植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立與應(yīng)用

植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立與應(yīng)用

0植物基因功能及基因外源基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用和完善隨著大量序貫的完成，植物基因功能的研究進(jìn)入了更深、更廣泛的階段。目前,對(duì)植物基因功能的研究主要通過(guò)轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因沉默等方法。如:王力娜等克隆分析了與棉花開(kāi)花有關(guān)的MADS-box基因家族,并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其中2個(gè)基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證;李蓓等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)TsVP的抗旱玉米,雖然分析F1代有抗旱性,但由于獲得純系玉米的實(shí)驗(yàn)周期比較長(zhǎng),不易在短期內(nèi)驗(yàn)證基因功能;此外植物中的基因敲除、基因沉默主要通過(guò)隨機(jī)插入突變引起基因失活,但有時(shí)會(huì)引起染色體重排,以致突變體表型與隨機(jī)插入無(wú)關(guān),而且對(duì)插入位點(diǎn)的確定、遺傳學(xué)分析都比較困難。因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因和基因沉默技術(shù)驗(yàn)證基因功能,存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且結(jié)果不一定理想等問(wèn)題;此外,一些植物外源基因轉(zhuǎn)化體系不易建立,也影響了利用轉(zhuǎn)基因的方法檢測(cè)、驗(yàn)證基因功能。因此在利用上述經(jīng)典方式研究基因功能的同時(shí),有必要建立一些快速驗(yàn)證基因表達(dá)、檢測(cè)蛋白質(zhì)互作、短期內(nèi)能高效表達(dá)外源蛋白質(zhì)的新方法。瞬時(shí)表達(dá)是指引入細(xì)胞的外源DNA和宿主細(xì)胞染色體DNA并不發(fā)生整合,而是隨載體進(jìn)入細(xì)胞后12h左右就可表達(dá),基因產(chǎn)物在2~4天內(nèi)即可被檢測(cè)出。由于瞬時(shí)表達(dá)能表達(dá)多種外源基因,而且時(shí)間短,重復(fù)性好,彌補(bǔ)了常規(guī)轉(zhuǎn)基因方式中周期長(zhǎng),轉(zhuǎn)化效率低等一些缺點(diǎn)。因此,不同物種的瞬時(shí)表達(dá)體系也逐漸被建立。目前,植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)已被陸續(xù)應(yīng)用到生物學(xué)的許多研究中,尤其是利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因功能的鑒定分析、發(fā)現(xiàn)新型強(qiáng)啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)互作、亞細(xì)胞定位等方面;此外,該系統(tǒng)也可表達(dá)外源基因生產(chǎn)重組蛋白,為疫苗、抗體、生物制藥的研發(fā)開(kāi)辟了捷徑。本研究就植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的起源,建立方法,應(yīng)用等方面進(jìn)行了概述,同時(shí)也針對(duì)該系統(tǒng)在應(yīng)用中存在的不足提出了相應(yīng)的建議。1植物基因突變基因瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)起源于20世紀(jì)六七十年代,稱為第一代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。此時(shí)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)主要應(yīng)用于離體細(xì)胞、原核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的瞬時(shí)表達(dá)。Hoerz等利用蛋白質(zhì)的瞬時(shí)表達(dá)分析了網(wǎng)織紅細(xì)胞多核糖體中初始蛋白質(zhì)的合成;Kryzek等研究了大腸桿菌argECBH基因簇在瞬時(shí)表達(dá)中的調(diào)控機(jī)制;隨著生物學(xué)研究的不斷深入,有關(guān)瞬時(shí)表達(dá)的應(yīng)用也加快了步伐,如Klein等用基因槍成功地將外源DNA轉(zhuǎn)入完整的洋蔥表皮細(xì)胞,在2~4天內(nèi)表達(dá)了外源基因;第二代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的研究以原生質(zhì)細(xì)胞為受體,如Fromm等采用電穿孔技術(shù),將pNosCAT和pCaMCATV質(zhì)粒轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體,得到瞬間表達(dá)。