生物化學(xué)實(shí)驗

生物化學(xué)實(shí)驗東北林業(yè)大學(xué)畢冰實(shí)驗?zāi)夸泴?shí)驗1紙層析分離氨基酸

實(shí)驗2血清（蛋清）蛋白的醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗3酵母核糖核酸（RNA）的分離及組份鑒定實(shí)驗4酶的特性

實(shí)驗5小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較實(shí)驗6核黃素的可見、紫外分光光度法測定實(shí)驗7肌糖原的酵解作用實(shí)驗8氨基移換反應(yīng)的定性試驗實(shí)驗成績考核辦法（1）每個實(shí)驗占12分，最高分96分。（2）每次實(shí)驗按考勤、實(shí)際操作、實(shí)驗報告三方面進(jìn)行考核。實(shí)驗成績考核辦法（3）考勤方面：3分要求上課不遲到，不早退，不無故曠課，如能遵守,則給滿分：如無故不來，則12分全扣。如有特殊情況提前與實(shí)驗老師聯(lián)系，與其他班同上。實(shí)驗成績考核辦法（4）實(shí)際操作方面：3分。要求遵守實(shí)驗室的規(guī)章制度，不得在實(shí)驗室內(nèi)打鬧喧嘩，認(rèn)真預(yù)習(xí)，準(zhǔn)確操作，不得損壞實(shí)驗室儀器物品，實(shí)驗結(jié)果較好，清潔收尾工作較好（每次實(shí)驗結(jié)束實(shí)驗臺、窗臺、邊臺、講臺、黑板擦干凈、儀器設(shè)備斷開電源并清洗干凈，擺放整齊，不用回收的藥品倒掉，垃圾每次傾倒，地面全面徹底擦干凈，凳子靠在實(shí)驗臺邊上擺放整齊。老師檢查合格后方可離開）。如違反以上規(guī)定則酌情減分。（5）實(shí)驗報告方面：6分。要求能夠及時上交實(shí)驗報告（課代表負(fù)責(zé)收齊，下一次實(shí)驗之前上交），準(zhǔn)確按照要求書寫實(shí)驗報告，書寫工整、清晰，并對實(shí)驗給出準(zhǔn)確的結(jié)果和正確的分析討論。如違反以上規(guī)定則酌情減分。以上三方面的綜合得分為每個實(shí)驗的成績，8個實(shí)驗成績相加即為實(shí)驗最終成績。實(shí)驗成績考核辦法實(shí)驗一紙層析分離氨基酸一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。二實(shí)驗原理

紙層析屬于分配層析，是以濾紙為支持物，與濾紙纖維結(jié)合的水（約占紙重20～22%）為固定相，以有機(jī)溶劑醇酚等作為流動相。主要是根據(jù)被分析的樣品在兩種不相溶的溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)（即二相中濃度比值）不同，它們隨流動相在紙上移動的距離也不同，從而達(dá)到分離的目的。

各種氨基酸在濾紙上的遷移率用Rf（Rateflow）值表示：

色斑中心至點(diǎn)樣原點(diǎn)中心的距離Rf＝溶劑前緣至點(diǎn)樣原點(diǎn)中心的距離

紙層析法根據(jù)溶劑流動方向的不同，可分為垂直型和水平型:

垂直型：使流動相自下而上（上行法）或自上而下（下行法）擴(kuò)展的為垂直型；水平型：將圓形濾紙置于水平位置，溶劑由中心向四周擴(kuò)散的層析。本實(shí)驗采用圓濾紙進(jìn)行垂直型層析，將待測與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸層析后，用茚三酮反應(yīng)使之顯色，觀察對比色斑，計算Rf值。氨基酸的顏色反應(yīng)

脯氨酸：茚三酮，呈黃色；

其他的α-氨基酸：茚三酮，紫紅色，最終形成藍(lán)紫色化合物。此反應(yīng)十分靈敏，不僅適合大多數(shù)氨基酸，同樣也適合于蛋白質(zhì)，多肽的鑒定。1:1500000濃度的氨基酸水溶液也能發(fā)生此反應(yīng)，由此也可作為氨基酸的定量測定。

三操作步驟

1.濾紙

取一張20cm×15cm層析濾紙，距紙邊2cm處用鉛筆劃一橫線，沿線每3cm畫一圈為點(diǎn)樣處，直徑為0.5cm。2.點(diǎn)樣

用微量加樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸和混合樣，吸管與濾紙垂直，輕輕接觸紙面，直徑等于0.5cm。一滴滴完后用冷風(fēng)吹干，再點(diǎn)第二次；共點(diǎn)三次。20cm15cm

