濁漳河水體有機污染物對人外周血淋巴細胞遺傳毒性研究

濁漳河水體有機污染物對人外周血淋巴細胞遺傳毒性研究

根據(jù)流行病學(xué)研究，飲用水中的有機污染與某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。自從20世紀70年代Rook和Bellar等在飲用水中發(fā)現(xiàn)氯仿等含氯碳氫化合物以來,已有大量研究報道了有關(guān)進入水體的污染物大多數(shù)是存在致突變性的有機污染物。濁漳河是流經(jīng)山西省長治市的主要河流,是長治市12個縣(市)區(qū)工農(nóng)業(yè)及生活用水的主要來源之一,因此,查明濁漳河水體有機物污染狀況對加強水質(zhì)管理,保障人民健康具有重要意義。本文應(yīng)用人外周血淋巴細胞彗星試驗,對濁漳河水體中有機污染物的遺傳毒性進行了研究,以期為水體安全監(jiān)測提供快速、有效的測試方法和指標。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血液樣本1.2顆粒懸液的提取和富集在長治市濁漳河流域設(shè)置了3個采樣點,分別為石子河暴馬樣點、濁漳南源黃碾樣點、主干流石梁樣點,于2011年3月從每個樣點采集水樣各20L。靜置24h后,過濾去除懸浮顆粒。采用AmberliteXAD-2(Sigma)樹脂吸附柱富集,控制流速在30~40ml/min。N2排除水分,以甲醇、丙酮、二氯甲烷各50ml洗脫,洗脫液用氮吹儀在50℃下濃縮、吹干,再用二甲基亞砜(DMSO)溶解,定容至20ml(即水樣有機濃集物),4℃下避光保存,備用。1.3測試方法1.3.1巴細胞層不同濃度的染色人外周血淋巴細胞分離與染毒參照文獻的方法。將2ml新鮮肝素抗凝血加入5ml新配制的3%的明膠中混勻,垂直浸入37℃水浴中,自然沉降約30min。吸取淡黃色淋巴細胞層0.2ml于預(yù)先裝有0.8mlPBS緩沖液的微量離心管中混勻,3000r/m離心5min,棄上清,加入0.9mlPBS及0.1ml水樣濃集物,4℃冰箱中染毒1h。每個水樣設(shè)3個劑量:20、100、500ml/ml,即1ml暴露液相當于原水樣20、100、500ml。染毒后3000r/m離心5min,棄去上清,沉積細胞置4℃冰箱中備用。同時分別以DMSO、H2O2溶液(10mmol/L)做為陰、陽性對照。并用TrypanBlue染色測定細胞存活率。1.3.2星測試2結(jié)果2.1染毒劑量對實驗結(jié)果的影響各水樣中有機提取物對人外周血淋巴細胞的影響即彗星試驗結(jié)果見圖1和表1,從圖1中可見,陰性對照組細胞大小均一,呈圓形熒光團,無拖尾現(xiàn)象(圖1A),提示DNA鏈未發(fā)生明顯斷裂。圖1B~J可看出受損細胞DNA均出現(xiàn)明顯彗星樣拖尾,表明DNA鏈受損發(fā)生斷裂,且隨著受試物濃度增加損傷逐漸加重;高劑量組(每管100、500ml)中尾部熒光強度增強,彗星頭部直徑隨著尾部的加長而減小;每管500ml劑量組細胞DNA損傷最為嚴重,圖像表現(xiàn)為熒光信號變小,尾部長且尾部面積大(圖1H~J)。如表1所示,各染毒劑量組DNA損傷指標均高于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著染毒劑量的增加,DNA損傷各指標呈現(xiàn)加重的趨勢。以每管100ml這一劑量組進行多重比較表明,各樣點水樣對人血淋巴細胞DNA損傷程度從大到小依次為暴馬>黃碾>石梁。2.2石梁水樣中dna損傷程度不同水樣、不同劑量有機提取物對人外周血淋巴細胞DNA的損傷分級如表2所示。表2顯示,3個采樣點的水樣有機提取物均能引起不同程度的DNA損傷,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,各劑量組DNA損傷程度(AU)與陰性對照組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在陰性對照組中,未損傷細胞為57%,有43%的細胞受到損傷,也集中在1級(低度損傷);隨著水樣劑量的加大,細胞受損程度逐漸加重,向2、3級損傷集中,在陽性對照組中,3、4級損傷占受損細胞的67%。