但第二代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化頻率低,一般為10-6~10-2,且操作前需要準(zhǔn)備大量的原生質(zhì)體。第三代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)主要在植物活體中進(jìn)行相關(guān)的研究,不同物種的瞬時(shí)表達(dá)體系也逐漸被建立。如柳枝稽瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)、優(yōu)化的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)、草莓瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)、萵苣瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)、還有油菜籽、洋蔥、黃瓜等植物的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)也被研發(fā)并應(yīng)用。利用瞬時(shí)表達(dá)體系有助于研究本物種的相關(guān)基因及蛋白功能,Li利用擬南芥瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究了d35s啟動(dòng)子活性、擬南芥中3個(gè)基因(At3g51660、At1g01170、At2g47840)的亞細(xì)胞定位及蛋白互作等相關(guān)問(wèn)題;同時(shí)該系統(tǒng)也可表達(dá)外源基因生產(chǎn)重組蛋白,為疫苗、抗體、生物制藥的研發(fā)開(kāi)辟捷徑,如Raffaele在煙草中瞬時(shí)表達(dá)了HIV-1的輔助蛋白Nef,為HIV疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ);Jussi在煙草瞬時(shí)表達(dá)體系中高效表達(dá)了來(lái)源于里氏木霉的疏水蛋白質(zhì)基因。尤其在最近十幾年內(nèi),隨著瞬時(shí)表達(dá)與免疫組化、激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)的結(jié)合,利用該系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)基因、蛋白質(zhì)方面的研究也越來(lái)越多,并開(kāi)始向環(huán)境檢測(cè)、病毒防治、微生物利用、細(xì)胞骨架等方面擴(kuò)展,標(biāo)志著瞬時(shí)表達(dá)體系在不斷完善的同時(shí)也將進(jìn)入更先進(jìn)的一代。2基于植物的立即表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)方法植物中建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的方式有:PEG法、電激法、基因槍法、浸泡和摩擦接種法、病毒感染法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。2.1原生質(zhì)體的制備困難該方法介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,是最早建立植物細(xì)胞瞬間表達(dá)的技術(shù),但是轉(zhuǎn)化率低、需要處理大量的原生質(zhì)體且原生質(zhì)體的培養(yǎng)較困難,也無(wú)法對(duì)組織、器官等特異性基因進(jìn)行研究而逐漸被淘汰。2.2植物基因組織通過(guò)動(dòng)力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒(DNA吸附在表面)以一定的速度射進(jìn)植物細(xì)胞,由于顆粒小穿透力強(qiáng),故不需去除細(xì)胞壁就可進(jìn)入植物組織細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn):無(wú)宿主限制,靶受體類型廣,具有潛在分生能力的組織細(xì)胞幾乎都可以;操作簡(jiǎn)單、快速。缺點(diǎn):轉(zhuǎn)化率低;基因的整合位點(diǎn)不固定,易造成外源基因丟失,而不利于表達(dá);此外,基因槍的費(fèi)用較高。2.3泡沫和摩擦繁殖法將實(shí)驗(yàn)材料浸泡在外源基因的翻譯產(chǎn)物RNA中或?qū)⑵渫磕▏姙⒃诓牧媳砻?。該方法?duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求比較高,而且方式繁瑣、不易操作。2.4外源基因檢測(cè)以重組病毒作為載體感染植物細(xì)胞建立瞬間表達(dá)系統(tǒng),其轉(zhuǎn)化方式如下圖1所示。其特點(diǎn):不產(chǎn)生可遺傳的后代,降低了基因漂移和病毒大規(guī)模感染的風(fēng)險(xiǎn);載體穩(wěn)定,表達(dá)水平高;操作簡(jiǎn)便。近年來(lái)利用病毒攜帶外源基因轉(zhuǎn)入植物已有較成熟的技術(shù),如豇豆花葉病毒CPMV、煙草花葉病毒TMV、普通花葉病毒PVX,TEV、TMV和PVY也是目前常用的病毒載體,此外個(gè)別TMV、PVX可以侵染單雙子葉植物,擴(kuò)大了寄主范圍。