將點(diǎn)完樣的濾紙兩側(cè)面對齊，成筒狀，用針線縫合。3.展層

取出層析缸內(nèi)培養(yǎng)皿，加入展開液20ml。

正丁醇：甲酸：水=15：3：2

再加入茚三酮少許，放入層析缸內(nèi)，將點(diǎn)樣后的濾紙放入展層溶劑中，當(dāng)溶劑展層至濾紙上沿1cm

處展層結(jié)束，用鉛筆畫出展層前沿位置，吹干，先用冷風(fēng)吹干，再用熱風(fēng)吹顯色，用鉛筆描出各顯色斑點(diǎn)形狀。

五種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分別為:Ala，Leu，Pro，Lys，Asp

點(diǎn)樣圈中心至顯色斑點(diǎn)的距離

Rf=

點(diǎn)樣圈中心至展層前沿的距離

4．Rf值的測定四注意事項

1鉛筆格尺自備。

2點(diǎn)樣圈不能距離紙邊太近，各點(diǎn)之間的距離不能太近。

3吹干時一定要保證完全吹干。

4縫合時，濾紙的兩個紙邊不能相互接觸并且底邊應(yīng)對齊。四注意事項

5使用移液管時應(yīng)右手拿管，左手拿吸耳球并用食指堵管口。

6使用移液管時，應(yīng)先看清管的最大刻度，每一格代表多少后再量取。

7展開劑取完后別忘加顯色劑茚三酮。

8

點(diǎn)樣劃線時要輕，否則樣品容易殘留在線上。計算5種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值；將自己的實(shí)驗結(jié)果貼在實(shí)驗報告上。五結(jié)果分析與討論

蛋清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳實(shí)驗二

一實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳的一般原理。電泳:

帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。帶電顆粒在電場中的移動方向和遷移速度取決于：帶電顆粒本身性質(zhì)(所帶電荷的性質(zhì)，以及所帶電荷數(shù)量、顆粒大小和形狀)、電場強(qiáng)度、溶液的pH值、離子強(qiáng)度及電滲等因素。二實(shí)驗原理

電泳是利用不同帶電質(zhì)點(diǎn)在同一電場中泳動速度不同分離物質(zhì)的方法。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度不同，常用遷移率來表示。遷移率：帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度。醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。

蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì)：

α-氨基；

α-羧基；側(cè)鏈基團(tuán)（在一定的pH條件下能解離）。

當(dāng)pH>pI時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，電泳時向正極移動；當(dāng)pH<pI時，蛋白質(zhì)帶正電，電泳時向負(fù)極移動；當(dāng)pH=pI時，蛋白質(zhì)不帶電，電泳時零移動。蛋白質(zhì)的分離原理：

各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量及顆粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，因而在電場中遷移的方向和速度不同。電泳技術(shù)的應(yīng)用：

電泳技術(shù)在生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中被廣泛用于生物大分子或小分子（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等）的分離純化與分析鑒定等。以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳。這種薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，厚度為120μm，滲透性強(qiáng)，對樣品無吸附作用，用它作支持物進(jìn)行電泳，電泳效果比紙電泳好。優(yōu)點(diǎn)：樣品用量少，分離速度快，電泳圖譜更為清晰，靈敏度也較高（5μg/ml以上）。目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定等方面。醋酸纖維素薄膜電泳三操作步驟（一）浸泡用鑷子夾取醋酸纖維薄膜放入緩沖液中浸泡20min。

若漂浮于液面的薄膜在15—30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點(diǎn)等，則表示薄膜不均勻應(yīng)棄去，以免影響電泳結(jié)果。（二）點(diǎn)樣把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的水分，然后平鋪于玻璃板上（無光澤面朝上）。將點(diǎn)樣器先放在蛋清中蘸一下，再在膜條一端2-3cm處輕輕垂直水平落下并立即提起，這樣即在膜條上點(diǎn)了細(xì)條狀的蛋清樣品。＋

此步是實(shí)驗的關(guān)鍵，點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。

（三）電泳將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，膜條上點(diǎn)樣一端靠近負(fù)極。蓋嚴(yán)電泳室，通電，調(diào)節(jié)電壓160伏，電流強(qiáng)度0.4—0.7mA/cm膜條，時間為60min

