靈芝液體發(fā)酵多糖三萜

摘要靈芝是我們中國從古至今一直在延用的一種名貴中藥材，具有很高的藥用價值，其中含有的多糖和三萜是真菌重要的活性物質(zhì)。采用Plackett-Burman法分析不同碳源對靈芝多糖以及三萜合成的影響。以不同時期靈芝發(fā)酵液的提取產(chǎn)物作為研究材料，測定發(fā)酵液中所含有的靈芝多糖含量和三萜含量，并利用Plackett-Burman法分析不同時期的多糖含量，評價多糖含量與不同碳源的相關性。實驗結果表明，培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組對靈芝胞外多糖的產(chǎn)量影響最大；果糖、乳糖，麥芽糖碳源組對靈芝三萜產(chǎn)量的影響最大；葡萄糖，蔗糖碳源組合對靈芝生物量的產(chǎn)量影響最大；蔗糖，麥芽糖碳源組合對靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量影響最大。本研究可為靈芝發(fā)酵提高重要參考。關鍵詞：靈芝；液體發(fā)酵；多糖；三萜；Plackett-BurmanAbstractGanodermalucidumisarareChinesemedicinalmaterialthathasbeenusedinChinasinceancienttimes.Ithashighmedicinalvalue.Thepolysaccharidesandtriterpenescontainedinitarethetwoimportantactivesubstancesofthisfungus.TheeffectsofdifferentcarbonsourcesonthesynthesisofGanodermalucidumpolysaccharidesandtriterpeneswereanalyzedbyPlackett-Burmanmethod.ThepolysaccharidecontentandtriterpenecontentinG.lucidumfermentationbrothweredeterminedbyusingtheproductextractedfromG.lucidumfermentationbrothindifferentperiods,andthepolysaccharidecontentindifferentperiodswasanalyzedbyPlackett-Burmanmethod,andthecorrelationbetweenpolysaccharidecontentanddifferentcarbonsourceswasevaluated.ThisstudycanprovidesomereferencedataandconclusionsfortheefficientapplicationofG.lucidumandthehighqualityresearchanddevelopmentofhealthcareproducts.Theresultsshowedthattheeffectoffructose,lactoseandmaltoseontheextracellularpolysaccharideofG.lucidumwasthegreatest.Fructose,lactoseandmaltosehadthegreatestinfluenceonthecontentofG.lucidumtriterpenes.ThecombinationofglucoseandsucrosehadthegreatesteffectonthebiomassofGanodermalucidum.ThecombinationofsucroseandmaltosehadthegreatesteffectontheintracellularpolysaccharideofG.lucidum.Keywords：Ganodermalucidum;Polysaccharide;triterpenoids;liquidfermentation;Plackett-Burmanmethod目錄1.引言 11.1.靈芝的概述 11.1.1.靈芝簡介 11.1.2.靈芝的主要成分 11.2.靈芝多糖簡介 11.2.1.靈芝多糖的功能活性 21.3.靈芝三萜簡介 31.3.1.靈芝三萜的功能 31.4.靈芝多糖提取 41.5.靈芝三萜提取 41.6.外源物質(zhì)對靈芝三萜合成的影響 51.7.課題的研究背景與內(nèi)容 52．