但用此種方法,需將病毒本身的一些致病基因刪除,以免導(dǎo)致植物感染病毒,引起植物病變或基因組發(fā)生變異,而不利于外源基因的表達(dá)。2.5常用載體和使用的菌株將攜帶外源基因的農(nóng)桿菌利用真空滲透或直接注射到組織細(xì)胞中,利用質(zhì)粒T-DNA區(qū)的轉(zhuǎn)移進(jìn)行轉(zhuǎn)染,是研究植物轉(zhuǎn)基因的常用方法之一,也是目前建立瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)先選擇。其流程如下圖2所示。目前常用載體有pBIl2l、pMOG800等,常用農(nóng)桿菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、AGLl等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法操作簡(jiǎn)便,易于轉(zhuǎn)染,但轉(zhuǎn)染的宿主有限,常被用來(lái)轉(zhuǎn)染雙子葉植物,單子葉中的應(yīng)用相對(duì)較少。而且一些外源基因可在農(nóng)桿菌中表達(dá)造成假陽(yáng)性,為避免該現(xiàn)象可構(gòu)建攜帶內(nèi)含子的質(zhì)粒作為載體,如p2301質(zhì)粒、Pcambia1301質(zhì)粒等。由于內(nèi)含子在真核生物mRNA成熟過(guò)程中可被精確地切除,而原核細(xì)胞不具有剪切內(nèi)含子的功能,從而可避免由于農(nóng)桿菌中遺漏表達(dá)造成的假陽(yáng)性。3高通量基因和蛋白質(zhì)的應(yīng)用植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)方便、簡(jiǎn)捷,可快速達(dá)到高通量篩選、鑒定基因和蛋白質(zhì)的要求,可應(yīng)用于研究啟動(dòng)子活性、基因功能、生產(chǎn)外源蛋白、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面。3.1快速探索植物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)植物基因的啟動(dòng)子包含多種重要的順式作用元件,這些元件和轉(zhuǎn)錄因子相互作用在轉(zhuǎn)錄水平上控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度,進(jìn)而調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)。將啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因(Gus、GFP、Luciferase等)融合構(gòu)建表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞,通過(guò)報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá),短時(shí)間內(nèi)即可確定啟動(dòng)子活性以及活性的強(qiáng)弱,如謝迎秋通過(guò)將棉花曲葉病毒(CLCuV)啟動(dòng)子在煙草和棉花中建立瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子是一種新型雙向強(qiáng)啟動(dòng)子,可應(yīng)用于雙子葉植物尤其棉花的遺傳轉(zhuǎn)化中;Koia等通過(guò)該系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)菠蘿的轉(zhuǎn)錄因子SUI1和L36啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)Gus在擬南芥中的表達(dá);該系統(tǒng)也可快速確定同一啟動(dòng)子在不同植物中或同一植物中不同部位的作用,李昊通過(guò)Gus基因的瞬時(shí)表達(dá),快速分析了毛白楊LEAFY同源基因PtLFY啟動(dòng)子在煙草不同部位的表達(dá)活性;Toshiki則利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究了紅藻紫屬中啟動(dòng)子在配子體和孢子體不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制;唐杏?jì)傻韧ㄟ^(guò)瞬時(shí)表達(dá)分析菊花葉片中CmDFR啟動(dòng)子片段發(fā)現(xiàn),除了含有TATA-box、CAAT-box等基本的元件外,還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的元件。上述研究表明瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可應(yīng)用于植物中啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄元件的功能分析,發(fā)掘有用的強(qiáng)啟動(dòng)子,加快植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)程;同時(shí)了解啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的影響,以應(yīng)用于基因工程中提高或改進(jìn)外源基因的表達(dá)。