。

（四）染色電泳完畢后將膜條取出，放在染液中浸泡10min。染色液為氨基黑10B。

(五）漂洗將膜條從染色液中取出后先用自來水沖洗至無染液滴下,移至漂洗液中漂洗數(shù)次，至無蛋白區(qū)底色脫凈為止?？梢姷缴珟逦碾娪緢D譜。漂洗液為乙醇:冰醋酸:水=45:5:50

(六）透明放入透明液時，應(yīng)左手拿玻璃板，右手用鑷子夾好膜放入透明液中數(shù)秒鐘立即提起并迅速鋪于玻璃板上。(用吹風(fēng)機(jī)完全吹干后將膜條小心揭下。)

四實(shí)驗結(jié)果

將自己的實(shí)驗結(jié)果貼在實(shí)驗報告上；寫明分離得到幾種蛋白組分。五注意事項1.在粗濾紙內(nèi)吸干時不要用力壓，輕輕吸干即可。

2.點(diǎn)樣時，樣品量不要太多，越細(xì)越直為好。

3.兩層濕濾紙橋之間不能有氣泡。

4.染液用后回收，培養(yǎng)皿清洗干凈。

5.膜條的點(diǎn)樣端應(yīng)在負(fù)極，通常黑色為負(fù)極。

6.漂洗分四次，每人都先從第一個培養(yǎng)皿開始依次到第四個培養(yǎng)皿。

7.放入透明液時，應(yīng)左手拿玻璃板，右手用鑷子夾好膜放入透明液中數(shù)秒鐘立即提起并迅速鋪于玻璃板上。用吹風(fēng)機(jī)完全吹干后取出。

蛋清化學(xué)組成及性質(zhì)蛋清層主要組分是水，混合蛋清含水87%～89%。蛋清是一種蛋白質(zhì)體系，蛋清中的蛋白質(zhì)包括:(1)卵清蛋白;(2)伴清蛋白;(3)卵類粘蛋白;(4)溶菌酶;(5)卵粘蛋白。

酵母核糖核酸的分離及組份鑒定實(shí)驗三

一實(shí)驗?zāi)康牧私夂怂岬慕M分，并掌握鑒定核酸組分的方法。二實(shí)驗原理

酵母中的核糖核酸可溶于堿，在堿提取液中加酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此得到粗核糖核酸。核酸含有核糖，嘌呤堿，嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。三操作步驟（一）分離

將5g酵母懸浮于30ml

0.04mol/L氫氧化鈉溶液中，在研缽中研磨均勻移至100ml錐形瓶內(nèi)，在沸水浴中加熱30min后冷卻，配平后離心(3,000轉(zhuǎn)/min)15min。將上清液緩慢傾入到攪拌的酸性乙醇溶液（10ml）中，待核糖核酸完全沉淀后離心(3000轉(zhuǎn)/min)3min，棄上清。用95%乙醇洗沉淀一次，轉(zhuǎn)移至布氏漏斗中抽濾。（二）組分鑒定

取核糖核酸加入1.5mol/L硫酸10ml，沸水浴中加熱10min制成水解液進(jìn)行組分鑒定。

1.嘌呤堿取一只試管，加入過量的濃氨水（用吸管吸約超過1ml），并加入1ml0.1mol/L硝酸銀，再加入1ml水解液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀生成。2.核糖取一只試管，加入水解液1ml，三氯化鐵濃鹽酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中1-2min。注意溶液是否變綠，說明核糖的存在。

3.磷酸取一只試管，加入水解液1ml和定磷試劑1ml，在沸水浴中加熱5min。觀察溶液是否變成藍(lán)色，說明磷酸是否存在。四實(shí)驗結(jié)果請寫出實(shí)驗結(jié)果并分析。

五注意事項

1NaOH先少量多次加入，研磨均勻后再加入剩余量。

2離心時，首先一定用天平配平。

3嘌呤堿的檢測時加入藥品的順序不能顛倒，一定沿管壁加入，試管不要振蕩。

4為了提高效率，離心時要四只離心管一起離心。思考題1、如何得到高產(chǎn)量RNA的粗制品？2、本實(shí)驗RNA組分是什么？怎樣驗證的？

酶的特性實(shí)驗四實(shí)驗?zāi)康?/p>

通過觀察酶作用底物的特異性以及溫度、激活劑、抑制劑和pH值對酶的活性的影響,加深對酶的性質(zhì)的認(rèn)識。1

原理

酶具有高度的專一性。淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解。淀粉和蔗糖無還原性，用Benedict試劑檢查糖的還原性。