以每管100ml劑量組進行多重比較發(fā)現(xiàn),暴馬水樣與黃碾水樣引起的DNA損傷程度為暴馬大于黃碾,但二者間未見顯著性差異(P>0.05),同劑量組石梁水樣AU值暴馬和黃碾相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。從表2還可看出,即使在低劑量下(每管20ml),細胞DNA損傷程度最小值為111.10,損傷率也達到55.6%,比陰性對照組顯著升高,這意味著人血外周淋巴細胞對水體中有機污染物的毒作用非常敏感;最高劑量組(每管500ml)染毒條件下DNA損傷最為嚴重,損傷程度接近陽性對照水平。3常用的水環(huán)境監(jiān)測材料自1988年Singh等提出在單細胞水平上檢測DNA損傷與修復(fù)的方法以來,目前已被廣泛應(yīng)用于放射生物學(xué)、遺傳毒理學(xué)、DNA修復(fù)、細胞凋亡、腫瘤細胞治療評價、環(huán)境生物監(jiān)測、人群監(jiān)測等諸多領(lǐng)域的研究。用于彗星試驗研究DNA損傷的細胞有許多種,如肝臟細胞、各種腫瘤細胞、淋巴細胞等。其中,淋巴細胞具有易于采集、對機體損傷小、可用于活體檢測等優(yōu)點而被廣泛采用。Rajaguru、厲以強、王偉琴、李兆利等將人外周血淋巴細胞應(yīng)用于地表水和水源水的檢測,表明其在水環(huán)境監(jiān)測中有良好的應(yīng)用前景。彗星試驗具有諸多優(yōu)點,試驗數(shù)據(jù)來自單個細胞,僅需少量細胞,幾乎所有種類的真核細胞都可以使用,方法敏感、簡單且費用合理,數(shù)小時便可獲得結(jié)果。作為一個單核細胞試驗,其獨特的優(yōu)點在于:它能在一群混合細胞中測出非一致性反應(yīng)。本實驗中采用該方法成功的檢測出濁漳河水體3個代表性采樣點的水體中有機污染物的遺傳毒性。但其對濁漳河水體有機污染物檢測的試驗程序尚未標準化,方法和結(jié)果觀察也需進一步完善,有必要在今后的研究中加強方法學(xué)研究,摸索出適合濁漳河水體有機污染物檢測的試驗程序后進行推廣應(yīng)用。本研究對保護長治地區(qū)的水環(huán)境,優(yōu)化當?shù)厝嗣裆姝h(huán)境,促進水環(huán)境質(zhì)量可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。1.1.2細胞平臺電泳彗星試驗采用經(jīng)改良的Singh等的方法和OxiSelectTMCometAssayKit進行。將OxiSelectTMCometAgarose在90~95℃下水浴20min,使其液化,再置于37℃水浴中待用。每個微量離心管加600μl,與沉積細胞(已染毒)混勻后在彗星試驗專用載玻片(3-WellCometSlides)上鋪膠。每孔50μl細胞懸液,每個劑量3個平行;4℃下固化10min后,加入冷的細胞裂解液于4℃下裂解1h;然后置于堿性電泳緩沖液中,4℃下解旋20min。10V、80mA條件下電泳40min后在4℃下用冷的PBS緩沖液中和3次,每次5min;用VistaGreenDNADye染色,每孔50μl,10min后即可在熒光顯微鏡下觀察并進行損傷評價和分析。1.4組間的多重比較1個典型彗星包括頭部和尾部,根據(jù)拖尾中DNA的量占總DNA的比例,將DNA損傷程度分為5級:0級無損傷(正常細胞),<5%;1級低度損傷,≥5%~20%;2級中度損傷,≥20%~40%;3級高度損傷,≥40%~95%;4級重度損傷,≥95%。