3.2基因表達(dá)系統(tǒng)基因組測(cè)序的發(fā)展使大量基因的克隆和定位不斷完成,但對(duì)它們的表達(dá)行為、產(chǎn)物性質(zhì)及定位的認(rèn)識(shí)并不清楚,基因與表型的對(duì)應(yīng)關(guān)系以及基因的功能分析則成為迫在眉睫的問(wèn)題。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可在短時(shí)間內(nèi)操縱組織細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)與沉默,加快基因的研究。竺曉平等利用馬鈴薯X病毒CP基因的瞬時(shí)表達(dá)在轉(zhuǎn)化植物前快速地檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)情況以及表達(dá)產(chǎn)物的功能,節(jié)約時(shí)間和資源,也減少實(shí)驗(yàn)的盲目性;Pudota等通過(guò)馬鈴薯瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析了大量晚期抗枯萎病基因RB,快速鑒定了各種RB基因的功能,加速了對(duì)馬鈴薯基因功能的研究。樹(shù)木的生長(zhǎng)周期一般較長(zhǎng),利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其基因結(jié)構(gòu)功能的分析較少,但瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立為其研究開(kāi)辟了一條捷徑。雷蓉華通過(guò)APX基因(表達(dá)抗壞血酸過(guò)氧化物酶)在蘋果葉片中建立了瞬時(shí)表達(dá)體系,優(yōu)化了蘋果的遺傳轉(zhuǎn)化體系;Zhang等通過(guò)樺樹(shù)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析了肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因的過(guò)量表達(dá)和基因沉默,為下一步的研究奠定基礎(chǔ);近年來(lái),瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在白楊樹(shù)、楤木、柳樹(shù)、桑樹(shù)以及一些草本植物中也得到成功應(yīng)用。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)還具有高通量篩選鑒定基因和蛋白的功能,快捷靈敏地檢測(cè)、解析基因的剪接加工機(jī)制,如Craig等用此系統(tǒng)構(gòu)建了含5個(gè)基因的融合載體,并對(duì)其功能進(jìn)行了逐步的探索;高少培等利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),對(duì)水稻BADH2和擬南芥GR7基因片段的轉(zhuǎn)錄后剪接加工機(jī)制進(jìn)行了研究,并發(fā)現(xiàn)一些重要的剪接調(diào)控元件。3.3實(shí)時(shí)時(shí)域作用對(duì)植物抵抗tmv的影響RNA是生物體和生物細(xì)胞完成遺傳和表達(dá)不可或缺的物質(zhì),利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)與RNA干擾、RNA沉默技術(shù)相結(jié)合對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)研究,高效識(shí)別不同種類RNA的功能特點(diǎn),增加產(chǎn)物的多樣性。如Cao等利用基因的瞬時(shí)表達(dá)鑒定了家蠶中調(diào)控蠶絲蛋白L鏈中41個(gè)保守的miRNA并確定了其中4個(gè)miRNA的功能特點(diǎn);趙明敏也利用該技術(shù)研究了同源于TMV外殼蛋白的siRNA對(duì)TMV侵染的干擾機(jī)理,為植物抵抗TMV的感染提供理論基礎(chǔ);Pavan等利用雙鏈RNA干擾煙草天蛾自身基因的表達(dá),從而使CYP6B46,CYP4M1和CYP4M3基因在其體內(nèi)得到瞬間表達(dá),進(jìn)而分析了CYPs類基因的功能。瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)的運(yùn)用還有助于了解vsiRNAs的組成、調(diào)控基因表達(dá)的潛力,以及病毒中RNA沉默抑制子(RSSs)的作用機(jī)制,為植物抵抗病毒的感染提供新策略。郝興安等運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)黃瓜壞死病毒(CNV)p20蛋白的功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)CNVp20在瞬時(shí)表達(dá)中不能有效抑制RNA沉默;景秀麗利用植物中建立的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析鑒定了6種禽類病毒對(duì)RNA沉默抑制的功能,并初步明確了HVT063和NS1的沉默抑制特點(diǎn)及作用機(jī)理。