第九章 DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化

第九章DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化

本章重點：內(nèi)切酶、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化。本章難點：酶切片段的多態(tài)性、基因的重組。1概述一、重組DNA技術(shù)的建立

1971年，Smith等人從細菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時代的開始。

1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒SV40和λ噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來得到新的重組DNA分子。

1973年，

Cohen和Boyer等(美國斯坦福大學(xué))進一步將酶切后的DNA分子與質(zhì)粒DNA連接起來，即將大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA（含卡那霉素抗性基因）和大腸桿菌pSC101質(zhì)粒DNA（含四環(huán)素素抗性基因）重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.cloi細胞中，產(chǎn)生同時表現(xiàn)出兩種抗性的細菌。

Berg、Cohen和Boyer等人的工作是世界上第一次實現(xiàn)DNA體外重組，建立了第一個基因克隆系統(tǒng)（質(zhì)?！竽c桿菌），導(dǎo)致了一個全新的生物技術(shù)學(xué)科和產(chǎn)業(yè)即基因工程的誕生。2二、基因工程發(fā)展和應(yīng)用

基因工程的誕生打破了物種的界限，實現(xiàn)了物種間的基因交流，在實驗室里對生物直接進行改造，為生命科學(xué)的研究開辟了新的領(lǐng)域、注入了新的方法，為提高人類的生活質(zhì)量和健康水平開辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。

1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準，用基因工程在細菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。

1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。

1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。

1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬公頃，1997年為1100萬公頃，1998年為2780萬公頃，1999年達到3990萬公頃，2000年達到4420萬公頃，2001年達到5260萬公頃，2002年達到5000萬公頃。32001年種植面積已超過100萬公頃的作物有：大豆（3330萬hm2，占全世界轉(zhuǎn)基因作物的63%，均為抗除草劑大豆）、玉米（980萬hm2，占19%）、棉花（680萬hm2，占13%）、油菜（270萬hm2，5%）；其它還有水稻、小麥、花生、向日葵、亞麻、甘藍、馬鈴薯等，番茄、煙草、南瓜和木瓜等50多種轉(zhuǎn)基因作物已實現(xiàn)商品化。

主要分布在美國（3570萬hm2）、阿根廷（1180萬hm2）、加拿大（320萬hm2）和中國（150萬hm2）等國。

我國（2001年）的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木已達22種，其中轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麥等進行了田間試驗，轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)大規(guī)模商品化生產(chǎn)。4當(dāng)前情況：與1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化時相比，當(dāng)前全球轉(zhuǎn)基因作物總面積已增加了100倍以上，2013年已達1.75億公頃，超過了中國農(nóng)田的總面積。全球批準商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物有27種，其中最主要四種是大豆、玉米、棉花和油菜。美國超市中有70%的產(chǎn)品含有轉(zhuǎn)基因成分。事實上全球食用過轉(zhuǎn)基因食品的人群達幾十億。有幾億人大量食用已經(jīng)超過十年。美國是世界上大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因作物最早的國家，2013年已經(jīng)種植了7010萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物。巴西是種植轉(zhuǎn)基因作物最多的發(fā)展中國家，2013年種植面積已超過4000萬公頃，居世界第二。2013年中國種植了420萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物，主要是棉花，和幾千公頃抗病毒的木瓜，現(xiàn)在居世界第六。中國原來是世界第二，現(xiàn)在已經(jīng)被其他國家趕超了。目前歐盟基于科學(xué)評價，認為“生物技術(shù)，特別是轉(zhuǎn)基因技術(shù)，并不比傳統(tǒng)育種技術(shù)危險。”全球有69個國家要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標(biāo)識，中國是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識最多的國家。5三、基因工程的概念

基因工程或遺傳工程，是將分子遺傳學(xué)的理論與技術(shù)相結(jié)合，用來改造、創(chuàng)建動、植物新品種，工業(yè)化生產(chǎn)生物產(chǎn)品，診斷和治療人類遺傳疾病的一個新領(lǐng)域。

基因工程：是一種DNA重組技術(shù)，在分子水平上進行遺傳操作，按設(shè)計的藍圖，從供體中提取或人工合成目的基因，令其與載體構(gòu)建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細胞，目的基因在細胞中表達獲得新的遺傳性狀。