材料與方法 62.1.材料、藥品及儀器 62.1.1.菌種 62.1.2.試劑 62.1.3.基礎培養(yǎng)基成分 62.2.主要儀器 72.3.方法 72.3.1.Plackett-Burman實驗設計 72.3.2.菌種活化 82.3.3.液體種子制備 82.3.4.液體發(fā)酵 82.3.5.生物量測定 82.3.6.多糖測定 92.3.7.菌絲三萜含量測定 93.結果與分析 93.1.Plackett-Burman試驗設計結果 93.2.Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝多糖合成的影響 103.3.Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝三萜合成的影響 113.4.Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響 124．小結與討論 12致謝 13參考文獻 13PAGE15Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝多糖以及三萜合成的影響1．引言1.1.靈芝的概述1.1.1.靈芝簡介靈芝（Ganodermalucidum），別名紅芝、木靈芝，是一種多孔蓖科真菌靈芝的子實體，植物本身呈現(xiàn)出強烈的漆感光澤,外貌主要的特征是當其菌蓋孔口外表濕潤時會呈現(xiàn)鮮美色澤，顏色豐厚飽滿。多孔靈芝生長在中國東亞暖溫帶和亞熱帶的地區(qū),全國各省都曾有研究發(fā)現(xiàn)靈芝的繁殖和生長[1]。靈芝在中醫(yī)學中有著重要的地位，是我國歷史有名的藥材之一。靈芝擁有很多對人體調(diào)節(jié)和保持健康的好處，尤其是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)上,對各種腫瘤的擴大和擴散都有一定的抑制作用[2,3]。甚至Ganodermalucidum還可用作在臨床治療患者時，起到消炎、止痛、止血和補充營養(yǎng)等效果[4]。經(jīng)過長期科學研究和臨床治療，能從靈芝里分離出的成分包括三萜、多糖、蛋白質(zhì)及生物堿[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)多糖有調(diào)節(jié)免疫[8]，控制血糖，治療潰瘍，抑制氧化，延緩衰老，防止腫瘤等藥用價值和臨床意義。1.1.2.靈芝的主要成分靈芝含有蛋白質(zhì)、氨基酸、甾醇、三萜類化合物、多糖和生物堿等多種重要活性成分[9]。我們將一層一層的面紗揭下，看到內(nèi)部的成分，并更加準確地應用于實際生產(chǎn)生活。劉松照[10]等學者的結果表明，利用靈芝子實體中的三萜類化合物提取得出了：3種靈芝醇、2種靈芝烯醇和l6種靈芝酸等多種三萜類成分。靈芝多糖也是學者們爭相研究的活性物質(zhì)，多糖在臨床治療中也廣受關注。1.2.靈芝多糖簡介我們可以在靈芝的菌絲體、子實體，發(fā)酵液中分離提取出各種類型的靈芝多糖[11]。多糖里主要是β–葡聚糖，小部分是α–葡聚糖，靈芝多糖主要含有以下單糖:D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖，L-巖藻糖等。以螺旋纏繞的方式將三股單糖鏈繞成多糖鏈，其3D結構與脫氧核糖核酸相似，在空間結構層中以氫鍵連接而成。此外，對靈芝的研究，不論是國內(nèi)還是國外，都不乏有專家學者研究靈芝多糖的生物化學性質(zhì)，且越來越多的結果表明了，靈芝多糖具有顯著的生產(chǎn)價值和臨床治療的意義。1.2.1.靈芝多糖的功能活性（1）抗氧化作用近幾年來，越來越多的人注重養(yǎng)生，而養(yǎng)生最主要的就是延緩身體衰老程度，人體的衰老，主要依靠人體中自由基的含量來決定。有學者應用激光共聚焦方法，測定靈芝多糖對小鼠腹部存在的巨噬細胞里的氧自由基含量，明顯觀測到靈芝多糖擁有顯著且有效的抗自由基能力[12]。（2）抗腫瘤作用生態(tài)環(huán)境被破壞得越來越嚴重，優(yōu)質(zhì)水資源的缺乏，空氣治療下降，被污染的土壤，人們生存環(huán)境遭到不可逆破壞，而且人們在電子產(chǎn)品的簇擁下，作息生活習慣嚴重混亂，導致健康無法得到良好地調(diào)節(jié)，人體免疫機制不能夠有效地戰(zhàn)勝癌細胞，導致癌細胞在體內(nèi)瘋狂地增值，從而形成癌癥，運用破碎靈芝孢子粉可以使各項指標達到最佳效果，研究證明，靈芝孢子粉能夠控制住肺癌荷瘤小鼠腫瘤進一步擴大[13]。