第5章 基因工程基本流程-獲取目的基因

第5章

基因工程基本流程

——獲取目的基因獲取目的基因目的基因修飾、改良建立高效表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究2鳥槍法cDNA法PCR擴(kuò)增化學(xué)合成基因文庫3鳥槍法（shotgun

）用基因組中的隨機(jī)產(chǎn)生的片段作為模板進(jìn)行克隆4“鳥槍法”最初用于測(cè)定微生物基因組序列。近年來，美國(guó)塞萊拉公司利用改進(jìn)的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測(cè)序工作，證明了它在測(cè)定大基因組上的可行性和有效性。5鳥槍法基本程序機(jī)械切割片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切

片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因組DNA片段的制備6根據(jù)外源DNA片段的末端性質(zhì)、篩選方案和大小確定載體片段大小λ-噬菌體、YAC、BAC……篩選方案克隆載體：原位雜交或限制性酶切圖譜表達(dá)載體：基因產(chǎn)物功能檢測(cè)2.外源DNA片段的全克隆7根據(jù)篩選方案確定受體：大腸桿菌：原位雜交或限制性酶切圖譜特異基因表達(dá)受體：基因產(chǎn)物功能檢測(cè)8菌落原位雜交理想的探針是篩選的決定因素基因產(chǎn)物功能檢測(cè)依賴于篩選模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性限制性酶切圖譜

多次酶切篩選3.期望重組子的篩選9限制性酶切圖譜10例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將重組子用SalI切開，凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，回收DNA片段，根據(jù)目的基因內(nèi)部的特征性酶重復(fù)酶切過程直至篩選成功11通過亞克隆在已克隆的片段上準(zhǔn)確定位目的基因，然后對(duì)目的基因進(jìn)行序列分析，搜尋其編碼序列以及可能存在的表達(dá)調(diào)控序列4.目的基因的定位12鳥槍法操作的改進(jìn)-非隨機(jī)鳥槍法前提條件：目的基因的酶切圖譜已知目的基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)已知兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離已知如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率13鳥槍法的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)；不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)14cDNA法

cDNAmRNA的互補(bǔ)DNA(complementaryDNA)反/逆轉(zhuǎn)錄病毒基因復(fù)制和表達(dá)中間產(chǎn)物分離mRNA體外合成cDNA克隆進(jìn)入受體細(xì)胞篩選含有目的基因的重組克隆151.mRNA的分離純化利用多數(shù)mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。含有poly(A)的mRNA親和層析低聚dT纖維素:用于poly(A)較長(zhǎng)的mRNA多聚U瓊脂糖:用于poly(A)較短的mRNA（<20A）無poly(A)的mRNA162.雙鏈cDNA的體外合成反轉(zhuǎn)錄酶1）cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，OligodT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物17cDNA單鏈的3’末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’2）cDNA第二鏈合成-自身合成18核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’19202）cDNA第二鏈合成-置換合成RNaseH識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷DNAPolI除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈21mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物2223第一鏈合成完畢后，變性去除殘留的mRNA，在cDNA的游離3’末端添加OligodC，然后與人工合成的OligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu)，聚合第二條鏈。3）cDNA第二鏈合成-引物合成24mRNA3’5’AAAAAAAcDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’堿處理cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’dCTP末端轉(zhuǎn)移酶cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCC加入OligodG退火cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈5’TTTTTTTT3’CCCCCCCGGGGGGG5’3’AAAAAAA25雙鏈cDNA的克隆克隆方案的選擇標(biāo)準(zhǔn)與鳥槍法相同末端性質(zhì)篩選方案片段大小26cDNA重組克隆的篩選原位雜交產(chǎn)物功能檢測(cè)差示法（差別雜交/扣除雜交）27在一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因正常表達(dá)，在另一個(gè)細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)。在這種情況下便可制備到兩種不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。通過這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對(duì)由表達(dá)目的的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆庫進(jìn)行篩選。當(dāng)使用存在目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)；而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應(yīng)，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片并對(duì)照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落。差別雜交2829局限性差別雜交的靈敏度比較低，特別是對(duì)于那些低豐度的mRNA而言，這個(gè)缺點(diǎn)就顯得更加突出差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗費(fèi)時(shí)間和金錢

30原理：羥基磷灰石柱結(jié)合DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatitecolumn）扣除雜交31從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。32AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BA33PCR擴(kuò)增法使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。TheNationalCenterforBiotechnologyInformation/NCBI

:/genbankEuropeanBioinformaticsInstitute/EMBL-EBI:http://www.ebi.ac.uk/DNADataBankofJapan/DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html341.直接從基因組中擴(kuò)增（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增適合擴(kuò)增原核生物基因。35原核基因組部分原核細(xì)胞提取基因組DNAPCR擴(kuò)增36（1）提取基因組totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2.從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR適合擴(kuò)增真核生物基因。37目的基因的引物1反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNA第一鏈目的基因的引物2目的基因cDNA第二鏈PCRmRNA38化學(xué)合成法1976年H.G.Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。化學(xué)合成目的基因的前提：核苷酸序列已知目前通用的合成方法：固相磷酸三酯合成法39核苷酸1的3’-OH端在合成開始時(shí)就已經(jīng)附著在惰性的固相載體上，同時(shí)它的脫氧核糖環(huán)的5’-OH基團(tuán)也已用二甲氧基三苯甲基(DMT)保護(hù)起來。這種固相載體典型的情況是使用可控微孔玻璃(CPG)。40固相磷酸三酯合成過程結(jié)果是全保護(hù)的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對(duì)氯苯。最后脫保護(hù)。合成的一個(gè)循環(huán)周期分為如下步驟：第一步，脫三苯甲基作用(detritylation)酸處理法，脫去與核苷酸1的5’-OH基團(tuán)偶聯(lián)的保護(hù)基團(tuán)DMT。在這種脫DMT反應(yīng)中，常用的酸是二氯乙酸(DCA)或三氯乙酸(TCA)；42第二步，偶聯(lián)反應(yīng)(coupling)。通過一種弱堿——四唑(tetrazole)的催化反應(yīng)，使加進(jìn)來的第二個(gè)核苷酸(N2)同已附著在固相載體上的核苷酸1之暴露的5’-OH基縮合；43第三步，封端反應(yīng)(capping)。由加入的乙酸酐(aceticanhydride)激發(fā)乙?；饔?，把所有的沒有參與偶聯(lián)反應(yīng)的5’-OH基團(tuán)全都封閉起來；44第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸N1和N2之間新形成的3’-5’亞磷酸三酯鍵十分活躍。利用碘液催化作用，使之被氧化成為相