5.3 基因克隆技術(shù)課件

5.3基因克隆技術(shù)基因克?。ǚ肿涌寺olecularcloning）----通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體,并導入受體細胞，進行永久保存和復(fù)制的過程。

以質(zhì)粒為載體的

DNA

克隆過程目錄具體流程（一）目的基因的獲取（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.分離克隆差別表達的基因

*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.分離克隆差別表達的基因

組織或細胞染色體DNADNA片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.分離克隆差別表達的基因

cDNA文庫的構(gòu)建

真核生物基因組DNA十分龐大，而且含有大量的重復(fù)序列。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個主要困難。

cDNA文庫比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選到目的基因。定義：（cDNALibrary）

某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。原理：

將帶poly(A)的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接。mRNAcDNA雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶

載體

受體菌

復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄打開雙鏈cDNA合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)

一、制備用于克隆cDNA的mRNAmRNA的制備動物細胞mRNA的制備植物細胞mRNA的制備關(guān)鍵問題：制備mRNA(參考書p172)二、cDNA第一鏈的合成１、oligo(dT)引導的DNA合成法：

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。２、隨機引物引導的cDNA合成法見書圖P174

根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3’-末端的oligo(dT)引物一處開始。三、cDNA第二鏈的合成1、自身引導合成法：

單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。三、cDNA第二鏈的合成1、自身引導合成法：單鏈cDNA的3’端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點：

在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導致對應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。2、置換合成法原理：以RNA酶H在第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈。優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA四、雙鏈cDNA分子與載體進行連接

將合成的雙鏈重組到質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主細胞增殖。cDNA文庫的構(gòu)建由于種種原因（例如RNA制備過程中，由于RNA不穩(wěn)定，獲得5′端或3′端序列缺失的非全長mRNA。以此為模版合成非全長cDNA。）cDNA常用cDNA文庫的構(gòu)建技術(shù)獲得的cDNA并不是全長cDNA，通常5′端或3′端序列缺失。常用RACE技術(shù)克隆缺失的5′端或3′端缺失序列。RACE技術(shù)（rapidamplificationofcDNAends）是一項在已知cDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5′端或3′端缺失序列的技術(shù)。獲得高質(zhì)量總RNA去磷酸化去掉mRNA5′帽子結(jié)構(gòu)加特異性RNA寡聚接頭合成第一條cDNA鏈5′RACE3′RACE將純化后的PCR產(chǎn)物克隆到載體DNA中，進行序列分析RACE主要操作方法RACE技術(shù)的作用1.獲取全長cDNA序列。2.有助于研究5′端和3′端非編碼序列。研究轉(zhuǎn)錄起始位點，啟動子等?；蛭膸斓暮Y選課本p176.３.RT-PCR

RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA，再經(jīng)PCR擴增，大大提高mRNA的檢出靈敏度。主要應(yīng)用于基因表達與調(diào)控的研究。可用于克隆已知部分序列的基因（片段）的克隆。綜合性實驗。RT-PCRRT-PCRcDNA（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.分離克隆差別表達的基因

4分離克隆差別表達的基因基因的差別表達

根據(jù)表達特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因（house-keepinggene），以其組成型表達模式維持細胞的基本代謝活動；另一類叫做發(fā)育調(diào)控基因（developmentalregulatedgene），以其時空特異性表達模式完成個體的正常生長、發(fā)育與分化，我們將不同基因在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的按時間、空間進行有序表達的方式稱為基因的差別表達（differentialexpression）。應(yīng)用mRNA差別顯示技術(shù)

分離克隆目的基因1992年，美國波士頓Dena-Farber癌癥研究所的兩位科學家P.Liang和A.D.Pardee發(fā)明了一種叫做mRNA差別顯示PCR（mRNAdifferentialdisplay）技術(shù)，簡稱DDRT-PCR，可以從一對不同類型的細胞群體有效地分離并鑒定差別表達的基因。應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因cDNA差示分析法-RDA法(RepresentationalDifferenceAnalysis)充分發(fā)揮了PCR以指數(shù)形式擴增雙鏈DNA模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異擴增了目的基因片段。試驗對象（Tester）供試探針（Driver）4堿基切割酶處理平均長度256bp的代表群cDNAcDNA加12/24堿基接頭補平末端以24堿基的互補序列為引物進行PCRT改換新接頭D不加接頭雜交：T:D=1:100設(shè)計新接頭引物PCR指數(shù)擴增產(chǎn)物差異產(chǎn)物具體流程（一）目的基因的獲?。ǘ┛寺≥d體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建

分子克隆載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞的DNA分子。

將重點講述分子克隆載體的特點;常見分子克隆載體;

分子克隆載體總述１、載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力為外源基因的擴增提供必要的條件２、載體特點至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。2.

至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3.

至少應(yīng)有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞多克隆位點ori復(fù)制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體載體類型１、質(zhì)粒載體２、噬菌體載體３、cosmid克隆載體４、噬菌粒載體５、酵母人工染色體載體６、細菌人工染色體載體質(zhì)粒(plasmid)

獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

chromosomePlasmid1、質(zhì)粒是細菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)。３、質(zhì)粒DNA在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核和真核細胞中均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應(yīng)用廣泛。質(zhì)粒的生物學特性４、根據(jù)每個寄主細胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，把質(zhì)粒分為嚴緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-5個）與松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達10-200甚至更多個拷貝）。因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。6、質(zhì)粒的不相容：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。T載體的T-A克隆原理：T-vector兩條鏈的5’端含有一個游離的T，

PCR過程中，普通的Taq酶可在產(chǎn)物的3’端多加一個A穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）

是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的寄主細胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體具體流程（一）目的基因的獲?。ǘ┛寺≥d體的選擇和構(gòu)建（三）外源基因與載體的連接（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄不同限制酶切位點的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15