（3）降血糖糖尿病患者在進食過量的糖食時，機體的激素調(diào)節(jié)跟不上節(jié)奏，或胰島素不能與受體正常的結合，則會造成糖尿病及血糖含量超出正常范圍值的結果。在實驗中證明，靈芝多糖可以通過提高胰島素與受體蛋白的結合速度，改善胰島素的分泌情況，改善病情[14]。（4）調(diào)節(jié)免疫功能中醫(yī)和西醫(yī)最大的不同在于，中醫(yī)是提高自身免疫能力或恢復自身機能進而對抗疾??；西醫(yī)是用藥物的特性直接攻擊病毒細胞，或用藥物對抗外在因素來維持身體各激素的分泌。李風華[15]等學者，環(huán)磷酰胺誘導雛雞的免疫抑制的試驗中，觀察到注射靈芝多糖后能夠維護雛雞的免疫抑制作用，為免疫細胞存活增殖，所以靈芝這一中藥材對提高免疫力有顯著作用。（5）抗疲勞現(xiàn)代很多人群出現(xiàn)亞健康狀態(tài)，年紀輕輕就出現(xiàn)很多意想不到的疾病。在研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝制劑能夠降低血清中TC、TG、FFA水平，從而具有緩解疲勞和恢復體力的作用[16]，疲勞得到緩解才能更加高效地投入工作和生活中去。1.3.靈芝三萜簡介靈芝具有豐富的化學物質(zhì)，在靈芝中提取出大約有150種三萜化合物質(zhì)[17]。何為三萜？三萜是由6個“異戊二烯”組合而成的化合物，其化學式為（C5H8）6。作為總稱叫做靈芝三萜，而四環(huán)三萜和五環(huán)三萜是靈芝孢子粉中能夠消滅癌細胞作用的化合物，所有靈芝三萜并非都能夠有效地抑制癌細胞的生長繁殖。現(xiàn)在醫(yī)學技術的快速發(fā)展，醫(yī)學檢測技術已經(jīng)可以快速有效地檢測出癌細胞，癌癥患者也慢慢走進我們的生活中來，在癌癥的早期或者中期被治愈的幾率都是很大的，但大部分人是在身體嚴重不適后才去檢查，確診后可能已經(jīng)是中晚期或更嚴重的情況，這種情況，多數(shù)人是采用介入手術加上靶向藥物或者中藥一同治療，而中藥里，靈芝孢子粉就是很好的選擇。1.3.1.靈芝三萜的功能（1）保肝護肝肝病患者很難有效地利用肝臟進行解毒，增加了肝臟負擔，如果不加以干預治療，極大可能會患上肝癌。王洪慶[18]等學者將靈芝三萜應用于人體肝臟，測肝細胞成活率，觀察到肝臟細胞成活率增大，進一步證明靈芝三萜對肝細胞具有保護作用。（2）抗癌功效最近國內(nèi)外，部分學者的研究均證明靈芝三萜是一類顯著得防癌細胞物質(zhì)，靈芝三萜運用細胞毒效果來對抗腫瘤生長[19]。靈芝三萜的提取物用于上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)(EMT)，以及用于原癌基因(c-myc)的調(diào)控，以此來防止前列腺癌。報道還表明，靈芝有阻止5-a還原酶的活性作用，阻止雄激素產(chǎn)生受體活性，降低癌變幾率[20]。（3）改善睡眠睡眠是人類調(diào)節(jié)身體激素分泌和緩解疲勞的重要生物活動，當人到老年，睡眠質(zhì)量會有所下降，造成失眠和睡眠時長下降得結果，導致人體機能得不到有效地調(diào)節(jié)，生物鐘混亂后，就容易出現(xiàn)一些不可預料地疾病。在有關于優(yōu)化小白鼠睡眠質(zhì)量的實驗里，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜酸有增加睡覺質(zhì)量和延長睡眠時間的作用，從而得出，靈芝三萜酸具有優(yōu)化睡眠的功能[21]。（4）抗菌、抗病毒王開金等[22]探究了靈芝提取物GLTs的相關作用，從恥垢分枝桿菌的增殖曲線，以及GImU基因的表達，包括細胞壁結構變化的研究里，發(fā)現(xiàn)靈芝提取物GLTs對M.S-155病毒的抑制具有明顯的作用。1.4.靈芝多糖提?。?）水溶提取法楊曉梅等[23],在實驗中運用水溶提取法來提取靈芝子實體中的多糖成分。實驗步驟：eq\o\ac(○,1)稱量，eq\o\ac(○,2)加料液，eq\o\ac(○,3)熱水浸提，eq\o\ac(○,4)過濾，eq\o\ac(○,5)熱水浸提，eq\o\ac(○,6)過濾，eq\o\ac(○,7)醇析，eq\o\ac(○,8)離心，eq\o\ac(○,9)取沉淀，eq\o\ac(○,10)除游離蛋白，eq\o\ac(○,11)離心取上層液。再利用苯酚-硫酸法來檢測靈芝粗多糖溶液中西藏野生靈芝子實體粗多糖含量。