環(huán)境微生物轉錄組學研究進展

環(huán)境微生物轉錄組學研究進展

自20世紀90年代以來，生物技術的快速發(fā)展極大地促進了人們對自然微生物多樣性的了解。特別是近年來隨著高流量統(tǒng)計數(shù)據(jù)的開發(fā)，全面微生物完整序列的研究已成為一種傳統(tǒng)的實驗手段。但是基因組序列本身不能提供微生物的基因功能信息,因此開展微生物轉錄組學研究尤為重要。環(huán)境微生物轉錄組學以環(huán)境樣品中微生物的全部轉錄本即mRNA為研究對象,從群體水平上研究環(huán)境微生物功能基因的表達水平及其在不同環(huán)境條件下的轉錄調(diào)控規(guī)律,是一門研究微生物與自然環(huán)境相互關系的新興學科。然而,環(huán)境微生物轉錄組學的研究進展非常緩慢,主要因為:(1)mRNA占環(huán)境樣品總RNA中提取量的比例較低,通常僅為1–5%(Neidhardt&Umbarger,1996);(2)mRNA非常不穩(wěn)定,極易被RNases降解,半衰期在幾秒到幾分鐘之間(Deutscher,2006);(3)原核生物mRNA通常無多聚A尾,無法像真核生物mRNA那樣可通過oligo(dT)引物直接選擇(Poretskyetal.,2005);(4)后續(xù)的分析中均涉及到大量的酶促反應如PCR擴增和測序,但因環(huán)境樣品組成復雜,其中的重金屬和腐殖質等物質都可能降低RNA純度,嚴重干擾下游分析;(5)測序技術是環(huán)境轉錄組學發(fā)展的重要技術瓶頸,單個微生物細胞的基因通常高達上千個,復雜環(huán)境中微生物的基因數(shù)量更是難以估算,而傳統(tǒng)的測序技術通量較低,每次僅獲得幾百個mRNA序列,信息量較小,很難獲得令人信服的微生物生理代謝過程的原位證據(jù);同時傳統(tǒng)測序技術依賴于克隆文庫構建,費時費力且成本高昂,無法應對轉錄組研究對大規(guī)模測序的需求。自2008年以來,DNA測序技術取得了重大突破,基于不同原理的新一代高通量測序技術逐漸成為目前的主流平臺(Shendure&Ji,2008)。與傳統(tǒng)的Sanger測序法相比,新一代測序技術的效率大幅提高,一次測序可以獲得高達上百萬的通量,單個堿基的測序成本也大幅下降。新一代測序技術的快速發(fā)展催生了RNA-Seq(High-throughputRNAsequencing)技術的出現(xiàn)。RNA-Seq是利用新一代高通量測序技術對轉錄組進行分析的技術(Wangetal.,2009b),相比其他基于雜交技術的芯片技術(microarrays)(Schenaetal.,1998)、基于序列分析的基因表達系列分析(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)(Velculescuetal.,1995)及其改進版的大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)(Brenneretal.,2000),RNA-Seq具有明顯的優(yōu)勢,如檢測范圍廣、無需特異性探針、高靈敏度等(Qietal.,2011)。RNA-Seq使復雜環(huán)境樣品中微生物轉錄組學研究變得簡單易行,近年來在水體(Frias-Lopezetal.,2008;Gilbertetal.,2008;Hollibaughetal.,2011)、土壤(Leiningeretal.,2006;Urichetal.,2008)、污泥(Yu&Zhang,2012)、沉積物(Millsetal.,2012)、動物腸道(Poroykoetal.,2010;Turnbaughetal.,2010)等多種環(huán)境中得到廣泛應用,在環(huán)境微生物學領域受到極大關注。1環(huán)境中的微生物轉移技術流程環(huán)境微生物轉錄組學的技術流程可大致分為以下幾個步驟:1.1采集和保存方法環(huán)境樣品一般分為水樣、土壤和寄主樣品(如人體微生物)三大類,不同樣品類型決定了具體的采集和保存辦法。一般的原則是嚴格控制樣品采集的時間,樣品采集后要利用液氮原位快速冷凍,并置于-70℃長期保存,或者將樣品浸入RNA保存液(如Ambion公司的RNAlater保存液)中,-20℃長期保存。