基因工程的基本操作程序為：獲取目的基因、目的基因與載體構(gòu)建重組DNA分子、重組DNA分子轉(zhuǎn)移至受體細胞、轉(zhuǎn)化細胞的擴增、鑒定和篩選。6第一節(jié)

核酸酶和限制性內(nèi)切酶

核酸分解的第一步是水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在微生物和高等動植物中都有作用于磷酸二酯鍵的核酸酶。不同來源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱為核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，稱為脫氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶專一性較低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統(tǒng)稱為核酸酶（nuclease）。根據(jù)核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶（exonuclease）和核酸內(nèi)切酶（endonuclease）。7一、核酸外切酶有些核酸酶能從DNA或RNA鏈的一端逐個水解下單核苷酸，所以稱為核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶稱為脫氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶稱為核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶從3′端開始逐個水解核苷酸，稱為3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一種3′→5′外切酶；核酸外切酶從5′端開始逐個水解核苷酸，稱為5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一種5′→3′外切酶。二、核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶催化水解多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵。有些核酸內(nèi)切酶僅水解5′磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在3′位置上，稱為5′-內(nèi)切酶；而有些僅水解3′-磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在5′位置上，稱為3′-內(nèi)切酶。還有一些核酸內(nèi)切酶對磷酸酯鍵一側(cè)的堿基有專一要求，例如胰臟核糖核酸酶（RNaseA）即是一種高度專一性核酸內(nèi)切酶，它作用于嘧啶核苷酸的C′3上的磷酸根和相鄰核苷酸的C′5之間的鍵，產(chǎn)物為3′嘧啶單核苷酸或以3′嘧啶核苷酸結(jié)尾的低聚核苷酸。8三、限制性核酸內(nèi)切酶

20世紀70年代，在細菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一類核酸內(nèi)切酶，能專一性地識別并水解雙鏈DNA上的特異核苷酸順序，稱為限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease，簡稱限制酶）。當(dāng)外源DNA侵入細菌后，限制性內(nèi)切酶可將其水解切成片段，從而限制了外源DNA在細菌細胞內(nèi)的表達，而細菌本身的DNA由于在該特異核苷酸順序處被甲基化酶修飾，不被水解，從而得到保護（細菌細胞中存在限制修飾系統(tǒng)）。近年來，限制性核酸內(nèi)切酶的研究和應(yīng)用發(fā)展很快，目前已分離到200多種，提純的限制性核酸內(nèi)切酶有100多種，許多已成為基因工程研究中必不可少的工具酶。

1．限制性內(nèi)切酶的命名：根據(jù)其來自的生物名稱，用英文字母和數(shù)字表示；以宿主生物屬名頭一個字母和種名頭兩個字母斜體表示宿主，以非斜體字母表示菌株，以羅馬字母表示同一菌株的不同限制酶系統(tǒng)。①EcoRI來自Escherichiacoli；②HindⅢ來自Haemophilusinfluenzae。92．限制性內(nèi)切酶的類別：限制性核酸內(nèi)切酶可被分成三種類型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過在特殊堿基上補加甲基基團對DNA進行化學(xué)修飾的活性。Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修飾DNA，能在所識別的特殊核苷酸順序內(nèi)或附近切割DNA。因此，被廣泛用于DNA分子克隆和序列測定.

第Ⅰ類酶:每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點不定。如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(300000)，作用時需ATP、Mg2+等輔助因子。第Ⅱ類酶:能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列，這些特定堿基組成的DNA序列叫內(nèi)切酶的識別位點或限制性位點，長度一般在4至8個堿基對之間。如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時需Mg2+存在。10根據(jù)第Ⅱ類酶的剪切特點又可分為兩類：（1）識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種從兩個方向閱讀而序列相同的序列稱為回紋對稱序列(palindrome)，如：EcoRⅠ；（2）另一類酶，如SmaⅠ，它們酶切DNA雙鏈后，產(chǎn)生的DNA片段具有平齊末端(bluntends)。限制性酶EcoRI識別位點（粘性末端）SmaⅠ識別位點（平齊末端）11123．限制性內(nèi)切酶的主要用途（１）重組DNA分子

a.匹配末端的連接：同一種酶切割不同DNA分子產(chǎn)生相同的突出末端；或不同酶（同尾酶）切割不同DNA分子產(chǎn)生相同的突出末端，可在連接酶作用下連接為重組DNA分子；