該方法相較于其他多糖提取法來說，在靈芝多糖的提取率上處于一個中等水平。此方法可以運用于野生靈芝的馴化工作。（2）超聲波提取法超聲波的使用，可使得物質(zhì)強烈震蕩搖擺，劇烈的空化反應和高效的混合效果，讓分子和物質(zhì)加快運動，類似于催化反應一般，縮短物質(zhì)之間反應所需要的時間，有效地使各個成分與溶劑混合均勻，從而增加多糖的提取效率[24]。（3）酶法酶法能有效地提取藥物成分，并起到顯著作用，找到適宜的酶以利用，助于降解細胞壁和細胞質(zhì)基質(zhì)之間的纖維素、半纖維素，細胞的原有結構毀掉后，降低物質(zhì)結合的外力，加大成分產(chǎn)出。（4）微波輔助法微波萃取法在國內(nèi)受到大量運用，常見在中醫(yī)藥學里，用于提取藥物中有效物質(zhì)，有助于實驗中對多糖的提取，能對多糖生物活性成分高的物質(zhì)進行篩選，較少實驗資源的浪費，縮短實驗工序。（5）高壓熱水提取法主要原理是使用高壓將細胞破碎,使得多糖從細胞中流出,高壓熱水提取法便于操作，工序簡單。1.5.靈芝三萜提?。?）超聲波輔助法康同輝等[25]實驗證明，超聲波輔助法，有利于乙醇提取靈芝三萜。（2）靈芝三萜優(yōu)等提取條件[26]浸提溫度，浸提時間對靈芝三萜提取率的影響較為顯著。最佳提取工藝參數(shù):18倍的乙醇用量,提取溫度在60°,提取的最優(yōu)時間為2h，Ph值是8.5。1.6.外源物質(zhì)對靈芝三萜合成的影響適量地加入一些外源物質(zhì)可以有效地提高靈芝三萜地產(chǎn)出率。趙艷等[27]研究證明,使用一些中藥材可以提高靈芝三萜提取率，比如加入相對含量的金銀花、枸杞子或者連翹水提物和醇提物有助于靈芝三的產(chǎn)出率的提高,相反金銀花和銀杏的水提物和醇提物對三萜的產(chǎn)出率有所降低。趙小瑞等[28]證明,黃芪、甘草、黨參、當歸能夠激發(fā)三萜的產(chǎn)出率。1.7.課題的研究背景與內(nèi)容背景在于：栽培法生產(chǎn)靈芝具有明顯的缺點，如栽培周期長、占地面積大、目前，靈芝主要通過人工栽培的方法進行生產(chǎn)，獲得其子實體。靈芝子實體可直接作為中藥材，或以此為原料產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定以及不易工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，液體深層發(fā)酵法由于其周期短、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，且可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因此靈芝液體深層發(fā)酵法開始廣泛應用于靈芝生產(chǎn)，以菌絲體、多糖以及三萜為主要目標產(chǎn)物。內(nèi)容有：以不同時期靈芝發(fā)酵液的提取產(chǎn)物作為研究材料，測定發(fā)酵液中所含有的靈芝多糖含量和三萜含量，并利用PB法分析不同時期的多糖含量，評價多糖含量與不同碳源的相關性。獲得對靈芝多糖、三萜產(chǎn)量，生物量有利的碳源，對進一步開發(fā)利用和提高經(jīng)濟效益提供參考。意義在于：碳源是大型真菌進行液態(tài)發(fā)酵的重要營養(yǎng),對其生長代謝及其發(fā)酵產(chǎn)物的形成有直接的影響，探索不同碳源對靈芝菌絲量、靈芝多糖含量及三萜產(chǎn)量的影響,對推動靈芝發(fā)酵高效生產(chǎn)，有重要作用和積極意義,為靈芝代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持實驗依據(jù)。采用液體發(fā)酵靈芝菌絲體，形成的產(chǎn)物不僅含有靈芝多糖,還有大量次生代謝產(chǎn)物,利用液體發(fā)酵代替栽培法，是一種潛在的新途徑。中國已經(jīng)是世界第二大經(jīng)濟體，人民的生活水平和質(zhì)量也在日益提升，年輕人為了實現(xiàn)自己的人生價值，愿意來到更大的城市發(fā)展自己事業(yè)，接踵而來的是，人們壓力劇增，生活節(jié)奏不規(guī)律，導致亞健康。亞健康的人群，身體雖然沒有患病，卻出現(xiàn)了生理機能減退，代謝水平低下，主要表現(xiàn)于疲勞、胸悶、頭痛、失眠、健忘、腰酸背痛、情緒不穩(wěn)定，工作效率低下等。呼吁養(yǎng)生的人群出現(xiàn)，比如枸杞菊花泡水有利于緩解疲勞。