1.2rna提取試劑盒不同環(huán)境來源的樣品RNA的提取方法各不相同,但一般都包括細胞裂解、蛋白抽提、核酸沉淀、DNA酶解等步驟。另外,有多種商業(yè)化的RNA提取試劑盒可供選擇,如RNeasyMiniKit(Qiagen)、mirVanamiRNAIsolationKit(Ambion)、PowerSoil?TotalRNAIsolationKit(MoBioLaboratories)等。1.3非試劑盒測定由于mRNA在總RNA中含量很低,所以通常情況下需要對mRNA進行富集。由于原核生物的mRNA不含多聚A尾,所以不能用oligo(dT)直接進行選擇,只能通過消減rRNA的方法間接富集mRNA。這一步驟一般采用試劑盒進行,如Ambion公司的MICROBExpress?BacterialmRNAEnrichmentKit、EpiCentre公司的mRNA-ONLY?ProkaryoticmRNAIsolationKit等,還有一些非試劑盒的物理化學方法。通常情況下,mRNA的含量會提高數(shù)倍到數(shù)十倍,最高可達95%左右(Giannoukosetal.,2012)。此外,mRNA可以用化學水解法或酶降解法生成較小的片段以適應測序平臺的需要,例如,Illumina或SOLiD測序平臺適合200–250nt大小的片段(Chu&Corey,2012)。片段化步驟也可以在cDNA合成后進行。1.4c有效使用可實現(xiàn)cd的第二鏈以富集后的mRNA為模板,經(jīng)反轉錄酶催化生成cDNA的第一鏈,再經(jīng)DNA聚合酶等多種酶的共同作用生成cDNA的第二鏈。這一步驟的實現(xiàn)也有多種試劑盒可供選擇,如Invitrogen的SuperScript?Double-StrandedcDNASynthesisKit,Promega公司的UniversalRiboClone?cDNASynthesisSystem等。引物一般選擇隨機六聚體引物。1.5測序步驟不同純化后的cDNA經(jīng)過一系列的前處理后,進行高通量測序。這些步驟隨不同的測序平臺而有差異。通常情況下,高通量測序的數(shù)據(jù)為FASTQ格式,數(shù)據(jù)分析的過程因樣品類型和研究目的不同而具有明顯的差異,在數(shù)據(jù)處理及分析部分會詳細闡述。2目標微生物的rna含量和測序量環(huán)境微生物樣品和純培養(yǎng)菌株樣品在許多方面存在差異,首先是環(huán)境樣品微生物多樣性雖然高,但目標微生物的RNA含量非常低,受到樣品量的限制,大多數(shù)情況下不能滿足測序量的要求;其次是環(huán)境樣品中存在多種雜質如腐植酸的干擾,另外物種組成非常復雜,rRNA消減程度有限,這些都加大了環(huán)境樣品研究的難度。但近年來,這些方面的研究都有不同程度的進展。2.1添加樣品量、純化程序及添加量高通量測序一般需要微克級的RNA,而RNA的產(chǎn)量受諸多因素的影響。以土壤樣品為例,土壤中活性微生物的多少、RNA提取方法的選擇以及樣品的純化步驟在很大程度上都可能影響RNA的產(chǎn)量。不同類型的土壤中活性微生物含量差別巨大,每克土壤RNA的提取量多則幾微克,少時僅幾十納克(Wangetal.,2012),因此增加樣品量是提高RNA產(chǎn)量的方法之一。RNA提取的方法有很多種,目前似乎沒有一種方法可適合于所有的樣品類型,即使同樣的樣品,用不同的方法提取,RNA產(chǎn)量也會有顯著差異。因此,需要根據(jù)樣品類型及研究目的選擇適當?shù)姆椒ɑ蚋倪M相應的技術。環(huán)境微生物轉錄組學研究一般包含多次RNA純化步驟,每次純化過程都會造成一定量的RNA損失,因此選擇質量好的純化試劑盒能夠最大程度地減少這一損失。除了在提取和純化過程中對流程進行優(yōu)化,在cDNA合成之前也可對mRNA進行擴增,Ambion公司的MessageAmp?BacteriaIIRNAAmplificationKit試劑盒可使RNA數(shù)量增加200–1,500倍,已在多個研究中得到應用(Frias-Lopezetal.,2008;Hewsonetal.,2010;deMenezesetal.,2012)。2.2rna的提取獲取高質量的RNA是轉錄組學研究的基礎。RNA純化試劑盒并不能除掉所有的雜質。