藤茶中的二氫楊梅素

藤茶中的二氫楊梅素

藤蔓茶是屬于青螺科的一種野生藤蔓葉，也被稱(chēng)為修剪蛇的結(jié)實(shí)莖和葉子。天竺葵、紅五爪金龍、蛇、甜茶藤、霉菌茶。長(zhǎng)久以來(lái),我國(guó)壯族和瑤族將其嫩莖葉制成保健茶,用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛,黃疸型肝炎、瘡癤等癥。其化學(xué)成分主要為黃酮類(lèi)、低聚芪類(lèi)、酚類(lèi),其中黃酮類(lèi)中的二氫楊梅素及楊梅素含量豐富并有很強(qiáng)的藥理作用。特別是二氫楊梅素在幼葉莖中含量占干重的20%以上,在幼葉中的心葉可達(dá)40%。據(jù)報(bào)道,藤茶具有抗腫瘤作用、抗氧自由基及護(hù)肝作用、調(diào)血脂及降血糖作用、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、祛痰止咳作用。楊梅素(3,5,7,3′,4′,5′-六羥基黃酮醇,myricetin,MYR)異名楊梅樹(shù)皮素、楊梅黃酮、楊梅酮,屬黃酮醇類(lèi)化合物,存在于殼豆科、豆科、報(bào)春花科、葡萄科、菊科等植物中,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。該化合物由何桂霞等于1999年從藤茶的莖中分離得到。二氫楊梅素(3,5,7,3′,4′,5′六羥基-2,3雙氫黃酮醇,dihydromyricetin,DMY)又稱(chēng)蛇葡萄素、雙氫楊梅素、福建茶素,屬黃酮醇類(lèi)化合物,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。該化合物曾由Kotake和Kubota于1940年從蛇葡萄屬植物福建茶(即楝葉玉葡萄,Ampelopsis)的葉中分離得到并命名為蛇葡萄素,周天達(dá)等于1996年從藤茶的莖葉中分離得到二氫楊梅素。鑒于MYR和DMY結(jié)構(gòu)相似,用一般方法分離較困難,根據(jù)2,3位飽和情況,本實(shí)驗(yàn)擬采用200～400目聚酰胺柱層析,以乙醇-水梯度洗脫,從藤茶提取的總黃酮中分離得到單一組分,并從細(xì)胞水平檢測(cè)MYR和DMY對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器藤茶干燥嫩莖葉(湖南恩施州鳳鳴藤茶有限責(zé)任公司)、新生Wistar大鼠乳鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)。胰蛋白酶(Sigma公司)、優(yōu)級(jí)胎牛血清(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所灝洋生物公司)、AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)、柱層析聚酰胺(200～400目)(浙江臺(tái)州路橋四甲生化儀器廠)、乙醇(分析純)(哈爾濱新達(dá)化工廠)、丙酮(分析純)(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠)。UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、X-4型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司)、FACSCALibur流式細(xì)胞儀(Becton-Dikinson公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1樣品制備1.2.1.煮20d稱(chēng)取藤茶100g,加10倍水,煮1h,濾去殘?jiān)?再加5倍水煮30min,棄去殘?jiān)Ｒ后w放置24h,濾出沉淀,用乙醇溶解,過(guò)濾,濾液上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,得到總黃酮結(jié)晶24.4g,用于分離。1.2.1.聚酰胺溶液的制備①裝柱:取200～400目的聚酰胺用蒸餾水以濕法裝柱,柱為70cm×5cm;②取總黃酮結(jié)晶5g,用95%乙醇溶解,以聚酰胺拌樣,揮干乙醇,裝柱,柱高15cm;③分別以10%、30%、50%、60%、70%乙醇洗脫,每次洗脫液量為2000mL,每200mL收集一瓶,依次標(biāo)號(hào);④收集的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮;⑤合并相同物質(zhì)。流程圖見(jiàn)圖2。1.2.2樣品檢測(cè)1.2.2.反應(yīng)和反應(yīng)結(jié)晶Ⅰ為白色細(xì)針狀結(jié)晶。分別進(jìn)行鹽酸-鎂粉反應(yīng)、FeCl3乙醇液反應(yīng)、AlCl3反應(yīng)、α-萘酚反應(yīng)和NaOH反應(yīng)。結(jié)晶Ⅱ?yàn)辄S色針狀或顆粒狀結(jié)晶,亦進(jìn)行上述鑒別反應(yīng)。1.2.2.2.底層色度法取結(jié)晶I和結(jié)晶II,用少量乙醇溶解后,點(diǎn)于聚酰胺薄膜上,以丙酮-水(5∶1)上行展開(kāi),置紫外燈下觀察。1.2.2.3、紫外試驗(yàn)將結(jié)晶Ⅰ和結(jié)晶Ⅱ分別溶于甲醇,置紫外光譜儀檢測(cè),在200～400nm處紫外掃描。1.2.2.4-溫度測(cè)試將干燥結(jié)晶Ⅰ和結(jié)晶Ⅱ分別置于顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀下測(cè)定。1.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)1.2.3.