在日本也有以茶為原料的各種飲品，最近，在中國這些飲品也很暢銷，其中的營養(yǎng)成分含量是否充足，暫且不明，不過，這是個不錯的發(fā)展方向。中國的中醫(yī)歷史悠久，經(jīng)歷歷史的檢驗，臨床實驗表明，中藥材具有的功效是強大的，比如靈芝，靈芝是著名的一味藥材，將靈芝實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提高靈芝活性物質(zhì)含量，是研究的關鍵。2．材料與方法2.1.材料、藥品及儀器2.1.1.菌種靈芝菌種：靈芝NA34，寧德師范學院發(fā)酵實驗室保藏。2.1.2.試劑主要所用試劑見表2-1-2表2-1-2主要試劑試劑名稱規(guī)格生產(chǎn)廠家乙醇分析純國藥集團化學試劑有限公司苯酚分析純國藥集團化學試劑有限公司硫酸分析純中國上海試劑香草醛分析純國藥集團化學試劑有限公司冰醋酸分析純西隴科學股份有限公司高氯酸分析純國藥集團化學試劑有限公司葡萄糖分析純天津市益力化學試劑有限公司磷酸二氫鉀分析純天津化學試劑有限公司酵母粉生物試劑北京奧博星生物技術有限公司氫氧化鈉分析純西隴科學股份有限公司蛋白棟生物試劑天津市致遠化學試劑有限公司2.1.3.基礎培養(yǎng)基成分液體培養(yǎng)基（g/L）：40g葡萄糖，5g酵母粉，0.5g硫酸鎂，1.0g磷酸二氫鉀、4.0g蛋白胨。2.2.主要儀器主要所用儀器見表2-2。表2-2主要儀器設備名稱型號生產(chǎn)廠家紫外可見分光光度計UV-5800PC上海元析儀器有限公司恒溫水浴鍋SB-1100上海愛朗儀器有限公司離心機3-16KL德國賽多利斯公司電子天平YP802N上海精密科學儀器有限公司中藥粉碎機800A浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司恒溫培養(yǎng)搖床NRY-200上海南榮實驗室設備有限公司電熱恒溫水槽DK-8D上海精宏實驗設備有限公司雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2D蘇州凈化設備有限公司自動壓力蒸汽滅菌器，GR-85-DR致微儀器有限公司2.3.方法2.3.1.Plackett-Burman實驗設計Plackett-Burman法是在科學研究中常用的方法之一，是一種工藝優(yōu)化，能在相對少的實驗中快速地從大量的影響因素里篩選出顯著影響因素。Plackett-Burman法適合使用在那些從眾多考察因素中迅速地、有效地篩查出關鍵的因素，以最少實驗次數(shù)來精確估計各因素的主要效果。各個因素選擇高低兩個水平數(shù)值,該因素高低水平值的差距要小，差距是一致的，安排了12種配方的培養(yǎng)基，是為了保證不對其他因素效果有所妨礙。其自變量、編碼和水平因素見表2-3-1。表2-3-1Plackett-Burmandesign變量Variables因素（g/L）Factor低水平（-）Lowlevel高水平（+）HighlevelX1X2X3X4X5X6X7X8葡萄糖蔗糖dummy1dummy2果糖乳糖dummy3麥芽糖00-1-100-1015151115151152.3.2.菌種活化超凈工作臺上將菌種接種至液體培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)搖床上，28℃培養(yǎng)3d，讓菌絲繁殖。2.3.3.液體種子制備超凈工作臺上從液體培養(yǎng)基中吸取10mL菌絲體分裝到有不同碳源的80mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶，置于恒溫培養(yǎng)搖床上，160rpm/min、28℃培養(yǎng)5d，用于發(fā)酵實驗。2.3.4.液體發(fā)酵接種至不同配方的液體培養(yǎng)基中，務必準確，過少會影響菌種生長，更多搖床中容易灑出，沾染瓶口的細菌，污染培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為160rpm/min、28℃培養(yǎng)5d。2.3.5.生物量測定用紗布過濾樣品，用蒸餾水洗凈殘留的培養(yǎng)基等多余物質(zhì)，反復清洗3次。將菌絲體至于過濾紙上，放進鼓風干燥箱60℃烘至一夜恒重，（恒重即是第一次稱取后間隔一段時間再次稱取，前后重量不變，則達到恒重。）電子天平稱量，即為菌絲生物量。2.3.6.