以土壤樣品RNA提取為例,主要的挑戰(zhàn)是腐植酸的污染,它會在核酸提取過程中與核酸共沉淀,并對后續(xù)的酶反應造成不同程度的抑制。近年來有多種方法被證明能夠有效地去除腐植酸,并可應用到RNA提取過程中的不同階段,如控制裂解的溫度(Wangetal.,2009a)、低pH條件(Metteletal.,2010)、抽提液中加入CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)(Griffithsetal.,2000)或PVPP(polyvinylpolypyrrolidone)(Rajendhran&Gunasekaran,2008)、用PEG來沉淀RNA(Bürgmannetal.,2003)等。但有時僅改進提取條件仍然不夠,對于腐植酸含量高的樣品,需要對提取后的RNA進行進一步的純化,最近的研究認為柱純化方法,如SephacrylS-400凝膠過濾(Wangetal.,2009a)和Q-SepharoseFastFlow離子交換柱(Metteletal.,2010)是相對高效的方法。2.3mrna的富集和凈化盡管高通量測序可以獲得數(shù)量巨大的序列數(shù)據(jù),但由于mRNA在總RNA中的比例很低,為了提高測序的有效性同時也為了避免浪費,需要去除總RNA中的rRNA以便對mRNA進行富集,這也是轉錄組學研究中的一個重要步驟。目前mRNA的富集方法主要包括:基于消減雜交法的Ambion公司的MICROBExpress?BacterialmRNAEnrichmentKit和EpiCentre公司的Ribo-Zero?rRNARemovalKit,以及基于核酸外切酶法的EpiCentre公司的mRNA-ONLY?ProkaryoticmRNAIsolationKit。MICROB-Express?BacterialmRNAEnrichmentKit較早進入市場,目前使用非常廣泛,但是對于不同的環(huán)境樣品的富集效率差異較大(Stewartetal.,2010)。mRNA-ONLY?ProkaryoticmRNAIsolationKit的富集效果一般,相關研究報道很少。Ribo-Zero?rRNARemovalKit是由EpiCentre最新開發(fā)的,Giannoukos等(2012)評價了該試劑盒的rRNA去除效果,對于3種GC含量不同的純培養(yǎng)細菌的實驗結果,rRNA含量均可降至1%以下。通過與其他試劑盒的比較,作者認為Ribo-Zero?rRNARemovalKit效率最高。此外,該試劑盒對人糞便樣品來源的混合微生物中rRNA的去除效果也較好,rRNA也可降至5%以下,但對于其他類型的環(huán)境樣品,該試劑盒的處理效果還不清楚。最近,利用“not-so-random”六聚體引物在cDNA合成過程中選擇性富集mRNA的基本原理(Armouretal.,2009),NuGEN公司開發(fā)了一種Ovation?ProkaryoticRNA-SeqSystem試劑盒,該試劑盒可以單獨使用或者和已有的rRNA消減方法結合使用。另外,還有一種基于雙鏈特異性核酸酶(duplex-specificnuclease,DSN)的cDNA文庫標準化方法(Zhulidovetal.,2004),DSN在cDNA雙鏈變性和復性的過程中選擇性地降解數(shù)量較多的cDNA雙鏈,以此減少各種轉錄子的含量差異,有利于大量rRNA的去除和稀有轉錄子的檢測(Yietal.,2011)。但由于該方法會改變不同轉錄子的相對含量,因此不適合轉錄子的定量研究。除了以上提到的試劑盒方法,還有一些非試劑盒方法如切膠純化法(McGrathetal.,2008),通過將瓊脂糖電泳圖中rRNA之間的膠切下來回收達到去除rRNA富集mRNA的目的。但這種方法需要的RNA上樣量較大,而且無法回收和rRNA遷移率一樣的mRNA。另外,還可根據(jù)樣品的物種組成自行設計樣品特異性的反義rRNA探針用于消減rRNA(Stewartetal.,2010),但由于步驟繁瑣,尚未得到廣泛使用。3其他典型的測序平臺2005年以來,陸續(xù)誕生了多種新一代高通量測序技術平臺,如羅氏公司(Roche)的454高通量測序平臺、Illumina公司的Solexa平臺以及ABI公司的SOLiD平臺。