b.平端連接：可直接連接，但效率較低；c.不匹配黏端的連接：先補平(Klenow)或修平(S1)后再連接（２）繪制物理圖譜（限制性內(nèi)切酶圖譜）

通常DNA上存在大量的限制性內(nèi)切酶酶切位點。因此，限制性內(nèi)切酶能將很長的DNA分子酶解成許多長短不一的小片段，片段的數(shù)目和長度反映了DNA分子上限制性酶切位點的分布。特定的DNA／限制性內(nèi)切酶組合所產(chǎn)生的片段是特異的，它能作為某一DNA（或含有該DNA的生物）的特有“指紋”，這種“指紋”在DNA分子水平上直接反映了生物的遺傳多態(tài)性。

（3）限制性酶切片段長度多態(tài)性分析a.限制性片段長度多態(tài)性（RFLP，RestrictionFragmentLengthPolymorphism）。b.擴增片段長度多態(tài)性（AFLP，

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)。13RFLP檢測變異的原理RFLP圖譜AFLP的銀染檢測14四、其它工具酶1．DNA聚合酶（１）依賴DNA的——DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、修飾的T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶；（２）不依賴DNA的——末端轉(zhuǎn)移酶(Terminaltransferase,TdT）是一種無需模板，催化核苷酸結(jié)合到DNA分子的3'羥基端)；（３）依賴RNA的——反轉(zhuǎn)錄酶。15

２．DNA連接酶

該酶的用途是將帶匹配黏端的雙鏈DNA或平端雙鏈DNA片段的5’-P與另一也帶相應(yīng)缺口的DNA片段的3′-OH連接起來。

３．甲基化酶在E.coli中，大多數(shù)都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。如：Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。Dcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG序列，在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。EcoKⅠ甲基化酶的識別位點少，識別AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。另外，SssⅠ甲基化酶來自原核生物Spiroplasma，可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。16第二節(jié)

基因的克隆與重組一般而言，一個基因是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內(nèi)含子等。在基因克隆和DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細胞中最難分析的大分子?；蚩寺『虳NA重組技術(shù)出現(xiàn)之后，DNA已成為細胞中最易操作分析的大分子。利用這一技術(shù)，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準確地分離出特異的單個目的基因。

DNA的體外重組是指通過酶的修剪和連接，使目的DNA分子與載體DNA共價連接獲得重組DNA分子的過程。其中分離與鑒定目的基因是DNA重組中的關(guān)鍵步驟之一。17一、目的基因的獲取（一）從基因庫中分離基因1．基因文庫的概念

基因文庫是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。將某種生物全部基因組的遺傳信息儲存在可以長期保存的、穩(wěn)定的重組體中，以便需要時即可應(yīng)用。當(dāng)需要某一目的基因時，就可在基因文庫中尋找，一般采用核酸探針的方法，從文庫中“釣出”某基因。2．基因文庫的種類根據(jù)核酸序列的來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等。18３．各種基因庫的構(gòu)建（１）核基因庫

核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫應(yīng)能包括全部基因組序列。構(gòu)建文庫可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細胞，收集所有菌落。

噬菌體或(柯斯質(zhì)粒)載體：重組DNA包裝進噬菌體，感染細菌，收集噬菌斑。

BAC(細菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導(dǎo)入相應(yīng)宿主細胞，收集所有細胞，即為基因庫。19（２）染色體基因庫將基因組的一部分如一條染色體用來構(gòu)建基因庫；可用于選擇特定基因以及分析染色體的組織和結(jié)構(gòu)。在果蠅的多線染色體中，通過對染色體進行微切割，還可構(gòu)建染色體區(qū)段基因文庫。在人類基因組項目研究中，利用流動細胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類染色體分開，用于構(gòu)建單個染色體基因庫，大大加速了人類基因組作圖和分析。利用改良的脈沖電泳方法（pulsedfieldgelelectro-phoresis，PFGE），可將酵母的16條染色體據(jù)其分子量大小分開后，用于構(gòu)建染色體庫，在基因組分析中發(fā)揮作用。20（３）cDNA庫以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補DNA，構(gòu)建的基因庫稱cDNA庫。真核生物mRNA的3’端具有一段多聚A尾端序列