2步驟取四只試管，按下表添加。一酶的專一性112α-D-葡萄糖-（1→2）-β-D-果糖

試管號12Benedict2ml2ml1%淀粉4d/2%蔗糖/4d

混勻，沸水浴中煮2—3min。

試管號34

淀粉酶1ml1ml1%淀粉3ml/2%蔗糖/3ml

混勻，37℃保溫15min.Benedict2ml2ml

混勻，沸水浴中煮2—3min。觀察有無黃色沉淀產(chǎn)生。1、2、二溫度對酶活力的影響

1

原理

酶的催化作用受溫度的影響，在最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。大多數(shù)動物酶的最適溫度37—40℃，植物酶的最適溫度為50—60℃

。

酶對溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100℃

，其活性并無明顯變化，但在100℃的溶液中卻容易失活。低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。

試管號5670.2%淀粉2ml2ml2ml

37℃

5min冰浴5min1ml\\

淀粉酶\1ml1ml

各試管混勻

37℃20min冰浴20min

碘--碘化鉀溶液2d2d2d

比較各試管的顏色，判斷淀粉被淀粉酶水解的程度。并說明溫度對淀粉酶活性的影響。

37℃5min煮沸5-15min的淀粉酶37℃20min三激活劑和抑制劑對酶活性的影響1

原理酶的活性受激活劑或抑制劑的影響。能使酶的活性增加的物質(zhì)，稱為激活劑，能使酶的活性降低的物質(zhì)，稱為抑制劑。

氯離子為淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。

2

步驟取三只試管，按下表加入試劑。

試管號89100.1%硫酸銅\1ml\1%氯化鈉1ml\\

蒸餾水\\1ml0.1%淀粉3ml3ml3ml

淀粉酶1ml1ml1ml

混勻37℃保溫10—15min冷卻。

碘—碘化鉀溶液

2—3d

2—3d

2—3d

觀察比較三只試管顏色深淺，并解釋。四pH對酶活性的影響1

原理

酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著，不同酶的最適pH值不同。本實(shí)驗觀察pH對淀粉酶活性的影響，淀粉酶的最適pH約為6.8。

2

操作

取4只錐型瓶，按下表添加緩沖液。每實(shí)驗臺各配30毫升。（可用滴管調(diào)pH值）

錐型瓶號0.2mol/L磷酸氫二鈉0.1mol/L檸檬酸pH115.45ml14.55ml5.0218.15ml11.85ml5.8323.16ml6.84ml6.8429.16ml0.84ml8.0取4只試管，按下表添加。

試管號5678

緩沖液1瓶3ml2瓶3ml3瓶3ml4瓶3ml0.5%淀粉2ml2ml2ml2ml

淀粉酶2ml2ml2ml2ml

向各試管中加入淀粉酶的時間間隔各為1min。將各試管內(nèi)容物混勻，并依次置于37℃恒溫水浴中保溫。第8管加入淀粉酶2min后，每隔1min由第7管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化鉀—碘溶液，檢驗淀粉的水解程度。待混合液變?yōu)樽攸S色時，向所有試管依次添加1—2滴碘化鉀—碘溶液。添加碘化鉀—碘溶液的時間間隔，從第5管起，亦均為1min。3結(jié)果觀察各試管內(nèi)容物呈現(xiàn)的顏色，分析對淀粉酶活性的影響。五注意事項各實(shí)驗所用的淀粉濃度不同，應(yīng)注意不要加錯。注意保證對照組反應(yīng)時間和其他基本條件的一致。每次加試劑后都要搖勻，碘液不要滴在管壁上。各管均應(yīng)置于相應(yīng)溫度下或取出后立即加碘液搖勻。加淀粉酶和加碘液時的時間間隔要保持一致，即在反應(yīng)時間一樣的條件下，觀察反應(yīng)的速度。試管要沖洗干凈，否則影響實(shí)驗結(jié)果。淀粉水解程度不同，遇碘呈色反應(yīng)不同。因此，可以通過呈色反應(yīng)，了解淀粉水解的程度，從而間接判斷唾液淀粉酶活力的大小。淀粉水解如下：