由于這些平臺基于不同的測序原理,所以在平均讀長、數(shù)據(jù)量、錯誤類型、運行時間以及測序費用上均有一定差異,可根據(jù)自己的研究需要進行選擇(Chu&Corey,2012)。關于這些平臺的測序原理及性能比較的文獻已有很多(Shendure&Ji,2008),因此本文僅對這些具有代表性的平臺作簡要介紹。需要注意的是這些測序平臺的名稱在不同的文獻中可能有所不同,如有些文獻以其公司名指代,有些以具體的測序儀型號指代,還有的以其核心技術指代,如Riche454高通量測序平臺也稱焦磷酸測序(pyrosequencing)。3.1基于gsflx的新能源測序平臺2007年羅氏公司在454公司原有的GenomeSequencer20(GS20)測序儀的基礎上,推出第二代高通量測序儀GSFLX,系統(tǒng)性能有了顯著提高,這就是Riche454高通量測序平臺,是第一個商業(yè)化的新一代測序平臺。其基礎是焦磷酸測序技術。與其他測序平臺相比,該技術平臺最顯著的優(yōu)勢是序列有效讀長可達800bp,耗時較短,目前已發(fā)表的環(huán)境微生物轉錄組學相關研究文獻多數(shù)采用這種測序平臺。但缺點是測序通量較小、測序費用相對較高、準確率較低。3.2a測序平臺的核心技術Illumina公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer(GA,通常稱為Solexa儀)最早由Solexa公司研發(fā),后來包括Solexa公司和Illumina公司在內(nèi)的4個公司合并后,研發(fā)了目前的Illumina/Solexa測序平臺,其核心技術是“DNA簇”和“可逆性末端終結”(reversibleterminator)。該測序平臺具有多項優(yōu)越性能,如測序通量大、準確率高、成本低、所需樣品量少,最近逐漸開始在環(huán)境微生物轉錄組學研究中應用(Giannoukosetal.,2012;Xiongetal.,2012;Yu&Zhang,2012),具有很好的前景。其缺點是讀長較短、運行時間較長,但隨著技術的改進,這些不足正逐步得到改善。目前已有多種型號的測序儀可供選擇,如IlluminaHi-Seq和Mi-Seq高通量測序系統(tǒng)在序列讀長方面都有一定的提高,分別達到了150×2bp和250×2bp。鑒于微生物基因的大小通常為400bp左右,因此250×2bp的測序讀長可基本滿足序列分析的要求。3.3solid和其它高通量測序平臺SOLiD(supportedoligoligationdetetion)平臺是ABI公司自主研發(fā)的高通量測序平臺,與454及Solexa平臺基于邊合成邊測序(sequencingbysynthesis,SBS)不同,SOLiD的測序原理為基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測序法,其優(yōu)勢是測序通量大、準確率高、成本低,但同樣存在讀長短、運行時間長的缺點。使用該平臺的研究較少(Liuetal.,2011)。4數(shù)據(jù)分析工具與形式序列數(shù)據(jù)的分析是環(huán)境微生物轉錄組學研究的重點和難點。轉錄組數(shù)據(jù)分析涉及到一系列的工具和資源,形式主要有數(shù)據(jù)庫、門戶網(wǎng)站、網(wǎng)絡服務及一些單機程序(Cardenas&Tiedje,2008)。主要的分析步驟及常用的方法如下。4.1測序的去除、自適應調(diào)整RNA-Seq數(shù)據(jù)通常以FASTQ格式輸出和存儲,這個格式包括每個讀段(reads)的ID號、序列和質量分數(shù)。在進行正式的序列分析之前,一般需要對序列數(shù)據(jù)作一些預處理,如除掉一些短的、質量差的和低復雜度的序列(low-complexityreads,序列一般為幾個堿基的簡單重復),以及糾正一些測序錯誤。每個被測的堿基都有一個質量分數(shù)(qualityscore),代表著測序的精確度,低的質量分數(shù)預示著可能的錯誤。對于454和Illumina數(shù)據(jù)來說,目前已有相應的算法來完成錯誤的檢驗、去除或更正(Rougemontetal.,2008;Quinceetal.,2009)。還有一些測序前人為加上的測序接頭、標簽等也需要去除。