3.4重組蛋白及重組基因的活性作為一種安全、高效快速的外源蛋白生產(chǎn)體系——植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展的一種新型蛋白表達(dá)方式。該系統(tǒng)不需要經(jīng)歷植物組織培養(yǎng)即可在短時(shí)間內(nèi)、以低廉的成本獲得多種外源蛋白,且外源蛋白產(chǎn)量高、易于純化,為藥用蛋白的表達(dá),各種疫苗的研發(fā)提供一條捷徑,也使植物成為快速高效表達(dá)外源基因的一個(gè)工廠。目前已有多種抗體、生長(zhǎng)因子、激素、重組酶及多種疫苗分別在煙草、豆類、玉米、番茄、香蕉及萵苣等植物中成功表達(dá)。Noemi等將人乳頭瘤病毒16L2型與馬鈴薯X病毒融合后,瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證了植物是生產(chǎn)肽抗原的良好場(chǎng)所,為生產(chǎn)各種疫苗提供了實(shí)際經(jīng)驗(yàn);楊鳳萍利用病毒載體在煙草中的瞬時(shí)表達(dá),快速評(píng)估了外源基因HBsAg重組蛋白的免疫活性;劉月英等用馬鈴薯病毒X(pGR107)做載體在煙草中瞬時(shí)高效表達(dá)了人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF),表達(dá)量達(dá)總可溶性蛋白0.0103%,并具有良好的生物活性。表1為利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的部分實(shí)例。3.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位亞細(xì)胞中分布著參與細(xì)胞新陳代謝的多種蛋白質(zhì)和酶,已有證據(jù)表明,亞細(xì)胞中的蛋白質(zhì)亞組,經(jīng)常共同作用行使一定的功能。因此了解亞細(xì)胞定位是全面理解細(xì)胞整體功能的重要環(huán)節(jié)。利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速高效的亞細(xì)胞定位,如李超利用豌豆花瓣中建立的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),分析了由于CYCLOIDEA(CYC)類TCP蛋白亞細(xì)胞定位的不同,導(dǎo)致TCP基因在豆科與玄參科植物中具有不同的功能;Zhang等運(yùn)用該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了水稻葉綠體中參與光合作用的一些酶;而朱丹等則利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證了可用于植物亞細(xì)胞定位的載體卡盒pCEG。3.6免疫熒光技術(shù)蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物,其功能是生物性狀的直接體現(xiàn)。蛋白質(zhì)、酶通常相互作用在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控中扮演著重要的作用。植物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合熒光蛋白融合技術(shù)或免疫熒光技術(shù)可用于蛋白質(zhì)水平的研究,快速檢測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的分布,驗(yàn)證蛋白互用,揭示配體與受體的識(shí)別機(jī)理等。早在1987年Ballas等就利用質(zhì)粒的瞬間表達(dá)檢測(cè)了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的活性;植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)也逐漸應(yīng)用于特異性蛋白的表達(dá)、互作機(jī)制等方面的研究,曹友志利用楊樹(shù)瞬時(shí)表達(dá)體系從25個(gè)候選效應(yīng)因子中篩選出4個(gè)重要的效應(yīng)因子。這都充分表明植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可用于酶活性的測(cè)定、效應(yīng)因子的篩選、蛋白調(diào)控等方面,加快蛋白質(zhì)組學(xué)的研究步伐。4勞動(dòng)時(shí)間和基因表達(dá)系統(tǒng)綜上所述,植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)為快速的表達(dá)外源蛋白提供了一個(gè)理想的工作平臺(tái),尤其對(duì)生產(chǎn)口服疫苗或藥用蛋白。一方面縮短了實(shí)驗(yàn)周期、降低了實(shí)驗(yàn)成本;另一方面植物作為生物反應(yīng)器安全、外源蛋白質(zhì)產(chǎn)量高、易于純化等目前已得到了廣泛的應(yīng)用。但瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)也存在一些問(wèn)題:(1)由于不產(chǎn)生可穩(wěn)