遇碘呈藍(lán)色紫色紅色碘本色（黃）碘本色（黃）中間可能出現(xiàn)其它過渡色，如藍(lán)紫色、棕紅色等。淀粉紫色糊精紅色糊精無色糊精麥芽糖思考題1.激動劑和抑制劑有哪幾種類型？其作用原理是什么？2．溫度和pH影響酶活性的原理是什么？3．聯(lián)系實(shí)驗結(jié)果及所學(xué)理論，說明pH對酶活性的影響有什么規(guī)律和實(shí)際意義？4.酶作為生物催化劑具有哪些特征？5.進(jìn)行酶學(xué)實(shí)驗必須注意控制哪些條件？為什么？實(shí)驗五小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較

1學(xué)習(xí)分光光度計的原理和使用方法。2學(xué)習(xí)測定淀粉酶活力的方法。3了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。一實(shí)驗?zāi)康亩?shí)驗原理

淀粉酶是水解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱。按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化淀粉酶、異淀粉酶等。實(shí)驗證明，在小麥、大麥、黑麥的休眠種子中只含有β-淀粉酶，α-淀粉酶是在發(fā)芽過程中形成的，所以在禾谷類萌發(fā)的種子和幼苗中，這兩類淀粉酶都存在。其活性隨萌發(fā)時間的延長而增高。二實(shí)驗原理

本實(shí)驗以淀粉酶催化淀粉生成麥芽糖的速度來測定酶的活力。麥芽糖是還原性糖，能使3，5-二硝基水楊酸還原成棕色的3-氨基5-硝基水楊酸，后者在500nm處有最大光吸收，可用分光光度法定量測定。三操作步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取干凈刻度試管7支，編號，按下表加入試劑。

搖勻后，置沸水浴中煮沸5min。取出后迅速冷至室溫，測定各管的A500，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，A500值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三操作步驟（2）、酶液的提取

幼苗酶的提取：取萌發(fā)的幼苗15株，放入研缽內(nèi)，加石英砂0.2g，加1％NaCl溶液10ml，用力研磨成勻漿，在0～4℃下放置20min。將提取液移入離心管中，2000rpm離心10min。將上清液倒入量筒中，測定酶提取液的總體積。取酶液1ml用pH6.9的0.02mol/L磷酸緩沖液稀釋至10ml，進(jìn)行酶活力測定。

種子酶的提取：取浸泡2.5h種子15粒作對照，操作方法同上。

2、酶液的制備

（1）、小麥種子萌發(fā)：小麥種子浸泡24h后，放入25℃恒溫箱內(nèi)或在室溫下發(fā)芽。三操作步驟3、酶活力測定（1）、取10ml刻度試管3支，編號，按下表加入試劑。

各管混勻后在45℃恒溫水浴中水解3min，立即向各管中加入1％3，5-二硝基水楊酸溶液0.8ml?；靹蚝?，放入80℃水浴中加熱3min，迅速冷至室溫，加水稀釋至10ml，將各管充分混勻。用空白管作為對照，測定各管的A500值。四計算酶活力單位

1在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各管相應(yīng)的麥芽糖含量。2設(shè)在45℃、pH6.9的條件下，3min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個活力單位（U），則15粒種子或15株幼苗的總酶活力單位=C酶×n×V酶式中C酶為種子酶或幼苗酶分解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖的濃度(mg/ml)n為酶液稀釋的倍數(shù)V酶為提取酶液的總體積（ml）

核黃素的可見、紫外分光光度法測定

實(shí)驗六

一實(shí)驗?zāi)康牧私饪梢?、紫外分光光度計的基本原理和使用方法。二?shí)驗原理利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來測定其含量，通過核黃素在可見和紫外分光光度計上都可以檢測來比較可見分光光度計和紫外分光光度計的靈敏度差異。

核黃素含共軛結(jié)構(gòu)異咯嗪核糖醇

三操作方法

1可見分光光度計的測定

（1）最大光吸收波長的確定將4ml標(biāo)準(zhǔn)核黃素溶液加入比色皿中，調(diào)節(jié)波長旋鈕，找出最大光吸收值所對應(yīng)的波長。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別準(zhǔn)確量取一定量的標(biāo)準(zhǔn)核黃素溶液于6支試管中，并用蒸餾水補(bǔ)足至每管5ml。6支試管中核黃素的含量呈梯度上升，其中第6支試管的光吸收值為0.6左右(以蒸餾水為對照)。

