢用性骨質(zhì)疏松進行干預治療,為中醫(yī)藥防治廢用性骨質(zhì)疏松提供理論依據(jù)。查閱文獻發(fā)現(xiàn)運用中醫(yī)藥對廢用性骨質(zhì)疏松進行干預的文獻鮮見,中醫(yī)藥對骨質(zhì)疏松的研究以補腎填精為主要治療原則。益腎護骨方是作者在長期臨床工作中總結歸納的經(jīng)驗方。益腎護骨方由鹿角片、補骨脂、骨碎補、淮牛膝、熟地、當歸、白芍、川芎等中藥組成。鹿角片為血肉有情之品,溫補腎陽,為君;補骨脂、骨碎補補肝腎、強筋骨,為臣;熟地補腎陰,陰中求陽,添精益髓,為佐藥;淮牛膝,善引諸藥下達腰膝,不僅能補肝強筋骨,尚能在滋膩之群中輕疏靈動,通調(diào)經(jīng)脈而活血祛瘀,兼有“調(diào)血”之職,為使藥。當歸、白芍、川芎養(yǎng)血活血止痛。總之,益腎護骨方既著重補腎氣、溫腎陽,兼顧滋補腎陰精,以冀陰中求陽,陰陽互生;另外補益的同時,加用牛膝等通經(jīng)化瘀活絡之品,標本兼顧,補而不滯,通而不傷其正。廢用性骨質(zhì)疏松癥是骨代謝失調(diào)所致的結果,骨代謝異常,主要表現(xiàn)為骨吸收與骨形成的平衡失調(diào)。本研究結果顯示,益腎護骨方干預后,與模型組相比,血ALP、血TRACP及尿HOP/Cr較模型組明顯降低(P<0.01),血BGP較模型組明顯升高(P<0.01),說明益腎護骨方有抑制骨過渡轉化,促進成骨細胞活性,抑制成骨細胞破壞的作用。骨的生物力學特性是對骨量、骨質(zhì)量、骨結構等的綜合體現(xiàn),骨的生物力學特性最能直接反映骨組織的抗骨折能力,而這種抗骨折能力是骨組織所具備的主要功能的基礎。骨的生物力學性能的評定不僅是評價骨質(zhì)量和強度的主要方法,也是評價骨質(zhì)疏松癥的最佳方法之一。本研究結果顯示,益腎護骨方干預后,與C組相比,股骨最大載荷及彈性模量均較模型組明顯升高(P<0.01),說明益腎護骨方有提高提高骨組織力學性能,增強股骨抗骨折能力的作用。骨形態(tài)學是評價骨吸收及骨形成的有效手段,研究骨小梁的微構筑,即對骨小梁節(jié)點數(shù)和游離末端數(shù)的定量研究,不僅對骨質(zhì)疏松癥的診斷、骨折風險預測和藥物療效評定具有較大的參考價值。本研究結果顯示,益腎護骨方干預后,改善了骨小梁微構筑,促進骨基質(zhì)的礦化,且與C組相比,骨小梁節(jié)點數(shù)和游離末端數(shù)均有明顯的增加(P<0.01),說明益腎護骨方能改善骨小梁微構筑,增強骨力學結構。本實驗通過從骨代謝生化指標、骨生物