另外,也可對序列的末端進行修剪,因為末端的錯誤率通常較高(Balzeretal.,2010)。由于測序長度通常局限在500bp以下,所以需要對這些讀段進行組裝以獲得全長的轉錄子序列。對于不同類型的數(shù)據(jù),有3種序列組裝策略可供選擇:有參考基因組的組裝(reference-based或abinitio裝配)策略、重頭組裝策略(denovostrategy)及上述兩種組裝策略的結合。每種組裝策略在原理、步驟、相應的序列定位及組裝工具及使用優(yōu)缺點上都存在差異,關于這些組裝策略及相關軟件的詳細介紹可參考Martin和Wang(2011)。對于微生物組成復雜的環(huán)境樣品來說,通常情況下并沒有可供參考的基因組,所以一般選擇重頭組裝策略,組裝的效果主要受測序深度的影響。經(jīng)過序列組裝可以大大減少后續(xù)的比對工作量,初步組裝后獲得的較長片段稱為Contig或序列重疊群,將已知的Contig用代表未知序列的N連接,可以進一步組裝成更長的片段,稱為Scaffold,再進一步進行補洞處理,可以得到含N量最少且兩端不能繼續(xù)延長的片段,稱為Unigene。組裝后的序列即可進行后續(xù)的序列比對及各種分析。4.2rrna序列的確定4.3基于序列的功能分析進行mRNA分析的工具較多,目前環(huán)境轉錄組學研究中最常用到的工具有MG-RAST(MetaGenomeRapidAnnotationusingSubsystemsTechnology)(Meyeretal.,2008)和MEGAN。MG-RAST是一種在線宏基因組和宏轉錄組分析工具,MEGAN是單機版軟件,目前MEGAN4版本的功能已有較大拓展,可同時對多個樣品進行基因功能比較分析,在環(huán)境轉錄組研究中應用非常廣泛。掌握這兩種工具即可完成環(huán)境轉錄組學分析的大部分工作。常見的幾類mRNA分析有分類學分析(taxonomicanalysis)、基因功能分析(functionalanalysis)、KEGGpathway分析和不同樣品間的基因表達差異分析。分類學分析的目的是確定mRNA來源于哪些物種。用blast軟件中BLASTx程序將除去rRNA后剩下的RNA序列翻譯為6種可能的氨基酸序列,與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對,常用的蛋白數(shù)據(jù)庫有NCBInr(noredundant)、COG(ClustersofOrthologousGenes)、UniProtKB/Swiss-Prot、PIR(TheProteinInformationResource)、KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)等。Bitscores大于設定值(如30),則認為該序列屬于putativemRNA轉錄子,結果輸出后用MEGAN等軟件進行后續(xù)的分析。MEGAN軟件使用LCA(LeastCommonAncestor)算法,參照NCBI分類學方法將序列進行分類,分類結果以樹狀圖的方式呈現(xiàn),樹的節(jié)點代表每個分類單元,匹配到該分類單元的序列數(shù)量也會標注出來,以方便比較這些分類單元在系統(tǒng)發(fā)育樹上的分布情況。分類結果由序列和分類單元間的匹配特異性程度決定:特異性程度越低,分類越偏向于分類樹的根部。功能分析指mRNA編碼基因的注釋(annotation)及其功能分類?；蜃⑨尩囊罁?jù)是序列之間的同源性,同源性高意味著功能上的高度相似性。通過BLASTx在各個蛋白數(shù)據(jù)庫中進行搜索,查找序列相似性最高的蛋白,從而獲知該mRNA編碼基因的功能注釋信息?；虻淖⑨屖呛罄m(xù)基因功能分類的基礎。利用GO(GeneOntology)、COG(ClustersofOrthologousGroups)及SEED等數(shù)據(jù)庫可以將已進行功能注釋的基因分到不同的基因家族中。GO是基因本體聯(lián)合會(GeneOnotologyConsortium)所建立的數(shù)據(jù)庫,分為分子功能(MolecularFunction)、細胞成分(CellularComponent)和生物過程(BiologicalProcess)三大部分,是應用最廣泛的一種基因功能分類體系(Ashburneretal.,2000)。