（3）核黃素最低檢出量的確定

取4mg/100ml核黃素4ml加入比色皿中，以蒸餾水為標(biāo)準(zhǔn)管，用722分光光度計測其吸光度，用注射器取出2ml核黃素再加入2ml蒸餾水并混合均勻在測其吸光度值,依次成倍稀釋并測其吸光度值，直至其吸光度值不變?yōu)橹梗z測值偏離線性關(guān)系），確定最低檢出量。（保留樣品）

2紫外分光光度計的測定（1）最大光吸收波長的確定操作方法同可見光分光光度計的方法。用752分光光度計測其紫外最大光吸收波長。提示:比色皿應(yīng)改用石英比色皿。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用752分光光度計檢測，操作方法參考可見光分光光度計的方法。（3）核黃素最低檢出量的確定

將可見光分光光度計無法檢出的樣品倒入石英比色皿中繼續(xù)稀釋檢測（用752檢測），直至檢測不出為止（檢測值偏離線性關(guān)系），確定最低檢出量。

3比較紫外和可見的靈敏度并計算相差的倍數(shù)。

四、注意事項

1、在操作過程中取樣量要準(zhǔn)確量取。

2、要認(rèn)真閱讀儀器使用說明書，按照說明書的操作規(guī)程進(jìn)行操作。

3、在操作過程中要防止比色皿的打碎和破損，石英比色皿和玻璃比色皿不要弄混。

4、儀器連續(xù)使用時間不能過長，防止光電管疲勞。

5、測定時要用待測樣沖洗杯幾次。

四計算酶活力單位

1在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各管相應(yīng)的麥芽糖含量。2設(shè)在45℃、pH6.9的條件下，3min內(nèi)水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個活力單位（U）,則15粒種子或15株幼苗的總酶活力單位=C酶×n×V酶式中C酶為種子酶或幼苗酶分解淀粉產(chǎn)生的麥芽糖的濃度(mg/ml)n為酶液稀釋的倍數(shù)V酶為提取酶液的總體積（ml）

實(shí)驗七

肌糖原的酵解作用

一實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)鑒定糖酵解作用的原理和方法，了解糖酵解作用在糖代謝過程中的地位及生理意義。

二實(shí)驗原理肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的條件下，經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，最后轉(zhuǎn)變成乳酸的過程。它是糖類供給組織能量的一種方式。本實(shí)驗用乳酸的生成來檢查糖原或淀粉的酵解作用。糖類和蛋白質(zhì)干擾乳酸的測定。在除去蛋白質(zhì)與糖后，乳酸可與硫酸共熱產(chǎn)生甲醛，后者再與對羥基聯(lián)苯反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)。

三實(shí)驗步驟

12pH7.4磷酸緩沖液3ml3ml0.5%淀粉溶液1ml1ml15%偏磷酸2ml/肌肉糜0.5g0.5g

用滴管加一滴管液體石蠟，37℃保溫1.5h。15%偏磷酸/2ml

各試管過濾，棄沉淀。飽和硫酸銅1ml1ml氫氧化鈣

液體體積的1/3液體體積的1/3

塞上橡皮塞，用力震蕩（可用漩渦混和器），放置30min并不時震蕩，過濾到3、4號管，棄沉淀。

56濃硫酸1.5ml1.5ml1.5%對羥基聯(lián)苯2—3滴

2—3滴

置于冰浴中冷卻。樣品濾液

3管

0.25ml

4管

0.25ml

隨加隨搖動冰浴中的試管，注意冷卻?；靹蚝蠓湃敕兴≈酗@色后取出。

四實(shí)驗結(jié)果比較顏色的深淺，并加以解釋。五注意事項1加入藥品的次序不能顛倒。

2加入肌肉糜后應(yīng)充分混勻。

3過濾用的濾紙不要太厚，以免濾液量太少。

4加入氫氧化鈣的量不要太多，一般以半藥勺為宜。是以液體的量多少酌情加減。實(shí)驗八

氨基移換反應(yīng)的定性實(shí)驗

一實(shí)驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)應(yīng)用紙層析法鑒定氨基移換反應(yīng)。二實(shí)驗原理本實(shí)驗觀察肌肉糜谷丙轉(zhuǎn)氨酶所催化的氨基移換反應(yīng)。在反應(yīng)后借紙層析法檢查底物谷氨酸的減少和產(chǎn)物丙氨酸的生成。為防止丙氨酸被肌肉糜中其它的酶所氧化或還原，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入了抑制劑碘乙酸。