得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補齊后

以帶有限制性酶切點的人工接頭連接

酶切后與載體（通常是噬菌體）連接

制備cDNA庫。21（4）cDNA庫與核DNA庫的關(guān)系cDNA庫僅具有細胞或組織內(nèi)表達基因的mRNA序列

僅包括基因組的部分基因序列。cDNA庫對于研究基因的表達模式、分離某一特定基因是十分有用的。通常是將cDNA庫與核基因庫配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。224．從基因庫篩選目的基因（１）根據(jù)待選基因相關(guān)信息

確定篩選方法和條件

從基因庫中篩選、分離基因。（２）多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針

篩選基因庫。（３）篩庫過程：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上

用堿裂解、中和后洗滌烘干

再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進行雜交放射性自顯影

凡黑點菌落即為陽性克隆。23５．陽性克隆的分析與鑒定從基因庫中篩選出的陽性克隆

分析、鑒定

得到目的基因。（１）限制性酶圖譜法：構(gòu)建陽性克隆的限制性酶圖譜

根據(jù)同源性分析，可了解陽性克隆片段的酶切位點及相對位置

用于進一步亞克隆或同已知的其它序列比較。（２）分子雜交法：Southern雜交分析、Northern雜交分析、Western雜交分析。（３）核酸序列測定法：克隆后的DNA片段進行核酸序列測定后

確定該DNA片段序列的正確性。（４）核酸序列分析與預(yù)測：測定的核酸序列是否為基因、有什么功能，需用計算機軟件或生物學(xué)實驗進一步分析。如同源性比較和閱讀框架分析等。24（二）利用PCR克隆目的基因

1．反向PCR（inversePCR，I-PCR）克隆基因組DNA片段：I-PCR是根據(jù)已知序列擴增其旁側(cè)序列的方法。所用的引物與正常的PCR引物方向相反。

２．反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR，RT-PCR)合成cDNA：RT-PCR是以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再復(fù)制成雙鏈DNA。（三）基因的人工合成

如果已知某基因的核苷酸序列，或者通過基因產(chǎn)物的氨基酸序列推導(dǎo)出基因的核苷酸序列，就可將單核苷酸或寡核苷酸一個一個縮合起來，成為一個基因的核苷酸序列。

先合成分別屬于雙鏈序列的8-12堿基的片段，兩個片段的對應(yīng)部分配對后留有粘性末端，第三個片段再連接上去，不斷延伸直至全部合成。25二、載體（vector）

載體：是將“目的”基因?qū)胧荏w細胞的運載工具。DNA片段與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA

在載體DNA的運載下，高效率地進入宿主細胞，并在其中進行復(fù)制。

DNA載體：主要有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌人工染色體或酵母人工染色體等。

載體的條件：①具有復(fù)制原點，能自我復(fù)制；②具多克隆位點(multiplecloningsite，MCS或Polylinkerregion)即有多種限制酶的切點；③選擇時的遺傳標(biāo)記，如抗生素基因；④易從宿主細胞中回收。261．細菌質(zhì)粒（１）質(zhì)粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子（２）質(zhì)粒具有重組表型檢測標(biāo)記，檢測是否攜帶外源DNA片段。（３）根據(jù)質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復(fù)制程度可分為：嚴緊型質(zhì)粒（一個細菌細胞內(nèi)的質(zhì)粒數(shù)量有1-2個）和松馳型質(zhì)粒（每個細胞內(nèi)有的20-60個）。（４）例如，pUC18質(zhì)粒具有以下特點：分子量小，可接受較大外源片段；拷貝數(shù)多，每個細胞中有500個；克隆位點的酶切位點多，克隆方便；具有α-互補的顯色表型，用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記。27重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞后，利用α互補現(xiàn)象進行篩選是最常用的一種鑒定方法?，F(xiàn)在使用的許多載體都具有LacZ′基因，它編碼的α-肽鏈是β-半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146個氨基酸）。宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都不具有酶活性，但它們可以通過片段互補的機制形成具有功能活性的β-半乳糖苷酶分子。LacZ′基因編碼的α-肽鏈與失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突變體互補，這種現(xiàn)象稱為α-互補。β半乳糖苷酶將無色的化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-靛藍而顯色。在IPTG（異丙基硫代β-D-半乳糖苷）誘導(dǎo)后，在含有X-gal的培養(yǎng)基平板上形成藍色菌落。而當(dāng)有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位點后，就會破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內(nèi)突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導(dǎo)致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。（５）α-互補和藍白斑篩選的原理28藍白