細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)采用出生48h以?xún)?nèi)的Wistar乳鼠的心肌組織,無(wú)菌條件下剪碎,加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃水浴振蕩分次消化,每次15min,棄去第1次上清液,收集以后幾次上清液,加入等量冷的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化,1000r/min離心5min,棄上清液,再用培養(yǎng)液懸浮分散沉淀細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,接種到100mL培養(yǎng)瓶中,放入5%CO2,37℃孵育2h,差速貼壁,之后收集細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),接種于6孔板中,接種量為1×106(每孔1mL)繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后換液,48h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.3.心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用黃酮化合物用DMSO溶解后,過(guò)濾除菌。①正常組:培養(yǎng)心肌細(xì)胞48h后加生理鹽水;②對(duì)照組:細(xì)胞培養(yǎng)48h后,加入終濃度100μmol/L的H2O2,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡;③樣品組:細(xì)胞培養(yǎng)48h后,分別往6孔板中加入終濃度30μmol/L的MYR和DMY,孵育1h,加入終濃度100μmol/L的H2O2,孵育16h,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。1.2.3.檢測(cè)細(xì)胞因子和治療單染pap0.125%胰酶消化,4℃PBS洗3次,BindingBuffer重懸細(xì)胞,過(guò)200目篩,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。檢測(cè)前30min加入FITC-AnnexinV,低溫避光孵育,檢測(cè)前5min加入碘化丙啶(PI)。將對(duì)照管(裸細(xì)胞)熒光強(qiáng)度設(shè)為非特異本底熒光,單染FITC-AnnexinV和單染PI作為補(bǔ)償設(shè)置管。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。2楊樹(shù)莓原素la結(jié)晶Ⅰ為白色細(xì)針狀結(jié)晶。鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈玫瑰紅色,與FeCl3乙醇液反應(yīng)呈紫黑色,與AlCl3反應(yīng)呈黃色熒光,α-萘酚反應(yīng)呈陰性,與NaOH反應(yīng)呈橙黃色→綠色。熔點(diǎn)245～246℃,UV(MeOH):291.4nm,以上數(shù)據(jù),與已知文獻(xiàn)報(bào)道的二氫楊梅素熔點(diǎn)和光譜數(shù)據(jù)一致,可初步推斷其為二氫楊梅素。結(jié)晶Ⅱ?yàn)辄S色針狀或顆粒狀結(jié)晶,鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈玫瑰紅色,與FeCl3乙醇液反應(yīng)呈墨綠色,與AlCl3反應(yīng)呈強(qiáng)黃綠色熒光,α-萘酚反應(yīng)呈陰性,與NaOH反應(yīng)呈黑綠色。熔點(diǎn)324～326℃,UV(MeOH):375.0nm,255.0nm。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)記載的楊梅素各項(xiàng)數(shù)據(jù)一致,可初步推斷為楊梅素。由薄層色譜檢測(cè),結(jié)晶Ⅰ為單一斑點(diǎn),結(jié)晶II為單一斑點(diǎn),分別與二氫楊梅素和楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)相一致。由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3,附表)可知,在正常組中第3象限(左下區(qū))活細(xì)胞大量存在,第4象限(右下區(qū))凋亡細(xì)胞較少,細(xì)胞的凋亡率為11.81%。對(duì)照組中第3象限活細(xì)胞大量減少,而第4象限凋亡細(xì)胞增多,細(xì)胞的凋亡率為40.65%。同心肌細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)的理論相吻合;與對(duì)照組相比,MYR和DMY樣品組中第3象限活細(xì)胞的幾率增加,而第4象限凋亡細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞的凋亡率分別為17.17%和19.83%。證明MYR和DMY對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,均有明顯的抑制作用。3聚酰胺柱分離對(duì)dmy和私家車(chē)的活性影響藤茶中二氫楊梅素含量較高,但楊梅素含量較少,約1%～2%。二氫楊梅素和楊梅素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上近似,僅在2,3位上差1個(gè)雙鍵,極性相同,造成了分離純化的困難,至今沒(méi)有好的分離方法。本研究根據(jù)二氫楊梅素和楊梅素與聚酰胺之間氫鍵締合能力的差異,采用200～400目聚酰胺柱分離DMY和MYR,在24.4g總黃酮中能夠得到18.3g的DMY和1.5g的MYR,達(dá)到較好的分離純化效果。關(guān)于MYR和DMY的藥理作用,多數(shù)文