核酸定量測定磷法

實(shí)驗(yàn)七核酸的定量測定—定磷法

一,原理生物體內(nèi)有許多含磷化合物，如核酸（RNA,DNA）磷脂，ATP等。磷的測定方法很多，但在生化研究中以比色法的應(yīng)用最為廣泛，該法量微，快速，準(zhǔn)確。

核酸和核苷酸均為含鱗化合物，純的核酸喊磷量為9%（RNA含磷量為8.5%--9.0%,DNA則含9.2%的磷）。從核酸中測得了總磷量，就可知樣品中核酸的量，即每測得1mg有機(jī)磷，就表示有11mg的核酸，這就是定磷法的理論依據(jù)

在測定過程中，濃硫酸與核酸共熱使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷（此為消化過程），而無機(jī)磷與定磷試劑中的鉬酸銨在酸性條件下反應(yīng)生成磷鉬酸銨，它在還原劑作用下被還原成深藍(lán)色的鉬藍(lán)（高價(jià)鉬被還原成低價(jià)鉬），鉬藍(lán)在660nm初有最大光吸收峰。在一定的磷濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與磷含量成正比生物有機(jī)磷材料中有時(shí)含有無機(jī)磷雜質(zhì)，為了消除無機(jī)磷的影響，應(yīng)同時(shí)測定樣品中的總磷量和樣品中的無機(jī)磷含量（樣品未經(jīng)消化而直接測定的含磷量）。從總磷量中減去無機(jī)磷量，才是樣品中的真正磷含量。

核苷酸的消化和核酸一樣。此外嘌呤類核苷酸可用1.5mol/L的HCL，100℃水解1小時(shí)脫磷；嘧啶類核苷酸可用10mol/L消化1—2個(gè)小時(shí)脫磷。二，試劑

1.標(biāo)準(zhǔn)磷試劑（含磷5μg/ml）:準(zhǔn)確稱取恒重（105℃）的0.4389g,用水定容到100ml，此液的濃度為1mg/ml，用前再稀釋200倍，即為5μg/ml。

2.定磷試劑：

(1)6mol/L硫酸：取17ml濃硫酸（比重1.84）緩緩加入83ml水中。

(2)2.5%鉬酸銨：2.5g鉬酸銨溶于100ml水中

(3)10%抗壞血酸溶液：取10g抗壞血酸溶于100ml水中。棕色瓶4℃貯藏。溶液應(yīng)為淡黃色，深黃色或棕色則不能用。3.催化劑：硫酸銅（）：硫酸鉀（）=1：4（W/W）,研成細(xì)末。4.30%過氧化氫，濃硫酸

三，操作方法

1.制作磷標(biāo)準(zhǔn)曲線：取標(biāo)準(zhǔn)磷酸溶液（5μg/ml）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，用水補(bǔ)足到3ml，含磷量分別為0，2.5，5，7.5，10，12.5，15μg，加定磷試劑3ml后搖勻，45℃放置20分鐘，測。以含磷量為橫坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.核酸中總磷量的測定：取1ml被測樣品液（約含2.5—5mg核酸，也可取固體樣品），置于消化瓶中，加入1ml濃硫酸及50mg催化劑，在消化爐上加熱至發(fā)白煙，樣品由黑變成淡黃色，取下稍冷，加數(shù)滴30%過氧化氫液，繼續(xù)加熱至

溶液呈無色可淡藍(lán)色為止，稍冷卻，加1ml水，于100℃加熱10分鐘使焦磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿?。冷至室溫，用蒸餾水定容到50ml。與樣品消化的同時(shí)做空白對(duì)照，空白瓶中不加樣品，用水替代，其它完全相同。取稀釋后的消化液1ml，加水2ml，定磷試劑3ml，搖勻，45℃放置20分鐘，于660nm處讀取OD值。空白對(duì)照同樣操作。

3.樣品中無機(jī)磷含量測定：取未消化的核酸樣品液1ml用水定容到50ml。從中取1ml，加2ml水，3ml定磷試劑，搖勻后保溫，然后讀

四，結(jié)果

首先制作標(biāo)準(zhǔn)磷曲線，以消化和未消化的樣品中的從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各自對(duì)應(yīng)的磷含量。計(jì)算樣