多糖測定（1）胞外多糖測定eq\o\ac(○,1)取到0.1mL發(fā)酵液，添加95%乙醇4mL，4℃冰箱過一夜；eq\o\ac(○,2)8000rpm離心后15min，棄掉上清液，往沉淀中加入3mL去離子水溶解混合均勻；eq\o\ac(○,3)吸取樣液0.01mL，加入0.99mL去離子水以及0.5mL5%苯酚震蕩勻，與2.5mL濃硫酸混合均勻后，靜置5min；eq\o\ac(○,4)100℃沸水浴里加熱15min，涼水冷卻，在490nm處測定吸光度值，以葡萄糖為標準品建立標準曲線，標準曲線為：y=0.0145x-0.0386，R2=0.9984。（2）胞內(nèi)多糖測定eq\o\ac(○,1)將菌絲體烘干磨成粉末，準確稱取0.1g，加1mol/L氫氧化鈉5mol，用60℃水浴加熱1h；eq\o\ac(○,2)取0.01mL樣液，加入0.99mol去離子水，再加0.5mol的5%苯酚搖勻，加入2.5mL95%硫酸混勻，靜置5min；eq\o\ac(○,3)100℃沸水浴加熱15min，涼水冷卻，在490nm處測吸光度值，根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵液多糖濃度。2.3.7.菌絲三萜含量測定eq\o\ac(○,1)菌絲干研磨成粉末，稱取0.1g，加入95%乙醇2.5mL，30℃搖床3h；eq\o\ac(○,2)取0.2mL,60℃水浴蒸干，分別加入香草醛-冰醋酸0.5mL和高氯酸溶液0.8mL,混勻；eq\o\ac(○,3)60℃水浴15min冷卻，最后加入2mL冰醋酸，靜置30min，以乙醇蒸干作為對照，于540nm處測吸光度值，以熊果酸為標準品建立標準曲線，標準曲線為：y=0.0065x+0.0065，R2=0.992。3．結果與分析3.1.Plackett-Burman試驗設計結果Plackett-Burman試驗設計結果見表3-1。采用Design-Expert軟件對表3-1中的胞外多糖、三萜、生物量，胞內(nèi)多糖含量進行統(tǒng)計分析，對胞外多糖、三萜，胞內(nèi)多糖含量數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數(shù)及其顯著性。表3-1Plackett-Burman試驗設計結果SerialnumberX1X2X3X4X5X6X7X8胞外多糖（g/L）三萜含量（%）生物量（g）胞內(nèi)多糖（g/L）1++-+++--2.490.650.426.92-++-+++-0.680.350.656.653+-+++1.80.520.677.394+-++-+++2.90.660.447.15--+-++-+3.040.950.545.556-+-++-++2.070.260.325.927++++-0.70.380.945.358++-++2.920.560.556.369+-++-1.730.690.725.810+++-+2.900.640.245.71192.312-++++2.710.380.468.22由表3-1可知，培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合時，碳源對靈芝胞外多糖的產(chǎn)量影響最大；培養(yǎng)基添加果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合時，對靈芝三萜產(chǎn)量的影響最大；培養(yǎng)基添加葡萄糖，蔗糖碳源組合時，對靈芝生物量的產(chǎn)量影響最大；培養(yǎng)基添加蔗糖，麥芽糖碳源組合，對靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量影響最大。3.2.

Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝多糖合成的影響表3-2為不同碳源對靈芝多糖合成的影響及貢獻值。表3-2胞外多糖偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0340.517.613X2-0.014-0.211.237X3-0.057-0.110.378X40.260.517.514X50.0180.282.216X60.0350.527.912X7-0.20-0.394.395X80.0971.4661.251從表3-2可以看出，麥芽糖（X8）對靈芝胞外多糖合成的影響最大，其次為乳糖（X6）。其中，葡萄糖、麥芽糖，乳糖對胞外多糖含量的影響是正效應，蔗糖對胞外多糖含量的影響是負效應3.3.

Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝三萜合成的影響不同碳源對靈芝三萜合成的影響見表3-3所示。表3-3三萜含量偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.0550.116.474X2-0.070-0.1410.472X30.0270.0531.527X40.0130.0270.388X50.0350.0702.625X60.140.2943.911X7-0.030-0.0061.926X80.0620.128.133從表3-3可以看出，蔗糖、麥芽糖和乳糖對三萜含量影響較大。其中，麥芽糖，乳糖對三萜含量的影響是正效應，蔗糖對三萜含量的影響是負效應。3.4.Plackett-Burman分析不同碳源對靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響不同碳源對靈芝胞內(nèi)多糖合成的影響見表3-4所示，表3-4胞內(nèi)多糖偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析VariablesRegressioncoefficientE(x1)Contribution(%)SignificanceX10.360.736.672X20.350.711.506X30.611.214.423X40.791.577.391X50.360.721.545X60.180.360.397X70.0930.190.18X80.370.741.664可以看出，葡萄糖和麥芽糖對胞內(nèi)多糖含量影響較大。另外，葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，乳糖對胞內(nèi)多糖含量的影響是正效應。4小結與討論試驗結果表明，不同碳源對靈芝多糖和三萜產(chǎn)量有顯著影響，培養(yǎng)基中加入果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對靈芝胞外多糖的影響最大；蔗糖、果糖，乳糖碳源組合對靈芝胞外多糖的影響最小。培養(yǎng)基中加入果糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對靈芝三萜含量的影響最大；蔗糖、果糖，麥芽糖碳源組合的影響最小。培養(yǎng)基中加入葡萄糖，蔗糖碳源組合對靈芝生物量的影響最大；葡萄糖、蔗糖、乳糖，麥芽糖碳源組合對靈芝生物量的影響最小。培養(yǎng)基中加入蔗糖，麥芽糖碳源組合對靈芝胞內(nèi)多糖的影響最大；葡萄糖，蔗糖碳源組合對靈芝胞內(nèi)多糖的影響最小。曾曉希等[29]的實驗中發(fā)現(xiàn)，不同碳源對靈芝胞外多糖合成含量的影響是葡萄糖＞蔗糖＞乳糖＞麥芽糖＞可溶性淀粉。乳糖:它是由半乳糖和葡萄糖過β-1,4糖苷鍵構成的雙糖[30]。果糖：它是葡葡糖的同分異構體.具左旋性,稱左旋糖[31]。蔗糖與麥芽糖是同分異構體，都是二糖，蔗糖水解成一分子葡萄糖，一分子果糖。麥芽糖水解為二分子葡萄糖。葡萄糖，是一種單糖，一種多羥基醛?？梢园l(fā)現(xiàn)，單糖即是葡萄糖作為唯一碳源時，可以最好的合成靈芝多糖，被菌絲體直接利用，二糖要先水解為單糖后被菌絲體吸收，因而用單糖作碳源，合成的靈芝多糖含量多，生成的靈芝菌絲體生物量多。本實驗結果顯示，混合的碳源所合成的多糖與三萜含量多于單種碳源作為培養(yǎng)基的。本實驗中，乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基，最適于菌絲體的生長。李平作等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在靈芝液體發(fā)酵過程中，可以清晰地觀察到菌體的形狀在前48小時里呈現(xiàn)為絲狀體，兩天后轉(zhuǎn)變成球狀體，第三天起部分絲狀體開始有所變化。菌球的外形體征可分為松散型和緊密型；球狀菌體其數(shù)量和直徑成反比。楊德等[33]在實驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入天然成分，其產(chǎn)生的多糖含量相對多，其中的因果關系可能是蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)存在于天然物質(zhì)中，使得靈芝生長具有豐富的營養(yǎng)；或者,天然成分中的物質(zhì)將大分子物質(zhì)分解后吸收利用，存在的小分子物質(zhì)，類似于多糖片段的，則會造成檢測中測定的多糖含量增高。