熒光顯微鏡下,每張玻片觀察100個左右細胞,彗星圖像用CASP軟件自動分析,以彗星尾部DNA含量(percentageoftailDNA,TD)、彗星尾長(taillength,TL)、尾矩(tailmoment,TM)和Olive尾矩(Olivetailmoment,OTM)綜合評價細胞DNA損傷情況,并計算細胞損傷專用單位(arbitraryunits,AU),方法如下:式中,i為損傷等級(0,1,2,3,4);Ni為i級的細胞數(shù)。數(shù)據(jù)均用表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理,單因素方差分析(ANOVA)比較各劑量組與陰性對照組間的損傷差異?？紤]到高劑量的染毒可能造成DNA嚴重損傷,從而使大量的游離DNA斷片在電泳過程中丟失而引起可測DNA損傷的降低,而劑量過低可能使組間差異難以充分表現(xiàn),所以本文以每管100ml這一劑量對各水樣間的遺傳毒性進行多重比較。組間的多重比較采用Duncan檢驗法,以α=0.05為檢驗水準。近年來,環(huán)境水樣中的有機污染物日漸增加,對人類的生存構(gòu)成嚴重威脅。水樣中的有機污染物在水中存在的時間長,危害大。在美國環(huán)保局(EnviromentalProtectionAgency,EPA)列出的水中優(yōu)先考慮的129種污染物中,有機污染物就占114種,多數(shù)為致突變物和致癌物。隨著人們對生活質(zhì)量認識的不斷提高,對環(huán)境水樣中有機污染物的重視程度不斷加大,對環(huán)境水樣有機物污染物的檢測方法也受到極大地關(guān)注。本研究中,采用人外周血淋巴細胞彗星實驗對濁漳河水體中的有機提取物的遺傳毒性進行了評價。實驗結(jié)果顯示,濁漳河水體的3個代表性采樣點(暴馬、黃碾、石梁)的有機提取物具有遺傳毒性,均可造成人外周血淋巴細胞DNA不同程度的損傷,表明濁漳河水體中含有誘變物質(zhì)。因此,必須加強當?shù)嘏盼燮髽I(yè)和生活污水的監(jiān)督監(jiān)測,找出可能的污染源并進行跟蹤監(jiān)測,以便了解其變化規(guī)律,從而為環(huán)境風(fēng)險事故防范和應(yīng)急預(yù)案的建立提供依據(jù)。本次實驗中,3個采樣點的有機提取物在所設(shè)計的劑量范圍內(nèi)均能引起DNA損傷,在低劑量范圍內(nèi)彗星尾長與DNA損傷程度呈線性關(guān)系,但在每管500ml劑量組尾長增加不明顯甚至有所降低(表1)。此時,尾部的DNA熒光強度與損傷程度的關(guān)系更為密切,尾矩(TM)是尾部DNA百分含量與頭、尾部中心間距的乘積,在本實驗條件下,高劑量組尾矩與損傷程度仍保持較好的線性關(guān)系,故該參數(shù)能較滿意地用于DNA損傷評價分析。石梁水樣500ml劑量組的Olive尾矩與100ml劑量組相比略有下降,是因為該水樣引起少量DNA4級重度損傷(3.64%)。Olive等通過對人血淋巴細胞的研究認為,高劑量暴露可導(dǎo)致細胞電泳過程中DNA斷片大量流失,從而導(dǎo)致高劑量組的可見DNA損傷降低。細胞損傷專用單位(AU)是一種衡量DNA鏈斷裂損傷程度的特有單位,根據(jù)DNA損傷程度進行分級并加以換算統(tǒng)計,從而得到DNA損傷的總體水平。因此,本試驗中以100ml劑量組進行多重比較,3個采樣點的DNA損傷程度從大到小依次為暴馬>黃碾>石梁。水體中有機污染物的來源與點源污染密切相關(guān)。暴馬斷面主要接納長治市區(qū)部分工業(yè)廢水和生活污水,水質(zhì)類別為劣Ⅴ類;黃碾斷面位于郊區(qū)工業(yè)園區(qū),廢水多為化工、冶金、焦化等行業(yè)廢水;石梁位于濁漳河三支流匯合的干流上,雖然受到上游某大型化肥廠和造紙廠排污影響,但由于水量增大,水體的自凈能力對工業(yè)廢水具有明顯的稀釋作用。同期監(jiān)測3個采樣點的綜合污染指數(shù)分別為:暴馬10.78,黃碾5.74,石梁1.24,結(jié)果與本研究中的彗星試驗相吻合。健康人外周肝素抗凝全血,由長治市中心血站提供。主要