三實(shí)驗步驟

（一）

酶液的制備

取肌肉糜2g放入研缽中，加入3毫升磷酸緩沖液，研成勻漿，備用。每實(shí)驗臺做兩份。

（二）

體外氨基移換反應(yīng)

15%三氯乙酸

酶液0．5%谷氨酸1%丙酮酸鈉0．1%碳酸氫鉀0．05%碘乙酸1210d/10d10d10d10d10d10d10d10d10d10d

混勻，放入40o恒溫水浴保溫1h.15%三氯乙酸/10d

每實(shí)驗臺做兩份。取2支試管，編號。(三）紙上層析法檢查

取一張濾紙，用鉛筆劃成4等份。4個角上標(biāo)明1、2、3、4。距濾紙中心劃一半徑1.5cm的圓圈為點(diǎn)樣基線。取4根毛細(xì)管，分別將1號管、2號管、標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液和標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液點(diǎn)在濾紙的1、2、3、4各分內(nèi)層析基線部分的中點(diǎn)位置上。使每種溶液分別形成直徑2—3mm的圓斑。每次點(diǎn)樣后，用吹風(fēng)機(jī)吹干再點(diǎn)下一次，共點(diǎn)三次。

在干凈的培養(yǎng)皿中加入正丁醇：甲酸：水=7.5ml：1.5ml：1ml，加茚三酮少許。在點(diǎn)樣后的濾紙中心插入一個用紙卷成的“燈心”并使“燈心”下端浸入展開劑中。展開40min（酌情）取出，用吹風(fēng)機(jī)吹干。1234四實(shí)驗結(jié)果

分析比較層析圖譜，確定各點(diǎn)的氨基酸組成，并解釋實(shí)驗結(jié)果。1234五注意事項

1(一）、（二）每實(shí)驗臺做二份，（三）每人做一份。

2研磨后如果勻漿太稠可少量加入磷酸緩沖液。

3加入液體量的順序不能顛倒。

4將濾紙分4等分時，要保證樣品層析軌跡與濾紙紋路都成45度角。

5做實(shí)驗時，要把手洗干凈，將圓濾紙放在一潔凈的普通紙上進(jìn)行，盡量少用手接觸濾紙，以免汗跡污染，影響顯色結(jié)果的分析。6鉛筆格尺自備，點(diǎn)樣圈不能距離紙邊太近，各點(diǎn)之間的距離不能太近。

7吹干時一定要保證完全吹干。

8展開劑取完后別忘加顯色劑茚三酮。注意不要將茚三酮沾到手上。

9在層析操作時，圓濾紙千萬不能折迭，一律用鉛筆作標(biāo)記（勿用圓珠筆）。

10濾紙芯卷得不要太緊，且要呈圓筒狀，否則，展層不呈圓形，影響Rf值的計算。

五注意事項

思考題1.名詞解釋：

聯(lián)合脫氨基作用；轉(zhuǎn)氨基作用；氧化脫氨基作用；生糖氨基酸；生酮氨基酸2.圖示或張貼層析圖，鑒定丙氨酸和α-酮戊二酸是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)氨基作用，并寫出相關(guān)的反應(yīng)式。3.實(shí)驗操作過程中，為何不能用手接觸濾紙？實(shí)驗九蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)

實(shí)驗?zāi)康?/p>

1、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。

2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。

3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。

一蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)（一）雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗原理

尿素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并釋放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu離子結(jié)合生成紫紅色的化合物，此反應(yīng)成為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)。操作方法

取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷卻后，加10%NaOH1ml，振蕩混勻，再加1%CuSO4溶液一滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。避免加過量CuSO4，否則生成的藍(lán)色氫氧化銅掩蓋粉紅色。取另一支試管加2%雞蛋清溶液1ml和10%NaOH溶液2ml，搖勻，再加1%

CuSO42滴，隨加隨搖試管，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。

（二）黃色反應(yīng)

實(shí)驗原理

含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，遇硝酸后可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。

多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以才有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。操作方法

取7支試管，按下表加入試劑管號材料（滴）濃硝酸（滴）現(xiàn)象12%雞蛋清溶液422大豆提取液443指甲少許404頭發(fā)少許4050.5%苯酚4460.3%色氨酸4470.3%酪氨酸44

（三）坂口反應(yīng)