響應面法，當發(fā)酵時間為42h、發(fā)酵溫度為28.7℃時，在對應條件下所生成的多糖含量最高，當加入葡萄糖和蔗糖作為碳源時產(chǎn)生的生物量最高。實驗中難免會因為操作不當，或在搖瓶發(fā)酵中受到外界細菌的污染，因而在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素，防止污染發(fā)生，這樣實驗才能順利進行。參考文獻[1]戴玉成,曹云,周麗偉,吳聲華.中國靈芝學名之管見[J].菌物學報,2013,(32):947-952.[2]J.Zhang,Y.J.Liu,H-S.AntitumoractivityofsulfatedextracellularpolysaccharidesofGanodermalucidumfromthesubmergedfermentationbroth[J].Carbohydr.Polym,2012(87):1539-1544.[3]E.Furusawa,S.C.Chou.AntitumouractivityofGanodermalucidum,anediblemushroom,onintraperitoneallyimplantedLewislungcarcinomainsynergenicmice[J].Phytother.Res,1992(6):300-304.[4]K.Koyama,T.Imaizum.AntinociceptivecomponentsofGanodermalucidum[J].PlantaMed,1997(63):224-227.[5]S.B.Lin,C.H.Li,S.S.Lee.Triterpene-enrichedextractsfromGanodermaluciduminhibitgrowthofhepatomacellsviasuppressingproteinkinaseC,activatingmitogen-activatedproteinkinasesandG2-phasecellcyclearrest[J].LifeSci,2003(72):381-2390.[6]H.Kohda,W.Tokumoto,K.Sakamoto.ThebiologicallyactiveconstituentsofGanodermalucidum(Fr.)Karst.Histaminerelease-inhibitorytriterpenes[J].Chem.Phar.Bull,1985(33):1367-1374.[7]B.Boh,M.Berovic,J.S.Zhang,Z.B.Lin.Ganodermalucidumanditspharmaceuticallyactivecompound[J].Biotechnol.Annu.Rev,2007(13):265-301.[8]M.Shi,Z.Y.Zhang,Y.N.Yang,AntioxidantandimmunoregulatoryactivityofGanodermalucidumpolysaccharide(GLP),Carbohydr[J].Polym.2013(95):200-206.[9]張瑞婷,周濤,宋瀟瀟,等.靈芝活性成分及其藥理作用的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2018,46(03):18-22.[10]劉松照,王國凱,彭燦,等.靈芝三萜類化學成分研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2017(4):41-46.[11]李廣遠,楊雅麗,王晶,等.靈芝多糖對NB4細胞凋亡及Egr-1表達的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(05):476-479.[12]梁磊,黃清鏵,王慶福,等．響應面優(yōu)化微波一超聲波協(xié)同提取靈芝三萜工藝及其清除自由基活性[J].菌物學報,2017(4):512-521.[13]王昕妍,陳國楊,蘇潔,等.靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長和VEGF表達的比較研究[J].中藥藥理與臨,2017(2):118-122.[14]劉聰,冉春梟,鐘民濤,等.靈芝多糖對3T3-L1胰島素抵抗細胞模型PI一3Kp85和GLUT4蛋白表達的影響[J].中國微生態(tài)學雜志,20