使用Blast2GO軟件(Conesaetal.,2005)可對功能注釋后的基因進行GO功能注釋,然后再用WEGO軟件(Yeetal.,2006)統(tǒng)計GO功能分類,即可得知某個樣品中全部轉錄子的基因功能分布情況。COG數(shù)據(jù)庫即直系同源序列聚類數(shù)據(jù)庫,是根據(jù)系統(tǒng)進化關系對細菌、藻類和真核生物的數(shù)十個完整基因組的編碼蛋白分類構建而成,用于預測蛋白質的功能。利用COG下的COGNITOR程序,可以把某個蛋白質與所有COGs中的蛋白質進行比對,并把它歸入適當?shù)腃OG簇?；蚬δ芊诸愡€有一種重要的方法叫做SEEDsubsystem分類(Overbeeketal.,2005),通過MG-RAST可以對mRNA編碼基因進行SEEDsubsystem分類,SEED數(shù)據(jù)庫將不同功能的基因劃分到不同的subsystem中。MG-RAST是以RAST服務器(Azizetal.,2008)為基礎的改進版,通過一個免費注冊的賬號就可以自動進行功能基因的系統(tǒng)發(fā)育及功能分析。其優(yōu)點是能夠快速注釋大量的短片段DNA序列。如果研究人員不想將自己未發(fā)表的數(shù)據(jù)上傳到網(wǎng)上進行分析,還可下載單機版的MEGAN軟件。比較分析表明,在進行SEEDsubsystem分類時,對于同一樣品,MG-RAST和MEGAN匹配到各個subsystem的序列數(shù)量是非常相似的(Mitraetal.,2011)。KEGGpathway分析雖然本質上也是一種基因功能分析,但是相對于上述的功能分類方法更加系統(tǒng)化。pathway指的就是基因所參與的各種生物學過程,KEGG據(jù)此定義了自己的直系同源群,稱為KEGGOrthology(KO),每個KO都有一個收錄號,對應一個特定的pathway。通過KEGG可查詢包括碳水化合物、各種氨基酸、核酸及其他多種有機物的生物降解的可能代謝途徑,對代謝過程中相關的酶也進行了注釋,是一種生物代謝過程分析的強大工具。通過將待分析序列匹配到KO收錄號已知的參考序列,MG-RAST和MEGAN都可以完成未知樣品序列的KEGGpathway分析。但是在給出的pathway結果中,MG-RAST僅用一種顏色標示出現(xiàn)在pathway中的酶,而MEGAN可以用不同的顏色梯度來表征這些酶的相對含量,這非常有助于對酶動力學調(diào)控的理解(Mitraetal.,2011)。KEGGpathway分析有助于進一步了解mRNA編碼的基因產(chǎn)物參與的代謝通路及其行使的生物學功能(Altermann&Klaenhammer,2005;Kanehisaetal.,2008)。在環(huán)境轉錄組學研究中常常需要比較不同環(huán)境條件下樣品中的基因表達差異,MG-RAST和MEGAN均可完成這類比較分析。此外,RPKM(readsperkilobasespermillionreads)指數(shù)(Mortazavietal.,2008)在評估基因的表達水平時使用非常廣泛,計算公式為RPKM=109×(C/NL)。其中C代表匹配到某個基因的序列數(shù),N代表匹配到所有基因的序列數(shù),L代表該基因的核酸序列長度。RPKM方法消除了序列長度及測序深度對基因表達量評估的可能影響,可直接用于比較不同樣品間的基因表達水平差異。已有公開發(fā)表的軟件用于計算RPKM值,如Cufflinks(Trapnelletal.,2010)和DEGseq(Wangetal.,2010)。4.4提交序列提交5環(huán)境中微生物轉移的應用和前景5.1淡水生態(tài)環(huán)境基于RNA-Seq技術的環(huán)境微生物轉錄組學研究在近幾年發(fā)展非常迅速,目前已應用于水體、土壤、淤泥、沉積物、動物腸道等多種環(huán)境類型。水體的研究目前大多集中于海水樣品,以美國Georgia大學Moran教授課題組及美國麻省理工學院Parsons實驗室的DeLong教授課題組為代表,近年來對多個地區(qū)海水微生物樣品開展了一系列的轉錄組學研究,研究區(qū)域覆蓋太平洋、大西洋等多個海區(qū),類型涉及到表層海水(Frias-Lopezetal.,2008;Hewsonetal.,2010)、河口(Hollibaughetal.,2011)、人工模擬海洋生態(tài)系統(tǒng)(Gilbertetal.,2008)、海洋生物(水華藻類、海綿等)的附生微生物(Hewsonetal.,2009;Radaxetal.,2012)、海洋不同水層等(Stewartetal.,2011b)。