實(shí)驗原理

精氨酸和許多胍代化合物與a-萘酚在堿性次溴酸鈉溶液中發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色物質(zhì)。操作方法

向各試管中按下表加入試劑，記錄出現(xiàn)的現(xiàn)象。操作方法

本實(shí)驗十分靈敏。a-萘酚要過量。次溴酸鈉、精氨酸即蛋白質(zhì)均不可過多，過多的次溴酸鈉可繼續(xù)氧化有色產(chǎn)物使顏色消失。

管號試劑（滴）123蒸餾水/450.3%精氨酸/1/2%雞蛋清溶液5//20%NaOH555a-萘酚333NaBrO111現(xiàn)象（四）乙醛酸反應(yīng)實(shí)驗原理

在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，反映機(jī)理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。

操作方法

取三支試管，按下表加入試劑。操作方法

加入濃硫酸后靜止，觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可在水浴中微熱。

管號試劑123蒸餾水(滴)/250.3%色氨酸溶液（滴）/3/2%雞蛋清溶液（滴）5//冰醋酸（ml）222混勻后，試管稍傾斜，沿管壁緩慢加入。濃硫酸（ml）111現(xiàn)象

（五）偶氮反應(yīng)

偶氮化合物與酚核或咪唑環(huán)結(jié)合產(chǎn)生有色物質(zhì)。它與酪氨酸和組氨酸反應(yīng)的產(chǎn)物分別為紅色和櫻桃紅色。

實(shí)驗原理操作方法

取3支試管，按下表加入試劑并觀察有色產(chǎn)物的生成。

管號試劑（滴）1230.3%組氨酸溶液4//0.3%酪氨酸溶液/4/雞蛋清原液//4重氮試劑88820%NaOH溶液222現(xiàn)象

二糖的顏色反應(yīng)(補(bǔ)充材料）(一)莫氏試驗

(1)實(shí)驗原理

糖經(jīng)濃無機(jī)酸（硫酸、鹽酸）脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，它們在濃無機(jī)酸作用下，能與α-萘酚生成紫紅色縮合物。(2)操作步驟12341%葡萄糖1ml1%蔗糖溶液1ml1%淀粉溶液1ml濾紙少許加1ml水1ml莫氏試劑2d2d2d2d濃硫酸1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml

濃硫酸沿管壁加，且勿振搖。觀察液面交界處有無紫紅色環(huán)出現(xiàn)。

(二)塞氏試驗(1)

實(shí)驗原理

酮糖在濃酸的作用下，脫水生成4-羥甲基糠醛，后者與間苯二酚作用成紅色反應(yīng)；有時亦同時產(chǎn)生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鮮紅色溶液。(2)操作步驟1231%葡萄糖1ml1%蔗糖溶液1ml1%果糖溶液1ml塞氏試劑2.5ml

2.5ml

2.5ml

混勻后同時置于沸水浴中。比較各管顏色變化及紅色出現(xiàn)先后順序。三甘油三酯的顏色反應(yīng)(1)

實(shí)驗原理甘油三酯經(jīng)正庚烷-異丙醇混合溶劑抽提后，用KOH溶液皂化，并進(jìn)一步用過碘酸鈉試劑氧化甘油生成甲醛，甲醛與乙酰丙酮試劑反應(yīng)形二氫二甲基吡啶黃色衍生物?？捎糜诒壬珳y定。(2)操作步驟

取一支試管，加入甘油三酯溶液1ml、抽提液1ml和0.04mol/LH2SO40.3ml，邊加邊搖，加畢劇烈震動15秒鐘，然后靜止分層，吸取上層液與另一支試管中加入異丙醇1ml及皂化試劑0.2ml，混勻65?C保溫5分鐘。再加入氧化試劑1ml及乙酰丙酮1ml，混勻后65?C保溫15分鐘。觀察顏色變化。（四）維生素的顏色反應(yīng)(一)

維生素A的顏色反應(yīng)

(1)

實(shí)驗原理

維生素A與SbCl3作用生成藍(lán)色。此藍(lán)色反應(yīng)雖非維生素A的特異反應(yīng)（如胡蘿卜素亦有類似反應(yīng)，不過成色程度很弱），但一般可用來作維生素A的定性鑒定。(2)

實(shí)驗操作

取干燥試管一支，加入1-2滴魚肝油及10滴氯仿，混勻后加入醋酸酐2滴及三氯化銻-氯仿溶液2ml觀察顏色變化并記錄之。(二