對于淡水生態(tài)環(huán)境及內(nèi)陸水體的研究目前還很少見(Liuetal.,2011)。關于土壤、淤泥及沉積物的研究也有一些,涉及到的樣品類型有農(nóng)業(yè)土壤(Leiningeretal.,2006)、貧瘠的沙質草地(Urichetal.,2008)、溫帶森林表層土壤(Stewartetal.,2011a)、人工模擬土壤環(huán)境(deMenezesetal.,2012)、污水處理廠活性淤泥(Yu&Zhang,2012)、海底沉積物(Millsetal.,2012)等。此外,關于人和動物的腸道(Poroykoetal.,2010;Turnbaughetal.,2010;Gosalbesetal.,2011;Xiongetal.,2012)以及排泄物(Booijinketal.,2010)的微生物轉錄組學研究也有不少。5.2其他控制變量的研究RNA-Seq技術最顯著的特點是高通量,借助該技術,每個樣品可得到數(shù)十萬甚至上百萬條序列數(shù)據(jù),通過對這些海量數(shù)據(jù)的分析可以獲得傳統(tǒng)方法無法得到的信息。第一,高通量的數(shù)據(jù)促進了大量的功能未知的新基因及小RNA的發(fā)現(xiàn)。例如,在對太平洋表層海水樣品進行微生物轉錄組學分析后,發(fā)現(xiàn)高達50%的基因為新基因(Frias-Lopezetal.,2008);Gilbert等(2008)在挪威海岸一個人工模擬海洋生態(tài)系統(tǒng)(mesocosm)中進行的微生物轉錄組學分析顯示,RNA-Seq技術在環(huán)境微生物新基因的發(fā)現(xiàn)上具有強大的能力,在一些高度表達的大基因家族中,約91%的基因是新成員。另外,借助RNA-Seq技術,Shi等(2009)發(fā)現(xiàn)在海水中存在獨特的微生物小RNA群,它們和已知的小RNA不同,位于基因組上的基因間隔區(qū),推測可能具有基因調(diào)節(jié)功能。第二,通過比較微生物在不同環(huán)境(自然環(huán)境或人工控制環(huán)境)條件下的高通量轉錄組數(shù)據(jù),結合宏基因組及定量PCR等其他研究手段,有助于發(fā)現(xiàn)環(huán)境條件對微生物代謝活性的影響以及微生物應對環(huán)境變化而進行的轉錄調(diào)控,了解微生物的轉錄活性對時空變化的響應模式。這一類應用是多方面的,研究對象可以是樣品中的整個微生物群落。如Poretsky等(2009)通過比較北太平洋副熱帶環(huán)流系的微生物轉錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)該區(qū)域的微生物在白天的代謝活動主要集中在光合作用、氧化磷酸化及C1化合物的合成,到了夜間以細胞膜、氨基酸及維生素的合成代謝為主。Hewson等(2010)比較了全球開闊大洋中8個不同采樣點的微生物轉錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)不同位點的微生物基因表達差異主要集中在幾個關鍵的基因表達路徑上,包括光系統(tǒng)I、II和氨吸收,原因可能是海洋表層水中的優(yōu)勢微生物為光能自養(yǎng)的原綠球藻,不同采樣點微生物轉錄組的差異主要來源于這種藍細菌光營養(yǎng)代謝的差異。通過控制實驗或者與定量PCR等其他研究手段結合,也可以對某類功能菌群進行有針對性的研究。例如,通過分析加入菲的土壤樣品中的微生物轉錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)涉及芳香族化合物代謝及脅迫應答的轉錄子顯著增加,可以獲知多環(huán)芳烴(PAH)這類有毒污染物對土壤微生物活性的影響以及土壤微生物對PAH脅迫的應答模式;另外還第一次發(fā)現(xiàn)了重金屬P型ATP酶和硫氧還蛋白與PAH脅迫相關聯(lián)(deMenezese